种子的扩大培养
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《种子的扩大培养》课件
2 控制温度和湿度
合理控制培养基的温度和湿பைடு நூலகம்，营造适合种子生长的环境。
3 隔离防止杂交
避免不同品种的种子杂交，保持纯度和一致性。
应用案例分析
用于种子的改良
通过种子扩大培养，可以改 良特定品种的性状，提高农 作物的产量和抗性。
种子的商业化应用
大规模扩大培养优质种子， 满足市场需求，为农业产业 发展提供支持。
《种子的扩大培养》PPT 课件
种子是农业中至关重要的一环，种子的扩大培养对于提高农产品产量和品质 至关重要。本课件将介绍种子扩大培养的原理、步骤以及应用案例分析。
简介
种子的重要性
种子是农作物繁殖和传播的基础，直接影响 着农产品的产量和质量。
培养种子的意义
种子的扩大培养能够大规模繁殖优质种子， 提高农产品的产量和品质。
种子的控制与管理
通过种子扩大培养，可以对 种子的产量、质量和流通进 行有效的控制和管理。
总结
1 种子扩大培养是一
项重要的农业技术
能够有效提高农产品的 产量和品质，为农业发 展做出贡献。
2 种子扩大培养会带
来很多经济收益和 社会意义
有助于推动农业产业的 发展，提高农民收入， 促进乡村振兴。
3 种子扩大培养的应
种子扩大培养的原理
繁殖方式
种子的扩大培养可以通过无性繁殖或有性繁殖来实现。
突变次数和突变频率
种子扩大培养中的突变次数和突变频率决定了新品种的数量和多样性。
种子的选择
选择适合扩大培养的种子，包括外观、遗传特性和生长性状等。
种子扩大培养的步骤
1
种子消毒
使用适当的消毒方法对种子进行处理，杀灭病原体和杂质。
2
培养基制备
合理控制培养基的温度和湿பைடு நூலகம்，营造适合种子生长的环境。
3 隔离防止杂交
避免不同品种的种子杂交，保持纯度和一致性。
应用案例分析
用于种子的改良
通过种子扩大培养，可以改 良特定品种的性状，提高农 作物的产量和抗性。
种子的商业化应用
大规模扩大培养优质种子， 满足市场需求，为农业产业 发展提供支持。
《种子的扩大培养》PPT 课件
种子是农业中至关重要的一环，种子的扩大培养对于提高农产品产量和品质 至关重要。本课件将介绍种子扩大培养的原理、步骤以及应用案例分析。
简介
种子的重要性
种子是农作物繁殖和传播的基础，直接影响 着农产品的产量和质量。
培养种子的意义
种子的扩大培养能够大规模繁殖优质种子， 提高农产品的产量和品质。
种子的控制与管理
通过种子扩大培养，可以对 种子的产量、质量和流通进 行有效的控制和管理。
总结
1 种子扩大培养是一
项重要的农业技术
能够有效提高农产品的 产量和品质，为农业发 展做出贡献。
2 种子扩大培养会带
来很多经济收益和 社会意义
有助于推动农业产业的 发展，提高农民收入， 促进乡村振兴。
3 种子扩大培养的应
种子扩大培养的原理
繁殖方式
种子的扩大培养可以通过无性繁殖或有性繁殖来实现。
突变次数和突变频率
种子扩大培养中的突变次数和突变频率决定了新品种的数量和多样性。
种子的选择
选择适合扩大培养的种子，包括外观、遗传特性和生长性状等。
种子扩大培养的步骤
1
种子消毒
使用适当的消毒方法对种子进行处理，杀灭病原体和杂质。
2
培养基制备
简述种子扩大培养的一般步骤
简述种子扩大培养的一般步骤
种子扩大培养是一种常用的微生物培养方法，用于从初始培养物中扩大微生物数量，以便进行后续实验或工业应用。
一般而言，种子扩大培养的步骤包括以下几个方面：
1. 培养基准备，选择适当的培养基，根据目标微生物的需求添加合适的营养物质和pH调节剂。
培养基的配制需要严格按照配方和操作规程进行，以确保培养基的质量和一致性。
2. 种子接种，从初始培养物中选择合适的菌株或菌落，通过无菌技术将种子接种到含有适当培养基的培养容器中。
接种时需要注意保持无菌操作，避免外界的污染。
3. 培养条件调控，根据目标微生物的生长特性和要求，调节培养条件，包括温度、pH值、氧气供应和搅拌速度等。
这些条件的调节可以促进微生物的生长和代谢活性，从而实现种子的扩大。
4. 培养过程监测，在培养过程中，需要定期监测微生物的生长情况，可以通过测量生物量、菌落形态观察、代谢产物测定等方法进行。
监测结果可以帮助调整培养条件，以达到最佳的生长效果。
5. 收获和处理，当微生物达到预定的生长状态时，可以进行收获。
收获方法根据具体情况而定，可以选择简单的离心沉淀、滤液
或离子交换等方法。
收获后的种子可以进行后续的实验或工业应用。
6. 清洁和消毒，在种子扩大培养结束后，要进行培养容器和设
备的清洁和消毒工作，以防止微生物的交叉污染和感染。
总结起来，种子扩大培养的一般步骤包括培养基准备、种子接种、培养条件调控、培养过程监测、收获和处理，以及清洁和消毒。
这些步骤的严格执行可以确保种子扩大培养的成功，并提供足够的
微生物种子用于后续实验或工业应用。
6 种子的扩大培养【发酵工程】
不产孢子的镰刀赤霉菌，也可以用大米固体培养基置于 茄子瓶中培养菌丝体用作种子罐种子
C、产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种：
可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡 培养，获得菌丝体，作为种子。
例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。
D、不产孢子的细菌： 生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。 斜面菌种于32C，培养18—24小时，即可移入250 mL
6 种子扩大培养
种子扩大培养概念：
指将保存在砂土管、冷凉干燥管中处休眠状态的生 产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子 耀逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种过程。
目前发酵灌容积已达几十或几百立方米。如按10 ％的种子计算，就要投入几或几十立方米的种子，要 从试管中的菌种逐级扩大为生产用种子，是一个由实 验室制备到车间生产的过程。其生产方法与条件随不 同的生产品种和菌种种类而异。
MYPG培养基：3克麦芽浸出物，3克酵母浸出物，5克 蛋白胨、10克葡萄糖和20克琼脂于l升水中。
二、生产车间种子制备
种子罐培养原则： 采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐
等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体 在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。
接种方法：
孢子悬浮液：一般采用微孔接种法。 摇瓶菌丝体种子：可在火焰保护下接入种子罐或采用压 差法接入。 种子罐之间或发酵罐间的移种：主要采用压差法，由种 子接种管道进行移种，移种过程中要防止接受罐表压降 至零，否则会引起染菌。
1、生长快的细菌，种子用量少，种子罐相应也少。
例如：谷氨酸生产中，茄子瓶种子接入种子罐子 32C培养7一10小时，即可按入发酵罐作为种子，这称为 一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。
2、生长较慢的菌种，种子用量大，种子罐相应也多。
C、产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种：
可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡 培养，获得菌丝体，作为种子。
例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。
D、不产孢子的细菌： 生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。 斜面菌种于32C，培养18—24小时，即可移入250 mL
6 种子扩大培养
种子扩大培养概念：
指将保存在砂土管、冷凉干燥管中处休眠状态的生 产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子 耀逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种过程。
目前发酵灌容积已达几十或几百立方米。如按10 ％的种子计算，就要投入几或几十立方米的种子，要 从试管中的菌种逐级扩大为生产用种子，是一个由实 验室制备到车间生产的过程。其生产方法与条件随不 同的生产品种和菌种种类而异。
MYPG培养基：3克麦芽浸出物，3克酵母浸出物，5克 蛋白胨、10克葡萄糖和20克琼脂于l升水中。
