彩虹130广谱蛋白marker说明书
蛋白Marker说明书
SM0671PageRuler Prestained Protein LadderA prestained SDS-PAGE MW marker with contrasting colored reference bands at10 and 70kDa.The Thermo Scientific PageRuler Prestained Proteis a mixture of ten (10) blue-, orange- and green-srecombinant proteins (10 to 170kDa) for use as sizstandards in protein electrophoresis (SDS-PAGE)Western blotting.This prestained protein MW marker is designed fomonitoring the progress of SDS-polyacrylamide geelectrophoresis, for assessing transfer efficiency onylon and nitrocellulose membranes, and for estimapproximate size of separated proteins that have b visible with gel stains or Western blot detection reagents. The ladder contains one orange refer at 70kDa and one green band at 10kDa.Highlights:•Size range– 10 proteins spanning 10 to 170kDa•Ready-to-use– supplied in a loading buffer for direct loading on gels; no need to boil •Sharp bands– color-coded bands of similar intensity for easy visualization•Quality tested – each lot evaluated by SDS-PAGE and Western blotting•Two reference bands– orange at 70kDa and green at 10kDa•Membrane-compatible– colored bands transfer to membranes for Western blottingIncludes:•Dye-stained proteins in 62.5mM Tris-H3PO4 (pH 7.5 at 25°C), 1mM EDTA, 2% SDS, 1 1mM NaN3 and 33% glycerol.Applications:•Monitoring protein migration during SDS-polyacrylamide gel electrophoresis•Monitoring protein transfer onto membranes after Western blotting•Sizing of proteins on SDS-polyacrylamide gels and Western blotsProduct Details:SDS-PAGE band profile of the Thermo ScientificPageRuler Prestained Protein Ladder. Images arefrom a 4-20% Tris-glycine gel (SDS-PAGE) andsubsequent transfer to membrane.Sm1841Spectra Multicolor Broad Range Protein LadderA prestained, 4-color, SDS-PAGE MW marker especially for proteins between 10 and 260kDa.The Thermo Scientific Spectra Multicolor Broad RangeProtein Ladder is a 4-color protein standard containing 10prestained recombinant prokaryotic proteins (10 to 260kDa)for use as size standards in gel electrophoresis and Westernblotting.This prestained protein MW marker is designed formonitoring the progress of SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis, for assessing transfer efficiency onto PVDF,nylon and nitrocellulose membranes, and for estimating theapproximate size of separated proteins that have been made visible with gel stains or Western blot detection reagents. Four different chromophores (blue, orange, green, pink) are bound to the different component proteins, producing a brightly colored ladder with an easy-to-remember pattern.Highlights:•Size range– 10 proteins spanning 10 to 260kDa•Multicolor– four different colors for unambiguous band-size assignment•Ready-to-use– supplied in a loading buffer for direct loading on gels; no need to boil•Sharp bands– color-coded bands of similar intensity for easy visualization•Quality tested – each lot evaluated by SDS-PAGE and Western blotting•Membrane-compatible– colored bands transfer to membranes for Western blotting Includes:•Dye-stained proteins in 62.5mM Tris-H3PO4 (pH 7.5 at 25°C), 1mM EDTA, 2% SDS, 10mM DTT, 1mM NaN3 and 33% glycerol.Applications:•Monitoring protein migration during SDS-polyacrylamide gel