肝细胞癌组织中SKP2的表达及与P27KIP1、PCNA蛋白表达的关系

作者：程阳，王酉，陈莉，陆牡丹，秦军，崔小鹏，李鹏，刘胜利
【摘要】目的：探讨skp2的表达在肝细胞癌(hcc)发生发展中的作用，及其与p27kip1(p27)和pcna的关系。

方法：收集76例hcc及癌旁组织，l0例肝血管瘤旁肝组织的临床病理档案资料，l0例hcc及癌旁肝新鲜组织，采用免疫组织化学方法及免疫印迹技术检测skp2、p27及pcna蛋白在这些组织中的表达。

结果：免疫印迹结果显示：skp2在hcc 组织中的表达明显高于对应的癌旁肝组织。

免疫组织化学结果显示hcc中skp2的阳性率（24.08％）显著高于癌旁组织和正常肝组织（p<0.001）。

skp2的表达与肝癌组织分化程度，血清afp值及转移有关（p<0.05）。

p27在正常肝组织和癌旁组织中的表达明显高于hcc组织(p<0.001)。

hcc组织中pcna蛋白的表达明显高于癌旁和正常组织（p<0.01）。

hcc组织中skp2的表达与p27呈负相关(p<0.001)；与pcna呈正相关(p<0.01)。

结论：skp2在hcc组织中表达是上调的，可能是通过作用于细胞周期调控蛋白p27，加速了对p27泛素化依赖的蛋白降解，使其表达及代谢发生异常。

导致细胞周期失控并促进细胞异常增殖，从而参与了hcc的发生和发展。

【关键词】肝细胞癌；免疫印迹法；免疫组织化学；增殖细胞核抗原；skp2；p2
肿瘤既是一类基因疾病，也是一类细胞周期疾病。

几乎所有癌基因的功能效应最终都要汇聚到细胞周期机制上来。

细胞s期激酶相关蛋白-2(s-phase kinase- associated protein 2，skp2)是scf泛素连接酶复合体的特异底物识别亚单位f-box蛋白家族的成员之一，能特异性地作用于磷酸化细胞周期负性调控因子p27，使其通过泛素-蛋白酶体途径降解，导致细胞周期调节失控。

近年来研究发现，skp2在多种肿瘤组织中表达均增高，而p27表达减少,从而推断skp2表达及功能的异常有可能经由细胞周期相关蛋白的泛素化依赖的蛋白水解途径，参与了肿瘤的发生发展[1~4]。

肝癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，其中约55％发生在中国 [5]，但有关skp2及p27和pcna在肝癌组织中，尤其是新鲜组织中的表达以及与肝癌生物学特征的相关性研究较少。

我们用免疫印迹和免疫组化方法检测hcc组织中skp2、 p27和pcna三种蛋白的表达，旨在探讨三者的相关性及与临床病理特征的联系。

1 材料与方法
1.2 主要试剂兔抗人p27kip1多克隆抗体p27：sc-528，兔抗人skp2p45：sc-7164（santacruz 公司）。

鼠抗人p27kip1单抗（neomarkers公司）。

鼠抗人pcna单抗、柠檬酸抗原修复液及dab显色剂（北京中山生物技术有限公司）。

鼠抗人skp2（zymed公司），hrp标记的山羊抗小鼠igg、hrp标记的山羊抗兔igg、β-actin单抗（sigma公司）。

二步法免疫组化检测试剂盒（gbi公司）。

1.3 方法
1.3.1 蛋白质免疫印迹检测选择其中6对hcc组织及癌旁组织，匀浆提取组织蛋白。

全自动蛋白质核酸定量仪测定蛋白含量，10%sds-page凝胶电泳分离蛋白，蛋白上样量40μg，转移槽转移到pvdf膜。

室温封闭2h。

一抗[p27kip1(c-19) 1∶500, skp2(h-435) 1∶500，pcna 1∶1000, β-actin 1∶3000]4℃过液，hrp偶联的二抗(1∶1000)室温2h，ecl显色。

1.3.2 免疫组化染色和判定标准操作步骤按免疫组化试剂盒说明进行。

用已知的乳腺癌阳性片作为阳性对照，pbs代替一抗作为阴性对照。

dab显色，苏木素复染，明胶甘油封片。

光镜下每张切片选取5个有代表性的高倍视野（400×），每个视野随机计数500个肿瘤细胞，计算阳性细胞百分率。

每个指标的染色结果以其标记指数(label index，li)表示，li＝阳性细胞数/细胞计数的总数。

1.3.3 统计学方法显著性差异采用秩变换检验、方差分析，相关性分析采用χ2检验、fisher精确概率法及spearman等级相关分析，全部数据采用stata 7.0统计分析系统，p<
0.05有统计学意义。

2 结果
2.2 免疫组化检测skp2、p27及pcna在肝癌及癌旁和血管瘤旁肝组织中的表达免疫组化结果显示：skp2，pcna在hcc中高表达，主要表达在细胞核。

hcc中skp2 li为24.07％，pcna li为42.31％；癌旁组织和肝血管瘤旁正常肝组织中skp2 li分别2.87％和1.81％，pcna li 为
3.11％和2.01％。

p27的表达与skp2和pcna相反，主要在癌旁组织和正常肝组织中高表达，主要表达在胞核；其中有6例p27在hcc中高表达，且胞浆和胞核都有表达。

hcc、癌旁和肝血管瘤旁正常肝组织中p27 li分别为26.50％、76.20％和73.58％(（图2, 表1）。

skp2、
p27、pcna在hcc中的表达与癌旁组织和血管瘤旁肝组织相比有显著的统计学意义（p<0.01）（表1）。

2.3 skp2、p27及pcna蛋白的表达与hcc临床病理特征的关系以skp2、p27及pcna在hcc 中li的平均值（分别为0.24，0.26，0.42）为界，将其分为高表达组和低表达组，分析skp2、
p27及pcna的表达与临床病理特征之间的关系。

skp2的表达强度与患者血清afp水平、肿瘤病理分级以及转移相关，p值分别为0.026，0.029，0.002，与患者的性别、年龄、肿瘤直径、血清hbsag及是否伴有坏死和肝硬化无关。

p27与pcna在hcc中的表达均与afp水平、肿瘤病理分级、转移和坏死有关，p值分别为0.029， 0.000，0.001，0.003和0.016，0.001，0.001，0.005，与其它病理学特征无关（表2）。

2.4 p27、skp2及pcna表达的相关性通过对hcc中skp2、pcna和p27蛋白表达的相关性分析，我们发现skp2蛋白与p27蛋白的表达呈明显负相关(r=-0.618，p<0.01)，skp2蛋白和pcna蛋白的表达呈正相关(r=0．619，p<0．01)。