二、生产车间种子制备
种子罐培养原则： 采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐
等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体 在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。
接种方法：
孢子悬浮液：一般采用微孔接种法。 摇瓶菌丝体种子：可在火焰保护下接入种子罐或采用压 差法接入。 种子罐之间或发酵罐间的移种：主要采用压差法，由种 子接种管道进行移种，移种过程中要防止接受罐表压降 至零，否则会引起染菌。
1、生长快的细菌，种子用量少，种子罐相应也少。
例如：谷氨酸生产中，茄子瓶种子接入种子罐子 32C培养7一10小时，即可按入发酵罐作为种子，这称为 一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。
2、生长较慢的菌种，种子用量大，种子罐相应也多。
种子的扩大培养名词解释
种子的扩大培养名词解释
农业和科学是紧密联系在一起的，从古至今，改良农作物也一直是提高作物品质和效率的重要方式之一。
改良农作物一般涉及品种改良、育种和种子改良等，其中种子改良是改良农作物的重要方式之一，其中包括种子的扩大培养。
扩大培养，是指将植物原色质组织发育至比原色质组织更大的程度，而发育度由细胞膜和细胞壁及细胞固有的特性决定。
扩大培养的目的是为了将植物的细胞增大，形成更大的种子以提高其生物产量和生物效率。
扩大培养的基本原理是营养物质通过细胞膜被吸收，吸收的营养物质再经过细胞板进行变化，以满足细胞的营养和活动需求。
细胞生长过程中，细胞膜和细胞壁发生变化，使细胞产生更多的蛋白质，细胞分裂更多次，以达到膨大的目的。
扩大培养具有很多优势，它可以有效地提高植物的生长速度，从而改善作物质量；它可以增加植物的适应能力，降低对环境的敏感性；它还可以降低由病原菌引起的病害，抵抗病虫害，提高植物的抗逆性。
扩大培养的实践也要依据植物的特性而定，比如植物体内的营养物质储备差别，植物体内的养分分配，植物发育程度等。
通常在实验中，需要对外部环境因素进行控制，如光照、温度和湿度，确保植物生长条件良好，才能获得理想的种子扩大培养结果。
总之，种子的扩大培养作为改良农作物的重要方式，可以有效地改善作物质量，增加由病原菌引起的病害，抵抗病虫害，提高植物的
抗逆性。
但是，为了获得理想的种子扩大培养结果，需要对外部环境因素进行控制，以确保植物生长条件良好。
种子扩大培养 认识种子扩大培养
4 种子扩大培养
4.1 种子扩大培养的目的及要求
种子扩大培养的目的及要求
概述 种子扩大培养：又称种子制备工序，是指将保存在沙土管、冷冻干燥管
中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种 子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。 这些纯种培养物称为种子。
种子扩大培养的目的及要求
种子扩大培养的目的及要求
种子必须满足以下条件：
条件一
菌种细胞的生长活 力强，移种至发酵罐后能 迅速生长，缩短迟缓期
条件二
生理状态稳定，以便 获得稳定的菌体生长过程
五个
条件五
无杂菌污染，以保证 整个发酵过程正常进行 Nhomakorabea条件
稳定的生产能力
条件四
保持稳定的生产能力，使最终产
物的生物合成量持续稳定高产
条件三
菌体总量及浓度
种子扩大培养的意义 ① 为发酵生产提供充足的代谢旺盛、生命力强的种子 ② 有效地缩短发酵生产周期
种子扩大培养的目的及要求
目前工业规模的发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。如按百分之十左 右的种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子。因此，种子扩大培 养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的 种子。这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。
适宜，可以保证在大发 酵罐中有适当的接种量
4.1 种子扩大培养的目的及要求
种子扩大培养的目的及要求
概述 种子扩大培养：又称种子制备工序，是指将保存在沙土管、冷冻干燥管
中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种 子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。 这些纯种培养物称为种子。
种子扩大培养的目的及要求
种子扩大培养的目的及要求
种子必须满足以下条件：
条件一
菌种细胞的生长活 力强，移种至发酵罐后能 迅速生长，缩短迟缓期
条件二
生理状态稳定，以便 获得稳定的菌体生长过程
五个
条件五
无杂菌污染，以保证 整个发酵过程正常进行 Nhomakorabea条件
稳定的生产能力
条件四
保持稳定的生产能力，使最终产
物的生物合成量持续稳定高产
条件三
菌体总量及浓度
种子扩大培养的意义 ① 为发酵生产提供充足的代谢旺盛、生命力强的种子 ② 有效地缩短发酵生产周期
种子扩大培养的目的及要求
目前工业规模的发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。如按百分之十左 右的种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子。因此，种子扩大培 养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的 种子。这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。
适宜，可以保证在大发 酵罐中有适当的接种量
发酵工程第一章 种子扩大培养
含量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+ 能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少 也会影响孢子的质量）。
培养温度
❖ 温度过低，菌种生长发育缓慢 ❖ 温度过高会使菌丝过早自溶
在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时， 孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨
基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。
❖ 但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的 种子以满足发酵的需求
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时， 工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂 或菌丝快速生长。
种子培养基特点
❖ 有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足 氮源和生长因子，无机氮源比例大； ➢ 各种营养物质的浓度不必太高； ➢ 供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利 用的碳源和氮源；
➢ 应考虑与发酵培养基的主要成分相近。
pH
❖ 选择最适种子培养pH的原则是获得 最大比生长速率和适当的菌量
❖ 丝状微生物不宜剧烈搅拌。
斜面冷藏时间
❖ 对孢子的生产能力有较大影响 ❖ 冷藏时间越长，生产能力下降越多
链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两 个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％， 比冷藏3个月的降低35％。
培养基
❖ 培养种子的目的：
➢ 扩大培养，增加细胞数量； ➢ 同时也必须培养出强壮、健康、活性
种子质量的判断方法
❖ 通常检测的培养液中参数 ➢ pH是否在种子要求的范围之内 ➢ 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 ➢ 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 ➢ 有无杂菌污染
培养温度
❖ 温度过低，菌种生长发育缓慢 ❖ 温度过高会使菌丝过早自溶