electrophoresis•Monitoring protein transfer onto membranes after Western blotting•Sizing of proteins on SDS-polyacrylamide gels and Western blotsProduct Details:SDS-PAGE band profile of the Thermo ScientificSpectra Multicolor Broad Range Protein Ladder.Images are from a 4-20% Tris-glycine gel(SDS-PAGE) and subsequent transfer to membrane.S m1811PageRuler Plus Prestained Protein LadderA prestained SDS-PAGE MW marker with contrasting colored reference bands at 10, 25 and 70kDa.The Thermo Scientific PageRuler Plus Prestained ProteinLadder is a mixture of nine (9) blue-, orange- andgreen-stained recombinant proteins (10 to 250kDa) for useas size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE)and Western blotting.This prestained protein MW marker is designed formonitoring the progress of SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis, for assessing transfer efficiency onto PVDF,nylon and nitrocellulose membranes, and for estimating theapproximate size of separated proteins that have been made visible with gel stains or Western blot detection reagents. A blue chromophore is bound to all proteins, except proteins of two reference bands of 70kDa and 25kDa that are colored with an orange dye and one green reference band of 10kDa. PageRuler Plus Prestained Protein Ladder is ready to use: no heating, further dilution or addition of a reducing agent is required before loading onto a gel.Highlights:•Size range– nine proteins spanning 10 to 250kDa•Ready-to-use– supplied in a loading buffer for direct loading on gels; no need to boil•Sharp bands– color-coded bands of similar intesity for easy visualization•Quality tested – each lot evaluated by SDS-PAGE and Western blotting•Bright reference bands– orange at 70 and 25kDa, and green at 10kDa•Membrane-compatible– colored bands transfer to membranes for Western blotting Includes:•Dye-stained proteins in 62.5mM Tris-H3PO4 (pH 7.5 at 25°C), 1mM EDTA, 2% SDS, 10mM DTT, 1mM NaN3 and 33% glycerol.Applications:•Monitoring protein migration during SDS-polyacrylamide gel electrophoresis•Monitoring protein transfer onto membranes after Western blotting•Sizing of proteins on SDS-polyacrylamide gels and Western blotsProduct Details:SDS-PAGE band profile of the Thermo Scientific PageRuler Plus Prestained Protein Ladder. Images are from a 4-20% Tris-glycine gel(SDS-PAGE) and subsequent transfer to membrane.。
WB实验步骤
蛋白电泳（制胶、SDS -PAGE 电泳）实验材料：SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker 、SDS-PAGE Loading Buffer （还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材：蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml 离心管、5ml 移液器、微量移液器、1.5ml 离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液：● 配制10%APS 溶液：-20度保存0.5g APS + 5ml 蒸馏水、2.5g APS + 25ml 蒸馏水● 配制200 ml 电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS （ph8.3,10×）20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ● 配制1 ml loading buffer ：200 ul 5×loading buffer +800 ul 蒸馏水 实验步骤： 一．制胶：1. 参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
2. 根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。
3. 配制10%分离胶：将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。
加入10%APS 和TEMED ，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。
静置40分钟至1小时。
