3蛋 白 质

+
HO C C O + 2NH3 + H O O
蓝紫色复合物
氨基酸显色反应
反应基团 α -NH2 试剂 茚三酮 主要产物 紫色、红色物 应用 对氨基酸显色，纸层析实验
α ＝NH2
α -NH2 α -NH2
茚三酮
HNO2 DNFB 二硝基氟苯 Sanger试剂 PITC 苯异硫氰酸 酯 Edman试剂 甲醛 α -萘酚 次溴酸钠 坂口试剂
Pro亚氨基
Met
二硫键
Gly
R基极性大小与分离及反应性等密切相关！！！
按极性分类如下（pH 7.0）
带负电 Asp
β羧基
带正电
酸 性 氨 基 酸
Lysε氨基
Glu
γ羧基
Argδ胍基
His
β咪唑基 碱性最弱
碱 性 氨 基 酸
咪唑基的pK值为6.0，在生理条件下可以电离！！！ 在pH 6.0时，它的咪唑基电离，带50％的正电荷，但 在pH 7.0时咪唑基质子化程度不到10％！！！ 常常参与多种酶的催化作用！！！
Cys 半胱氨酸
Pro 脯氨酸
Tyr 酪氨酸
Gly 苷氨酸
Met 甲硫氨酸（蛋氨酸）
注：人体不能合成的必需氨基酸！较高的营养价值！ 注：人体合成较慢的半必需氨基酸！！！
补充：
肽键与一般的酰胺键一样可以被酸、碱或蛋 白酶催化水解。
酸水解 优点是不容易引起水解产物的消旋化。 缺点是色氨酸被沸酸完全破坏； 含有羟基的氨基酸如丝氨酸或 苏氨酸有一小部分被分解； 天门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的 酰胺基被水解成了羧基。 碱水解 优点是色氨酸在水解中不受破坏。 缺点由于水解过程中许多氨基酸 都受到不同程度的破坏，产率不 高。 部分的水解产物发生消旋化。
AA 可以看成多元酸 ：侧链不解离的中性 AA 可看作二 元酸，酸、碱性AA可以看作三元酸。
2、氨基酸的可解离基团的pK值
从 A+ 出发，用 NaOH 滴定， 滴定到A0=A+时，此时pH＝ pKa ， pH ＝ 羧基的解离常 数 再加OH－，滴定到A0=A－时， pH＝pKa, pH=NH3的解离常 数 氨基酸的每一功能基因可 被酸碱所滴定，可根据氨 基酸的滴定曲线来推算pK 值。
（组氨酸的咪唑基先于α－氨基）
3、氨基酸的等电点 pI
• 当溶液为某一 pH 值时，氨基酸分子中所含 的-NH3+和-COO-数目相等，净电荷为0。这一pH 值即为氨基酸的等电点，简称pI。 在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负 极移动，即氨基酸处于兼性离子状态。
•
pI值相当于AA的两性离子状态两侧的基团pK值之 和的一半。 中性氨基酸：pI = (pK’1 + pK’2 )/2 酸性氨基酸：pI = (pK’1 + pK’R-COO- )/2 碱性氨基酸：pI = (pK’2 + pK’R-NH2 )/2
不溶于或微溶于有 机溶剂。
酸、甜、苦、鲜。 鲜——Arg Ala Gly Ser Asp Glu
甜——Gly Ala Ser Thr Pro Glu Val
5 氨基酸的比旋光度
平均分子量128
6 氨基酸的光吸收性
分子光吸收：
入射光强度 透射光强度
吸光度 （Absorbance)
摩尔消 光系数
吸光物质 的浓度
COOH 酸性 H N+ CH 3 CH2 AA CH2 COOH
K1
COOH3N+ CH K2 CH2 CH2 COOH
兼性离子
COOH3N+ CH CH2 CH2 COO-
K3
COOH2N CH CH2 CH2 COO-
pI=(pK1+pK2)*1/2
COOH 碱性 H3N+ CH (CH2)4 AA NH3+
（三）氨基酸侧链（R基）的性质与分类 酸碱性、极性、结构 按极性分类如下（pH 7.0） 带负电 带正电 不带电极性R基 不带电非极性R基
Asp
Glu
Lys
Arg
Ser羟基Thr羟基
Gln酰氨基Asn酰氨基
Ala疏水性最小Phe苯环
Val Trp吲哚基
His
Cys强
巯基
Tyr强
酚羟基 弱
Ile
Leu
结论： 氨 基 酸 的 酸 碱 性 质
• 在等电点以上的任何pH，氨基酸带 净负电荷，在电场中将向正极移动； • 在低于等电点的任何pH，氨基酸带 净正电荷，在电场中将向负极移动。 • 在一定pH范围内，氨基酸溶液的pH离 等电点愈远，氨基酸所携带的净电荷 愈大。