在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时， 孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨
基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。
❖ 但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的 种子以满足发酵的需求
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时， 工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂 或菌丝快速生长。
种子培养基特点
❖ 有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足 氮源和生长因子，无机氮源比例大； ➢ 各种营养物质的浓度不必太高； ➢ 供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利 用的碳源和氮源；
➢ 应考虑与发酵培养基的主要成分相近。
pH
❖ 选择最适种子培养pH的原则是获得 最大比生长速率和适当的菌量
❖ 丝状微生物不宜剧烈搅拌。
斜面冷藏时间
❖ 对孢子的生产能力有较大影响 ❖ 冷藏时间越长，生产能力下降越多
链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两 个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％， 比冷藏3个月的降低35％。
培养基
❖ 培养种子的目的：
➢ 扩大培养，增加细胞数量； ➢ 同时也必须培养出强壮、健康、活性
种子质量的判断方法
❖ 通常检测的培养液中参数 ➢ pH是否在种子要求的范围之内 ➢ 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 ➢ 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 ➢ 有无杂菌污染
4第四章-种子的扩大培养
适合于工业化发酵生产的种子必须满足以下条件：
① 生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延 滞期短；
② 菌体的生理特性及生产能力稳定；
③ 菌体总量及浓度能满足发酵罐接种量的要求；
④无杂菌污染。
生产种子的制备与培养条件因生产品种和菌种不 同而异。eg:细菌、酵母菌、放线菌和霉菌，它们 的生长速度、产孢子能力、营养要求、培养温度、 需氧量等方面各不相同，因此应根据菌种的生理 特征选择合适的培养条件。
{3} 霉菌类 (☆☆☆重点此处课本讲的较为 粗略，补充章节加以详细说明，可选。）
母斜面上的菌落要分散，以便于挑选理想 的菌落。挑单菌落种子斜面时，要挑取菌 落中央部位的孢子。斜面制备大米孢子时， 孢子悬液的浓度要适当，接种完毕后，把 大米等固体培养基与孢子悬液混合均匀， 待孢子生长成熟后，在真空下将水分含量 抽至10%下，密封后置于4℃冰箱中 备用。
{2} 放线菌类 灭菌后的琼脂培养基在放凉且未凝固时摆成斜面，
如有不溶解的原材料，应轻轻摇匀，但不要产生 气泡。待斜面凝固后置于28~37℃培养2~3d，经 检查无杂菌和无冷凝水后备用。根据放线菌种类 的不同，取适量沙土管菌种或母斜面上的菌落 划线接种 到琼脂斜面培养基上，调整到合适的 温度，经过5~7d培养，待孢子成熟后方可使用。 注意点：第一次从沙土管或者冻干管中接出的菌 种往往生长缓慢，菌落稀少。这是因为菌种长期 在低温下保存，尚未完全从休眠中恢复，同时有 一些菌种死亡所致，可选用第一次长好的斜面上 （成为子斜面），经过培养后，斜面上的菌落数 量多，孢子丰满，孢母的扩大培养
第四节 液体种子制备
定义：液体种子的制备是将固体培养基上 培养好的孢子或菌体转入到液体培养基中 培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。
注意：种子制备所使用的培养基和工艺条 件，要有利于孢子发芽和菌丝的繁殖。
① 生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延 滞期短；
② 菌体的生理特性及生产能力稳定；
③ 菌体总量及浓度能满足发酵罐接种量的要求；
④无杂菌污染。
生产种子的制备与培养条件因生产品种和菌种不 同而异。eg:细菌、酵母菌、放线菌和霉菌，它们 的生长速度、产孢子能力、营养要求、培养温度、 需氧量等方面各不相同，因此应根据菌种的生理 特征选择合适的培养条件。
{3} 霉菌类 (☆☆☆重点此处课本讲的较为 粗略，补充章节加以详细说明，可选。）
母斜面上的菌落要分散，以便于挑选理想 的菌落。挑单菌落种子斜面时，要挑取菌 落中央部位的孢子。斜面制备大米孢子时， 孢子悬液的浓度要适当，接种完毕后，把 大米等固体培养基与孢子悬液混合均匀， 待孢子生长成熟后，在真空下将水分含量 抽至10%下，密封后置于4℃冰箱中 备用。
{2} 放线菌类 灭菌后的琼脂培养基在放凉且未凝固时摆成斜面，
如有不溶解的原材料，应轻轻摇匀，但不要产生 气泡。待斜面凝固后置于28~37℃培养2~3d，经 检查无杂菌和无冷凝水后备用。根据放线菌种类 的不同，取适量沙土管菌种或母斜面上的菌落 划线接种 到琼脂斜面培养基上，调整到合适的 温度，经过5~7d培养，待孢子成熟后方可使用。 注意点：第一次从沙土管或者冻干管中接出的菌 种往往生长缓慢，菌落稀少。这是因为菌种长期 在低温下保存，尚未完全从休眠中恢复，同时有 一些菌种死亡所致，可选用第一次长好的斜面上 （成为子斜面），经过培养后，斜面上的菌落数 量多，孢子丰满，孢母的扩大培养
第四节 液体种子制备
定义：液体种子的制备是将固体培养基上 培养好的孢子或菌体转入到液体培养基中 培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。
注意：种子制备所使用的培养基和工艺条 件，要有利于孢子发芽和菌丝的繁殖。
种子的扩大培养
种子异常分析
1、菌种生长速度过慢 2、菌丝结团 3、菌丝粘壁
第三节
种子制备过程的技术概要
种子制备的过程大致可分为：
实验室种子制备阶段
生产车间种子制备阶段
一、实验室种子的制备
实验室种子的制备一般采用两种方式
对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁
殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子， 孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作 简便，不易污染杂菌。 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种， 可以用液体培养法。
搅拌转速340r／min； 250L种子罐1:0.3
搅拌转速300r／ min
500L种子罐1:0.25 搅拌转速230r／ min
(3)二级种子的质量要求 种龄 7~8h pH 7.2左右 OD值 净增0.5左右 无菌检查 (-) 噬菌体检查(-)
二、啤酒酵母的扩大培养
一般可采用三级扩大培养，扩大倍数：第1级 到第2级为8-10倍，第2级到第3级为4-6倍。 1，实验室扩大培养
(2) 培养条件 用1000mL三角瓶装入培养基 200mI，灭菌后置于冲程7．6cm、频率96次 ／min的往复式摇床上振荡培养12h，培养温 度33~34℃ (3) 一级种子质量要求 种龄：12h pH值：6.4± 0.1 光密度：净增OD值0.5以上 残糖：0.5％以下 无菌检查：(-) 噬菌体检查： (-) 镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐 革兰氏阳性反应。
水质的影响：地区不同、季节变化 和水源污染，均可造成水质波动， 影响种子质量。 菌种在固体培养基上可呈现多种不 同代谢类型的菌落，氮源品种越多， 出现的菌落类型也越多，不利于生 产的稳定。
措施
培养基所用原料要经过发酵试验合格才可
种子的扩大培养
☆（2）接种量的确定 ◆与该菌在发酵罐中生长繁殖的速度、种子质量和发酵条件 等有关。 a.接种量过多，菌丝生长过快、过稠，培养液粘度增加， 营养基质缺乏或溶解氧不足，影响产物的合成。 b.接种量过小，引起发酵前期菌体生长缓慢，使发酵周期 延长，菌丝量少，还可能产生菌丝团，导致发酵异常。
生产上多以大接种量和丰富培养基作为高产措施
（2）注射接种 用于种子罐接种，在罐顶接种管口压 盖一层橡胶膜，将注射器针嘴插入橡胶膜进行接种。
（3）摇瓶直接进罐法 适合种子罐接种，一般需三人 配合操作。
二、注意事项
（1）按照无菌操作
（2）消毒灭菌一定要彻底、干净