5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。
6.配制5%浓缩胶：7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。
注意：灌胶速度要快，防止凝胶。
8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
静置20分钟，等待浓缩胶聚合。
9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。
赶走气泡。
二．SDS-PAGE电泳:1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。
彩虹130广谱蛋白marker说明书
第1页，共2页彩虹130广谱蛋白marker 说明书货号：PR1950规格：20T (100μL)/50T(250μL)/100T(250μL×2)/500T(250μL×10)保存：-20℃保存，有效期至少2年。
产品特点：●三色预染，颜色鲜亮，条带整齐，便于观察。
●用量少，节约成本，仅5μL 即可完美呈现（1.5mm ，10孔梳）。
●广谱多带，一支即可满足多种实验需求。
产品简介：本产品包含9种彩色预染的已知分子量标准蛋白，分子量范围为15kD-130kD ，每种蛋白含量约为0.2-0.4mg/mL 。
预染marker 可以用于直接观察蛋白质电泳状况以及清晰地判断Western Blot 的转膜效果。
经SDS-PAGE 凝胶电泳或转移到PVDF 或NC 膜上可得到清晰的9条彩色蛋白条带，其中72kD 条带为红色，25kD 条带为绿色，其余条带为蓝色。
使用说明（仅供参考）：1.本产品是即用型液体，可直接上样电泳。
上样前无需加热，稀释或添加还原剂。
2.上样5μL ，SDS-PAGE 电泳过程及转膜后可看见清晰的彩虹条带。
3.建议分离胶浓度为15%。
电泳示意图说明：注意事项：1.本产品含有较高浓度甘油，常规-20℃保存为液体状态，可直接使用。
若冰箱温度不稳，导致结冰，可适当分装后置于4℃保存，至少稳定6个月。
2.Marker 分离效果与PAGE 胶浓度相关，若分离胶浓度低于15%，25kD 以下条带不易分离，但不影Beijing Solarbio Science &Technology Co.,LtdTel:400-968-6088Fax:响绿色（25KD）及以上条带。
如果目的条带小于25KD，建议分离胶浓度大于或等于15%。
3.转膜效果与转膜时间有关，需根据客户目的条带大小而定，如果转膜后较大分子量条带有部分未转膜成功，属于正常现象。
相关产品：P10154×蛋白上样缓冲液（含DTT）P1200SDS-PAGE凝胶制备试剂盒T10705×Tris-甘氨酸电泳缓冲液D106010×电泳转移缓冲液PR1920彩虹245广谱蛋白markerPR1700预染次高分子量蛋白markerSW3010膜封闭液DA1010DAB显色试剂盒（20×）PE0010ECL Plus荧光检测试剂(ECL超敏发光液)第2页，共2页。
marker说明书
CERTIFICATE OF ANALYSISPageRuler ™Prestained Protein Ladder#SM067210 x 250 µl(for 100 mini gel applications 5 µl per well or 50 large gel applications 10 µl per well)Lot: Expiry Date:Storage: stable at 4°C for up to 3 months. For long term storage, store at -20°C.SM067_57_9.docDescriptionPageRuler ™Prestained Protein Ladder is a mixture of 10 recombinant, highly purified colored proteins with apparent molecular weights of 10 kDa to 170 kDa. Ladder proteins are covalently coupled with a blue dye except for two reference bands prestained with different colors. The 72 kDa reference band is orange and 10 kDa reference band is green.The ladder is supplied in gel loading buffer and isready-to-use: no heating, further dilution or addition of a reducing agent is required.ContentsApproximately 0.1-0.2 mg/ml of each protein in the storage buffer (62.5 mM Tris-H 3PO 4 (pH 7.5 at 25°C), 1 mM EDTA, 2% (w/v) SDS, 10 mM DTT, 1 mM NaN 3 and 33% (v/v) glycerol).Applications∙ Monitoring of protein separation during SDS-PAGE (1). ∙ Verifying Western transfer efficiency (2, 3).∙ Approximate sizing of proteins on SDS-polyacrylamidegels and Western blots.Instruction for Use❶ Thaw the ladder at room temperature for a few minutes to dissolve precipitated solids. DO NOT BOIL!❷ Mix gently, but thoroughly, to ensure the solution is homogeneous.❸ Load the following volumes of the ladder on an SDS-polyacrylamide gel:– 5 µl per well for mini gel,– 10 µl per well for large gel.Use the same volumes for Western blotting.❹ After the run is complete, stain the gel or perform Western transfer procedure as desired.Note•Each lot of the PageRuler™ Prestained Protein Ladder is calibrated against a precisely sized, PageRuler™ Unstained Protein Ladder and calculated apparent molecular weights are reported in the picture.•For precise molecular weight determinations use PageRuler™ Unstained Protein Ladder, #SM0661, see.