氨基酸的等电点de测定——等电聚焦电泳
外消旋和内消旋
等量D-和L-的混合物产生外消旋
内消旋胱氨酸
四、氨基酸的理化性质 （一）物理性质
1 白色晶体,晶形各异。
2 熔点高，大于200°C 。 3 氨基酸溶解度 4 氨基酸的味感
重要物理常数之一， 是鉴别各种氨基酸的 重要依据。
均溶于水。胱氨酸
（0.011g/100g水）酪氨酸 （0.045g/100g水） Pro、 Lys、Arg极易溶于水
蛋白质
蛋白质概述
一、“评价”
蛋白质是生命最基本、最重要的物质 蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构 成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质也是细胞内含量最高的组分，约 占干细胞的一半重量。 蛋白质是生命活动的物质基础，它参与 了几乎所有的生命活动过程。
二、化学本质
蛋白质是一类含氮有机化合物。 蛋白质主要元素含量百分比约为： 碳 50％ 蛋白质含量（克%）=每克样品中含氮 氢 7％ 的克数 6.25 氧 23％ 氮 16% 硫 0—3％ 其他 微 量
+
HO O + 2NH3 + H
C O
分配层析法的一般原理
固定相（静相，B相）
——固相、液相或固-液混合相
流动相（动相，A相）——液相或气相 某物质在A相中的总量
有效分配系数 Keff =
某物质在B相中的总量
分离的先决条件：各种成分的分配系数要有差异！！
一、氨基酸的电泳分离
固体支持物： 滤纸
淀粉
三、氨基酸的旋光性和构型
不对称碳原子：指与四个不同的 原子或原子基团以共价键连接并 因而失去对称性的四面体碳，也 称手性碳原子。用 C*表示。
构型：指不对称碳 原子周围的取代 基在空间上的排 布。构型的破坏 涉及到共价键的 断裂，与氢键无 关。
标 准
三、氨基酸的旋光性和构型
旋光异构是由于分子内 具有不对称碳原子（手 性碳原子）而导致的异 构现象。旋光异构体间 至少存在一对不可叠合 的镜像体，一般都具有 旋光性。 旋光性指使平面偏振光 发生旋转的现象。
三、茚三酮法
O
显色 595nm光吸收
O H2O H2O
O
茚三酮
O C C C O
O C C
C C O C
OH OH
C C C O O
C C O
OH 水合茚三酮 OH
还原性茚三酮 C
+ H2N CHCOOH R
O C C
H OH
-
醛
脱氨 脱羧
+ RCHO + NH2 + CO2
O NH4 O C C N C C O O C C + 2H2O
黄色物
N2等 DNP-aa 二硝基苯 黄色物 PTC-aa 在无水的酸中环化 成 PTH-aa 羟甲基-aa和 二羟甲基-aa 桃红色物
Pro的鉴定
游离 aa 定量，蛋白质水解程 度 蛋白质N端测定 一级结构分析 标准图谱 蛋白质N端测定 一级结构分析 aa顺序自动分析仪 标准图谱 甲醛滴定 aa 含量（封闭氨基） 鉴定Arg
综合考虑结构与极性
非极性，脂肪族
综合考虑结构与极性
极性，不带电荷
综合考虑结构与极性
芳香族
综合考虑结构与极性
带正电荷
综合考虑结构与极性
带负电荷
二、非“标准”氨基 酸
鸟氨酸
瓜氨酸
非蛋白质AA
除蛋白质AA外，还有200多种非蛋白质AA， α-，β-，γ-氨基酸，还有D-AA（α-AA） 常参与微生物细胞壁的构成，D-AA也是天然 抗菌肽的组成成分。 β-丙氨酸是偏多酸（维生素）的一个组分 γ-氨基丁酸—神经递质（谷氨酸脱羧形成） D-苯丙氨酸是短杆菌肽S 的结构成分 D-缬氨酸是放线菌素D 的结构成分
K1
COOH3N+ CH (CH2)4 NH3+
K2
COOH2N CH (CH2)4 NH3+
兼性离子
K3
COOH2N CH (CH2)4 NH2
pI=(pK2+pK3)*1/2
2、氨基酸的可解离基团的pK值
从 A+ 出发，用 NaOH 滴定， 滴定到A0=A+时，此时pH＝ pKa ， pH ＝ 羧基的解离常 数 再加OH－，滴定到A0=A－时， pH＝pKa, pH=NH3的解离常 数 氨基酸的每一功能基因可 被酸碱所滴定，可根据氨 基酸的滴定曲线来推算pK 值。