（3）在接种操作中，一定要严格按照无菌操作进行，规范生 产操作，严禁误操作带来的杂菌污染，经常提醒，建立严格 的无菌概念，避免出现二次污染。
如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更 多的菌丝——二级种子；将二级种子转入发酵罐内发酵，称为 三级发酵。
使用三级种子的发酵，称为四级发酵。
◆接种 将孢子或菌落，或试管、三角瓶或种子罐中 菌体接入培养容器的操作过程。
◆接种量 移种的种子液体积和培养液体积之比。
◆接种龄 种子罐中培养的菌体开始移种到下一级种 子罐或发酵罐的培养时间。
1．实验室种子制备 （1）斜面种子培养 活化菌种，同时也培养一定数量的斜面 种子。 （2）液体培养 包括液体试管和三角瓶摇床震荡或回旋式培 养。
①液体试管培养 无菌条件下，用接种针自斜面试管挑取 一环斜面种子菌体，接入装有液体培养液的试管，摇匀后，置 培养箱培养，待培养成熟后，再接入三角瓶培养。
②三角瓶液体培养（摇瓶种子）
（4）生产中使用的斜面菌种不宜多次移接，一般只移接三次 (三代)，以免由于菌种的自然变异引起菌种不纯。因此，要 经常进行菌种的分离纯化，不断提供新的斜面菌株供生产使 用。
6.种子的扩大培养
生产车间种子制备阶段：
种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理， 因此形象地称这些培养过程为生产车间种子制备阶段。
二、实验室阶段 1、培养物选择的原则 目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终 的培养物可分为两类： 对于不产孢子和芽胞的微生物 ——获得一定数量和室阶段的种子 扩大培养最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸 的种子培养。
生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材 料质量波动。 原材料质量的波动，起主要作用的是其中无机离子含量不同，如 微量元素Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或 太少也会影响孢子的质量。 以培养菌体为目的，种子罐与发酵罐培养基成分一致较好。 主要是碳源、氮源、无机盐、生长素和水等。 选用原则：组分简单，来源丰富，价格便宜，取材方便等。
不同接种量影响菌体的生长和发酵
发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高, 发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率.
20%种子罐＋10%发酵罐前期发酵液效果最好
本章小节：
了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念
理解种子扩培的目的和要求
掌握控制种子质量的基本方法和手段
在原料方面： 不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发 酵培养 基，这有两个方面的原因: 一是成本 二是驯化
例：柠檬酸发酵
以蔗糖为原料
成分 麦芽汁 蔗糖 NH4NO3 K2HPO4 MgSO4.H2O KCl 琼脂
斜面 麦汁
种子罐
发酵
2.5-5% 0.225% 0.03% 0.025%
20% 0.11% 0.025% 0.015%
8.生产发酵罐的无菌接种
生产规模发酵罐的接种，包括两个方面： –从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一个种子罐. –从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。
种子的扩大培养
3. 液体深层培养
液体深层种子罐从底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成 微小气泡以促进氧的溶解。该法容易按照生产菌种对于代谢 的营养要求一级不同生理时期的通气、搅拌、温度与培养基 中氢离子等条件，选择最佳培养条件。
四、种子质量的控制
（二）影响种子质量的因素及控制
培养基
（1）营养成•分种适龄合：种是子指培种养子的罐需中要培养的菌丝体开始移入
种子培养要求一定量的种子，在适宜的培养基中，控制一定的培养条 件和培养方法，从而保证种子正常生长。
工业微生物培养法分为静置培养和通气培养两大类型。
❖静置培养即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培养。 ❖通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给 空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称好气培养法。
（1）放线菌孢子的制备
a) 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含 有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白 胨和一些无机盐等。
b) 碳源和氮源不要太丰富（碳源约为1％，氮源不超过0.5 ％），干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。
c) 放线菌斜面的培养温度大多数为28℃，少数为37℃，培 养时间为5～14天。
菌种细胞的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生 长，延滞期短。
菌种生理状态稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率和 种子培养液的特性等符合要求。
菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求。 无杂菌污染，保证纯种发酵。 菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。
二、种子制备的过程
从工业发酵的角度来说，种子制备分成两个 阶段：
摇瓶培养基配方和培养条件与种子罐相似。
常采用母瓶、子瓶两级培养。种子培养基要求比 较丰富和完全，易被菌体分解利用，氮源丰富有 利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓， 子瓶培养基浓度比母瓶略高，更接近于种子罐的 培养基配方。
液体深层种子罐从底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成 微小气泡以促进氧的溶解。该法容易按照生产菌种对于代谢 的营养要求一级不同生理时期的通气、搅拌、温度与培养基 中氢离子等条件，选择最佳培养条件。
四、种子质量的控制
（二）影响种子质量的因素及控制
培养基
（1）营养成•分种适龄合：种是子指培种养子的罐需中要培养的菌丝体开始移入
种子培养要求一定量的种子，在适宜的培养基中，控制一定的培养条 件和培养方法，从而保证种子正常生长。
工业微生物培养法分为静置培养和通气培养两大类型。
❖静置培养即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培养。 ❖通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给 空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称好气培养法。
（1）放线菌孢子的制备
a) 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含 有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白 胨和一些无机盐等。
b) 碳源和氮源不要太丰富（碳源约为1％，氮源不超过0.5 ％），干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。
c) 放线菌斜面的培养温度大多数为28℃，少数为37℃，培 养时间为5～14天。
菌种细胞的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生 长，延滞期短。
菌种生理状态稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率和 种子培养液的特性等符合要求。
菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求。 无杂菌污染，保证纯种发酵。 菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。
二、种子制备的过程
从工业发酵的角度来说，种子制备分成两个 阶段：
摇瓶培养基配方和培养条件与种子罐相似。
常采用母瓶、子瓶两级培养。种子培养基要求比 较丰富和完全，易被菌体分解利用，氮源丰富有 利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓， 子瓶培养基浓度比母瓶略高，更接近于种子罐的 培养基配方。
第二章 种子扩大培养
好氧静置培养法。针对容器内培养基物形态又分为 液态表面培养和固体表面培养。相对于容器内培养基体 积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液界面向培养 基内传递。 这种方法菌的生长速度与培养基的深度有关，单位 体积的表面积越大，生长速度越快。
2 固体培养（发酵）法(solid culturing)： 固体培养又分为浅盘(shallow pan)固体培养和深 层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特 有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。
（二）生产车间种子制备
实验室制备的孢子或液体种子移种 至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽 因不同菌种而异，但其原则为采用易被 菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸 盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足 够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝） 体在培养液中均匀分布，获得相同的培 养条件。
1.摇瓶种子制备
一、种子扩大培养流程图
摇瓶液体培养
冷冻干燥孢子
茄子瓶斜面培养
斜面孢子 砂土孢子 固体培养基培养 一级种子罐 二级种子罐 发酵罐
实验室种子制备阶段 （一级种子培养）
生产车间种子制备阶段 （二级种子培养、 三级种子培养） 二级发酵 三级发酵
（一）实验室种子的制备
两种方式：在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程
用哪一代的斜面孢子接入液体培养，视菌种特性而定。 母斜面孢子接入液体培养基有利于防止菌种变异， 子斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。 菌种进入种子罐有两种方法： 孢子进罐法，即将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种子 罐．此方法可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工 艺过程简单、便于控制孢子质量等优点，孢子进罐法已成 为发酵生产的一个方向。 摇瓶菌丝进罐法，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，此 方法的优点是可以缩短种子在种子罐内的培养时间
2 固体培养（发酵）法(solid culturing)： 固体培养又分为浅盘(shallow pan)固体培养和深 层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特 有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。
（二）生产车间种子制备
实验室制备的孢子或液体种子移种 至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽 因不同菌种而异，但其原则为采用易被 菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸 盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足 够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝） 体在培养液中均匀分布，获得相同的培 养条件。
1.摇瓶种子制备
一、种子扩大培养流程图
摇瓶液体培养
冷冻干燥孢子
茄子瓶斜面培养
斜面孢子 砂土孢子 固体培养基培养 一级种子罐 二级种子罐 发酵罐
实验室种子制备阶段 （一级种子培养）
生产车间种子制备阶段 （二级种子培养、 三级种子培养） 二级发酵 三级发酵
（一）实验室种子的制备
两种方式：在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程
用哪一代的斜面孢子接入液体培养，视菌种特性而定。 母斜面孢子接入液体培养基有利于防止菌种变异， 子斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。 菌种进入种子罐有两种方法： 孢子进罐法，即将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种子 罐．此方法可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工 艺过程简单、便于控制孢子质量等优点，孢子进罐法已成 为发酵生产的一个方向。 摇瓶菌丝进罐法，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，此 方法的优点是可以缩短种子在种子罐内的培养时间
第二章-种子的扩大培养
(2)培养条件 • 接种量：0.8~1.0％ • 培养温度：32~34℃ • 培养时间：7~8h • 通风量： • 50L种子罐1:0.5 • 搅拌转速340r／min； • 250L种子罐1:0.3 • 搅拌转速300r／ min • 500L种子罐1:0.25 • 搅拌转速230r／ min
(3)二级种子的质量要求 • 种龄：7~8h • pH：7.2左右 • OD值净增0.5左右 • 无菌检查(-) • 噬菌体检查(-)
种子罐培养：
获得足够的菌种数量； 种子罐的培养基接近发酵罐培养的醪液成分和 培养条件，使菌体适应发酵环境。
种子罐级数的确定
种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大培养的次 数
种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并 减少由于多次转种而带来的染菌机会以及减少因 种子罐生长异常而造成的发酵波动 但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的种子 以满足发酵的需求
（5）pH
●
pH影响菌体的生长和代谢
（6）通气搅拌
影响培养基中的溶氧，通气过大或搅拌速度过快容易导致某些酶失 活或菌体细胞破裂。
●
3、接种量和种龄的影响
移入种子的体积 接种量＝ ————————— 接种后培养液的体积
接种量大小最终以实践定。
接种量过多：菌丝生长过快、溶 氧不足，衰老细胞增加等，发酵 后劲不足 种量过少：延长发酵周期，形成 异常形态，而且易造成染菌。 以生产菌种在发酵罐中的繁殖速 度为依据 接种量的大小直接影响发酵周期。
碳源和氮源不太丰富（ 碳源约1%，氮源不超过
0.5%）。碳源丰富易造成生理酸性的营养环境，不 利于放线菌孢子形成；氮源丰富有利于菌丝繁殖不 利于孢子形成。
第五章种子的扩大培养
玉米淀粉双酶糖 4.0， 玉米浆 1.5 ，甘蔗糖 12 / 20 蜜 1.0, 液氨，复合维生素 01 mg/L， 无机 m3 盐等
玉米淀粉双酶糖 13-14， 玉米浆 0.06-0.08 ， 154 / 240 甘蔗糖蜜 1.0, 液氨，维生素 50 g， 无机盐 m3 等
三级种子的特点： ① 种量更大，生长速度快：
采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体
采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体 的形态，从而影响菌体干重和Υ亚麻酸产量。
不同接种量影响菌体的生长和发酵
发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高 发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率
20%种子罐＋10%发酵罐前期发酵液效果最好
活力旺盛
二、青霉素生产的种子制备
制备过程
安瓿管 → 斜面孢子 → 大米孢子 → 一级种子 → 二级种子