α-氨基酸
注：脯氨酸除外！！！
（二）氨基酸名称的缩写符号 （三字缩写符） Asp 天冬氨酸 Gln 谷氨酰氨 Lys 赖氨酸 Ala 丙氨酸 Ser 丝氨酸 Phe 苯丙氨酸
Glu 谷氨酸
Asn 天冬酰氨
Arg 精氨酸
Val 缬氨酸
Thr 苏氨酸
Trp 色氨酸
His 组氨酸
Ile 异亮氨酸 Leu 亮氨酸
三、基本组成单位
1925年
ຫໍສະໝຸດ Baidu
氨基酸
★20种常见氨基酸的内在性质决定了自然界中成千上万 种蛋白质在结构和功能上惊人的多样性。
氨基酸性质：聚合能力 特有的酸碱性质 侧链的结构及其化学功能的多样性 手性 ★一种蛋白质的氨基酸种类决定了该蛋白质的营养价值。
第一节 氨基酸
一、氨基酸的种类和性质
（一）氨基酸的结构共性
吸光样 品的路 径长度
6 氨基酸的光吸收性
紫外吸收
芳香族侧链有紫外吸收，所以280nm处吸收的测定， 是定量蛋白质浓度最常用的方法。
• 在近紫外区(220-300nm) 只有Phe、Tyr和Trp有 吸收光的能力。
• 酪氨酸的max＝278nm • 苯丙氨酸的max＝259nm • 色氨酸的max＝279nm
（二）化学性质
A.氨基酸的酸碱性质 三个重要概念：
* 兼性离子 * 氨基酸的可解离基团的pK值 * 氨基酸的等电点 pI
氨基 酸的性质 是鉴定、 分离与分 析的基础， 也是蛋白 质研究及 分离分析 的 基 础 ！！！
1、兼性离子
正负电荷数相等即净 电荷为零的兼性离子 状态 ！！
1、兼性离子
在不同的 pH 条件下，兼性离子的状态也随之 发生变化。
α -NH2
α -NH2 Arg 的 胍 基
100%Glu2-(-2) 100%Glu¯ (-1) 50%Glu2¯ 50%Glu ¯ (-3/2) 100%Glu± (0) PI=3.22 50%Glu50%Glu ± (-1/2) 50%Glu±
100%Glu+(+1)
50%Glu+ (+1/2)
Glu滴定曲线（解离曲线）
* 可解离基团的解离顺序 对于多个解离基团的氨基酸来说： 羧基先于氨基解离； α－羧基最先解离； α－氨基先于其它氨基解离。
COOH H3N
+
C H R
-H pK1 ' +H
+
+
COO H3N
+
-
C H R
-H pK2 ' +H
+
+
COO R
-
H2N C H
PH
1
7 0 兼性离子
10 -1 负离子
净电荷 +1 正离子
根据Handson－Hasselbanch公式
A- + H+ [A-] pH=pKa+log [HA] HA
磺酸基 离子交换树脂 阳 离 子 交 换 树 脂 羧基
阴 离 子 交 换 树 脂
阳离子交换树脂常 用于分离氨基酸
＋ pH＝3
酸性氨基酸
碱性氨基酸
酸性氨基酸
碱性氨基酸
氨基酸自动分析仪测定
在一定pH（大多数AA带正电）下，混合AA上柱，然后 洗脱。洗脱顺序酸性→中→碱，在带电荷相同情况下， 极性大的AA先洗下来。
手性分子
旋光度指使平面偏振光发生旋转的度数，向左记为 “－”，向右记为“＋”。可通过旋光仪测定。
构型与旋光方向 没有必然的规律
透视式
立体模型
透视式
1906年规定：D(+)-甘油醛， L(－)-甘油醛 由于X射线衍射技术的发展，证实人为规定的甘油 醛的构型与真实的构型一致。 20种常见组成蛋白质的氨基酸均为L-型AA。
醋酸纤维素
琼脂糖
聚丙烯酰胺
一、氨基酸的电泳分离
①
COOH H3N
+
原理？
-
C H R
-H pK1 ' +H
+
+
COO H3N
+
-
C H R
-H pK2 ' +H
+
+
COO R
H2N C H
PH 1 净电荷 +1 正离子
7 0 兼性离子
10 -1 负离子
②
电泳迁移率
μ∝q∕r
q＝pI－pH
二、离子交换层析
第二节 氨基酸分离和分析
电泳
离子交换
O
O
O
茚三酮
O C C C O
O C C C O
C C C O
OH OH + H2N
H2O H2O
C C C O O
C C C O
OH OH
水合茚三酮
CHCOOH R
O
H OH
-
+ RCHO + NH2 + CO 2
O NH4 O C C C C C O O N C C C + 2H2O