→ 发酵
1. 斜面孢子
培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培养条件：25℃、7天，注意湿度50%左右
培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细
2. 大米孢子
培养基：大米及氮源（玉米浆） 培养条件：25℃、7天，控制湿度
接种后培养液的体积
过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素 为7-15%。但是一般认为大一点好。
双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。
倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发 酵罐。
接种量对菌体形态和产Υ亚麻酸的影响
杨博， 中国油脂，2002
Υ亚麻酸是人体必需多价不饱和脂肪酸，是人体前列 腺素的前体，在预防与治疗心脑血管疾病、糖尿病治 疗、增强免疫力、抗癌和保护皮肤等方面具有重要作 用。发酵法生产Υ亚麻酸成了当今研究的一个热点。
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微生物制药工艺
第一章 种子的扩大培养
菌 种： 用于发酵过程作为活细胞催化剂 的微生物，包括细菌、放线菌、酵母菌 和霉菌四大类。 种 子：是指由菌种及其生长基质组成的 繁殖材料。
种子的扩大培养
种子培养过程
种子培养：是指提供给种子适宜的生长繁 殖条件，使种子能迅速生长成合格的菌体的过 程。一般包括孢子制备和菌丝种子制备两个过 程。
种子的扩大培养
孢子龄
• 过于年轻的孢子经不起冷藏，过于衰老的孢子 生产能力下降。孢子龄以控制在孢子量多、成 熟、效价正常的阶段为宜。
接种量
接种量过小斜面长出的菌落稀疏，太大则菌落 密度过大。传代用斜面孢子要求菌落稀疏，便 于挑选单个菌落传代；摇瓶或进罐用斜面孢子 要求菌落密度适中或稍密，孢子数达到要求标 准。
种子的扩大培养
种子罐接种方法： 1、压差法（孢子悬液接种） 2、注射法 3、摇瓶直接进罐法 发酵罐接种方法： 1、压差法（种醪接种）
种子的扩大培养
种子培养注意事项
• • • • • • • • • 1、严格无菌操作，避免染菌。 2、培养基、器皿、设备消毒灭菌要彻底。 3、保持环境卫生，防止杂菌滋生。 4、斜面菌种移接限三代以内。 5、培养工艺要因菌种而异。 6、加强培养工艺条件因素控制。 7、采取措施保持优良菌种的性能，防止死亡和变异。 8、及时对退化的菌种进行分离纯化和复壮。 9、压差移种时要防止接收罐表压降到零，以免染菌。
（2）斜面冷藏时间
• 斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。 • 如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4˚C冰箱保存，发现冷藏 7~8天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。 • 冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。 • 如在链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏2个月后的发酵单位比冷藏1 个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。
种子质量的判断
1、细胞或菌体 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等） 单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态； 霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况 和内含物情况好。 2、生化指标 通常测定的参数有： 1）pH 2）培养基灭菌后磷、糖、氨基氮的含量变化 3）其它参数，如某种酶的活力 如土霉素发酵中，种子液的淀粉酶活力与发酵单位有一定关系，可通过 测定种子液中淀粉酶的活力判断种子质量。 3、产物生成量 在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产 物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。
种子的扩大培养
二、种子罐培养过程中的影响因素
• 1、原料 • 2、培养条件（温度、PH、通气量、搅孢子发芽和菌丝生长的培养 基， 在营养上要易于被菌体直接吸收利用，营养成分 要适当的丰富和完全，氮源和维生素含量较高，这样 可以使菌丝粗壮并具有较强的活力； 另一方面，培养基的营养成分要尽可能地和发酵 培养基接近，以适合发酵的需要，这样种子一旦移入 发酵罐后就比较容易适应发酵罐的培养条件。
早自溶，效价降低等。
一般需保证充足的通气
斜面外观
上部稀薄，下部稠，略黄 上部薄，中部均匀，发白 一片白，孢子丰富，稍皱
相对湿度
16.5～19 25～36 40～45
种子的扩大培养
培养时间和冷藏时间
（1）培养时间
• 一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进 入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力 的下降。 • 措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正 常的阶段终止培养。
种子的扩大培养
移种方式：
种子罐1
②
①
发酵罐1
① ④
③
发酵罐2
种子罐2
1）单种 2）双种 3）倒种 4）混种
种子的扩大培养
• 1）单种：一个种子罐接种到一个发酵罐中。 • 2）双种：为加大接种量，两个种子罐接种到 一个发酵罐中。 • 3）倒种：种子罐染菌又无备用种子时或种子 质量不理想可采样倒种法，以适宜的发酵罐倒 出部分给另一发酵罐。 • 4）混种：一部分种子来源于种子罐，一部分 来源于发酵罐。
种子罐的作用：
主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝） 体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定 的菌体量，以利于产物的合成。
种子的扩大培养
种子罐级数的确定 种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培
养的次数。
一般根据菌种生长特性、孢子发芽及菌 体繁殖速度以及所采用发酵罐的容积而 定。
种子的扩大培养
• 细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少。 • 茄子瓶→种子罐→发酵罐 二级发酵 • 霉菌：生长较慢，如青霉菌， • 孢子悬浮液→一级种子罐（27˚C,40小时孢子发芽， 产生菌丝 ）→二级种子罐（ 27˚C,10~24小时，菌体 迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐 三级发酵 • 放线菌：生长更慢，采用三级种子罐扩大培养 四级发酵 • 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子。 • 二级发酵 • 种子的扩大培养
种子的扩大培养
2、生产车间种子制备
实验室制备的孢子或液体种子移种至 种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同 菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成 分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等。如果是需 氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不 断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布， 获得相同的培养条件。
种子的扩大培养
种子的扩大培养
接种量
接种量——是指移入的种子液体积和接种后培养液 体积的比例。 接种量的大小取决于生产菌种在发酵中生长繁殖 的速度。
大多数抗生素发酵的最适接种量为7～15%，有 时可增加到20 ～25%；而由棒状杆菌生产谷氨 酸接种量只需1%。 除了始于斜面培养的初次接种外，发酵过程的 各阶段接种量一般均需0.5～10%的接种量。
种子的扩大培养
采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高 峰的时间，使产物的形成提前到来。 近年来，不少厂家以加大种子量及采用丰富培养基作为获 得高产的措施；有的产品采用两个种子罐接一个发酵罐的双种 法。 如卡那霉素生产中采用双种比单种的发酵单位提高8%，且 达到产量高峰的时间提前。 但如果接种量过大，往往使菌体生长过快、培养液黏度增加， 造成溶氧不足，从而影响产物的合成。 如由嗜碱芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的发酵，1%接种量产酶 活最高，在0.5～4%之间虽有差别，但影响不大；如超过4%则 酶产量明显下降。 种子的扩大培养
种子的扩大培养
•
培养条件
培养条件对种子罐培养过程中的影响主要集中在以下几方面： ① 温度——最适温度20～40℃。 ② pH值——大多数为pH4～9，保生长，防杂菌污染。 ③ 通气量——不同时期需氧量不同，一般前期需氧量少， 后期需氧量多，应适当增大供氧量。 ④ 搅拌——控制搅拌转速，确保溶氧均匀，利于种子的培 养。也可避免菌丝结团、粘壁等现象发生。
种子的扩大培养
问题分析及处理手段
• 一、孢子培养过程中的影响因素 • 1、原材料质量 • 2、培养条件（温度、湿度、通气量） 3、斜面冷藏时间 • 4、孢子龄 • 5、接种量
种子的扩大培养
原材料质量
生产过程中经常出现种子质量不稳定的现 象，其主要原因是原材料质量波动。
如： 四环素、土霉素生产中，配制产孢斜面培养基用的麸皮， 原材料质量的波动，起主要作用的是 因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量均有 一定影响。 其中的无机离子含量不同。如微量元 制备霉菌用的大米，其产地、颗粒大小、均匀程度不同， 素 Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的 孢子质量也不同。 形成。磷含量太多或太少也会影响孢 蛋白胨加工原料不同（如鱼胨或骨胨）对孢子影响也不同。 子的质量。 水质的硬度、污染程度对生产均有影响 种子的扩大培养
种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷 冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜 面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩 大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。
种子的扩大培养
种子扩大培养的目的与要求：
种子扩培的目的： 接种量的需要、菌种的驯化、缩短 发酵时间、保证生产水平。 种子的要求：
生理状况稳定。 菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求。 无杂菌污染。 保持稳定的生产能力。 种子的扩大培养
培养条件
1）温度
量有较大影响。一般湿度小，生长快；湿度大， 如 ：土霉素生产种子，在高于37℃培养时，孢子接入 生长慢。 不同湿度对龟裂链霉菌（产土霉素）斜面生长的 3）通气量 发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过
2）湿度
影响
温度对多数品种斜面孢子质量有显著影响。温度对多数 微生物的斜面孢子质量有显著影响。温度过低生长缓慢； 温度过高孢子早熟，易老化，接入发酵后就会出现菌丝 对糖、氮利用缓慢，氨基氮回升，发酵产量降低等，甚 制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质 至引起菌丝过早自溶。
种子的扩大培养
种龄 种龄——种子罐中培养的菌体开始移入下
一级种子罐或发酵罐时的培养时间。
选择适当种龄的菌种接种十分重要
通常，种龄以菌体处于生命力极为旺盛的对数期，且培养 液中菌体量还未达到最高峰时，较为合适。过于年轻的种 子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、发酵周期延 长、产物开始形成的时间推迟，造成异常发酵的情况。过 老的种子会引起生产能力下降，菌体过早自溶。
种子的扩大培养
种子质量的控制措施
1、菌种的稳定性检查 2、适宜的生长环境（营养、温度、湿 度、通气量） 3、种子无杂菌检查
种子的扩大培养
生产发酵罐的无菌接种技术
生产规模发酵罐的接种，包括两个方面：
种子罐接种：从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种 入一个种子罐； 发酵罐接种：从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。
种子的扩大培养
• 发酵工业的“三先天”条件（孢子或菌丝培养阶段）： 1、菌种质量； 2、培养基原料； 3、无菌状态。
第一章 种子的扩大培养
菌 种： 用于发酵过程作为活细胞催化剂 的微生物，包括细菌、放线菌、酵母菌 和霉菌四大类。 种 子：是指由菌种及其生长基质组成的 繁殖材料。
种子的扩大培养
种子培养过程
种子培养：是指提供给种子适宜的生长繁 殖条件，使种子能迅速生长成合格的菌体的过 程。一般包括孢子制备和菌丝种子制备两个过 程。
种子的扩大培养
孢子龄
• 过于年轻的孢子经不起冷藏，过于衰老的孢子 生产能力下降。孢子龄以控制在孢子量多、成 熟、效价正常的阶段为宜。
接种量
接种量过小斜面长出的菌落稀疏，太大则菌落 密度过大。传代用斜面孢子要求菌落稀疏，便 于挑选单个菌落传代；摇瓶或进罐用斜面孢子 要求菌落密度适中或稍密，孢子数达到要求标 准。
种子的扩大培养
种子罐接种方法： 1、压差法（孢子悬液接种） 2、注射法 3、摇瓶直接进罐法 发酵罐接种方法： 1、压差法（种醪接种）
种子的扩大培养
种子培养注意事项
• • • • • • • • • 1、严格无菌操作，避免染菌。 2、培养基、器皿、设备消毒灭菌要彻底。 3、保持环境卫生，防止杂菌滋生。 4、斜面菌种移接限三代以内。 5、培养工艺要因菌种而异。 6、加强培养工艺条件因素控制。 7、采取措施保持优良菌种的性能，防止死亡和变异。 8、及时对退化的菌种进行分离纯化和复壮。 9、压差移种时要防止接收罐表压降到零，以免染菌。
（2）斜面冷藏时间
• 斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。 • 如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4˚C冰箱保存，发现冷藏 7~8天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。 • 冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。 • 如在链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏2个月后的发酵单位比冷藏1 个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。
种子质量的判断
1、细胞或菌体 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等） 单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态； 霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况 和内含物情况好。 2、生化指标 通常测定的参数有： 1）pH 2）培养基灭菌后磷、糖、氨基氮的含量变化 3）其它参数，如某种酶的活力 如土霉素发酵中，种子液的淀粉酶活力与发酵单位有一定关系，可通过 测定种子液中淀粉酶的活力判断种子质量。 3、产物生成量 在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产 物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。
种子的扩大培养
二、种子罐培养过程中的影响因素
• 1、原料 • 2、培养条件（温度、PH、通气量、搅孢子发芽和菌丝生长的培养 基， 在营养上要易于被菌体直接吸收利用，营养成分 要适当的丰富和完全，氮源和维生素含量较高，这样 可以使菌丝粗壮并具有较强的活力； 另一方面，培养基的营养成分要尽可能地和发酵 培养基接近，以适合发酵的需要，这样种子一旦移入 发酵罐后就比较容易适应发酵罐的培养条件。
早自溶，效价降低等。
一般需保证充足的通气
斜面外观
上部稀薄，下部稠，略黄 上部薄，中部均匀，发白 一片白，孢子丰富，稍皱
相对湿度
16.5～19 25～36 40～45
种子的扩大培养
培养时间和冷藏时间
（1）培养时间
• 一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进 入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力 的下降。 • 措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正 常的阶段终止培养。
种子的扩大培养
移种方式：
种子罐1
②
①
发酵罐1
① ④
③
发酵罐2
种子罐2
1）单种 2）双种 3）倒种 4）混种
种子的扩大培养
• 1）单种：一个种子罐接种到一个发酵罐中。 • 2）双种：为加大接种量，两个种子罐接种到 一个发酵罐中。 • 3）倒种：种子罐染菌又无备用种子时或种子 质量不理想可采样倒种法，以适宜的发酵罐倒 出部分给另一发酵罐。 • 4）混种：一部分种子来源于种子罐，一部分 来源于发酵罐。
种子罐的作用：
主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝） 体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定 的菌体量，以利于产物的合成。
种子的扩大培养
种子罐级数的确定 种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培
养的次数。
一般根据菌种生长特性、孢子发芽及菌 体繁殖速度以及所采用发酵罐的容积而 定。
种子的扩大培养
• 细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少。 • 茄子瓶→种子罐→发酵罐 二级发酵 • 霉菌：生长较慢，如青霉菌， • 孢子悬浮液→一级种子罐（27˚C,40小时孢子发芽， 产生菌丝 ）→二级种子罐（ 27˚C,10~24小时，菌体 迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐 三级发酵 • 放线菌：生长更慢，采用三级种子罐扩大培养 四级发酵 • 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子。 • 二级发酵 • 种子的扩大培养
种子的扩大培养
2、生产车间种子制备
实验室制备的孢子或液体种子移种至 种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同 菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成 分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等。如果是需 氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不 断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布， 获得相同的培养条件。
种子的扩大培养
种子的扩大培养
接种量
接种量——是指移入的种子液体积和接种后培养液 体积的比例。 接种量的大小取决于生产菌种在发酵中生长繁殖 的速度。
大多数抗生素发酵的最适接种量为7～15%，有 时可增加到20 ～25%；而由棒状杆菌生产谷氨 酸接种量只需1%。 除了始于斜面培养的初次接种外，发酵过程的 各阶段接种量一般均需0.5～10%的接种量。
种子的扩大培养
采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高 峰的时间，使产物的形成提前到来。 近年来，不少厂家以加大种子量及采用丰富培养基作为获 得高产的措施；有的产品采用两个种子罐接一个发酵罐的双种 法。 如卡那霉素生产中采用双种比单种的发酵单位提高8%，且 达到产量高峰的时间提前。 但如果接种量过大，往往使菌体生长过快、培养液黏度增加， 造成溶氧不足，从而影响产物的合成。 如由嗜碱芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的发酵，1%接种量产酶 活最高，在0.5～4%之间虽有差别，但影响不大；如超过4%则 酶产量明显下降。 种子的扩大培养
种子的扩大培养
•
培养条件
培养条件对种子罐培养过程中的影响主要集中在以下几方面： ① 温度——最适温度20～40℃。 ② pH值——大多数为pH4～9，保生长，防杂菌污染。 ③ 通气量——不同时期需氧量不同，一般前期需氧量少， 后期需氧量多，应适当增大供氧量。 ④ 搅拌——控制搅拌转速，确保溶氧均匀，利于种子的培 养。也可避免菌丝结团、粘壁等现象发生。
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问题分析及处理手段
• 一、孢子培养过程中的影响因素 • 1、原材料质量 • 2、培养条件（温度、湿度、通气量） 3、斜面冷藏时间 • 4、孢子龄 • 5、接种量
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原材料质量
生产过程中经常出现种子质量不稳定的现 象，其主要原因是原材料质量波动。
如： 四环素、土霉素生产中，配制产孢斜面培养基用的麸皮， 原材料质量的波动，起主要作用的是 因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量均有 一定影响。 其中的无机离子含量不同。如微量元 制备霉菌用的大米，其产地、颗粒大小、均匀程度不同， 素 Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的 孢子质量也不同。 形成。磷含量太多或太少也会影响孢 蛋白胨加工原料不同（如鱼胨或骨胨）对孢子影响也不同。 子的质量。 水质的硬度、污染程度对生产均有影响 种子的扩大培养
种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷 冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜 面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩 大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。
种子的扩大培养
种子扩大培养的目的与要求：
种子扩培的目的： 接种量的需要、菌种的驯化、缩短 发酵时间、保证生产水平。 种子的要求：
生理状况稳定。 菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求。 无杂菌污染。 保持稳定的生产能力。 种子的扩大培养
培养条件
1）温度
量有较大影响。一般湿度小，生长快；湿度大， 如 ：土霉素生产种子，在高于37℃培养时，孢子接入 生长慢。 不同湿度对龟裂链霉菌（产土霉素）斜面生长的 3）通气量 发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过
2）湿度
影响
温度对多数品种斜面孢子质量有显著影响。温度对多数 微生物的斜面孢子质量有显著影响。温度过低生长缓慢； 温度过高孢子早熟，易老化，接入发酵后就会出现菌丝 对糖、氮利用缓慢，氨基氮回升，发酵产量降低等，甚 制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质 至引起菌丝过早自溶。
种子的扩大培养
种龄 种龄——种子罐中培养的菌体开始移入下
一级种子罐或发酵罐时的培养时间。
选择适当种龄的菌种接种十分重要
通常，种龄以菌体处于生命力极为旺盛的对数期，且培养 液中菌体量还未达到最高峰时，较为合适。过于年轻的种 子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、发酵周期延 长、产物开始形成的时间推迟，造成异常发酵的情况。过 老的种子会引起生产能力下降，菌体过早自溶。
种子的扩大培养
种子质量的控制措施
1、菌种的稳定性检查 2、适宜的生长环境（营养、温度、湿 度、通气量） 3、种子无杂菌检查
种子的扩大培养
生产发酵罐的无菌接种技术
生产规模发酵罐的接种，包括两个方面：
种子罐接种：从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种 入一个种子罐； 发酵罐接种：从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。
种子的扩大培养
• 发酵工业的“三先天”条件（孢子或菌丝培养阶段）： 1、菌种质量； 2、培养基原料； 3、无菌状态。