•In 8 or 10% gels low molecular weight proteins may migrate with the dye front.•Loading volumes are intended for use in gels with a thickness of 0.75 mm. For thicker gels, the recommended loading volume should be increased.•PageRuler™ Prestained Protein Ladder could be used in Western blotting with all common membranes: PVDF, nylon and nitrocellulose.•Longer transfer times or higher transfer voltages may be required for Western blotting of large (>100 kDa) proteins.Lot specific MW, kDa4-20% Tris-glycine SDS-PAGEcontinued on back pageQUALITY CONTROL5 µl of PageRuler™ Prestained Protein Ladder resolves 10 bands of equal intensities in 4-20% SDS-PAGE (Tris-glycine buffer) and after Western blotting onto PVDF membrane.Quality authorized by: Jurgita Zilinskiene References1. Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685, 1970.2. Burnette, W.N., "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A, Anal. Biochem., 112 (2), 195-203, 1981.3. Towbin, H., et al., E lectrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354, 1979.This product is manufactured under the license forStrep-tag® technology covered by US patents Nos.5,506,121, 6,103,493 and foreign counterparts. Related Products∙DualColor™ Protein Loading Buffer Pack #R1011∙Loading Buffer Pack #R0891∙Spectra™ Multicolor Broad Range Protein Ladder #SM1841∙PageRuler™ Unstained #SM0661∙PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder #SM1811∙PageSilver™ Silver Staining Kit #K0681∙PageBlue™ Protein Staining Solution #R0571∙10X Tris-glycine-SDS Buffer #B46∙10X Tris-tricine-SDS Buffer #B48∙DTT #R0861 ∙ProteoJET™ Mammalian Cell Lysis Reagent #K0301∙ProteoJET™ Cytoplasmic and Nuclear ProteinExtraction Kit #K0311∙Bradford Reagent, ready-to-use #R1271∙Bovine Serum Albumin Standard Set, ready-to-use #R1281∙Bovine Gamma Globulin Standard Set, ready-to-use #R1291PRODUCT USE LIMITATION.This product is developed, designed and sold exclusively for research purposes andin vitro use only. The product was not tested for use in diagnostics or for drugdevelopment, nor is it suitable for administration to humans or animals.Please refer to for Material Safety Data Sheet of the product.。
蛋白marker标记颜色方法
蛋白marker标记颜色方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：蛋白marker标记颜色方法在生物科学研究中，标记蛋白是非常常见的实验技术之一。
蛋白marker的标记可以帮助研究人员在实验中追踪和定位蛋白，从而更好地理解蛋白的功能和相互作用。
而标记蛋白的颜色选择也是非常重要的，不同颜色的标记能够帮助实验者在实验过程中更清晰地识别和分析样品。
本文将介绍一些常用的蛋白marker标记颜色方法，希望能够帮助读者更好地进行蛋白标记实验。
一、荧光标记荧光标记是蛋白标记颜色中最常用的方法之一。
通过将蛋白与荧光物质结合，可以在光学显微镜下直接观察到蛋白标记的颜色。
常用的荧光标记包括FITC（荧光异硫氰酸酯），TRITC（罗丹明异硫氰酸酯）和Cy5（Cyanine5）。
这些荧光物质在实验中常用于免疫荧光染色、融合蛋白标记等实验中。
荧光标记的优势是信号强度高、灵敏度高且不受环境影响，适用于单细胞和组织的标记。
在实验中，荧光标记的颜色可以根据荧光物质的不同而有所区分。
比如，FITC标记的蛋白呈现绿色，TRITC标记呈现橙红色，Cy5标记呈现红色。
实验者可以根据实验需要选择不同的荧光标记物质，并通过显微镜观察到标记蛋白的颜色。
二、生物素标记生物素标记是一种基于生物素-亲和素相互作用的蛋白标记方法。
生物素是一种维生素H成分，具有与亲和素结合的特性。
在实验中，生物素可以与生物素素结合并形成稳定的结合物，从而实现蛋白的标记。
生物素标记的颜色在实验中常表现为紫色，实验者可以通过观察颜色变化来判断蛋白是否标记成功。
生物素标记的优势是其结合力强、稳定性高，适用于长时间的实验操作。
另外，生物素标记也可以用于有机溶剂、高温、酸碱环境等多种条件下的蛋白标记。
因此，在一些特殊实验条件下，生物素标记是一种非常理想的标记方法。
三、酶标记酶标记是另一种常用的蛋白标记方法。
通过将蛋白与酶结合，可以在实验中通过酶的催化作用来识别蛋白的存在。
常用的酶标记包括辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
中分子量蛋白Marker
中分子量蛋白Marker I使 用 说 明 书包 装 量：浓 度：每种蛋白约0.1－0.2mg/ml 在1×loading Buffer储运温度：收到产品后分装冻存，避免反复冻融降解蛋白，-20℃ (长期保存请置于-70℃ )(用于小胶5µl/次可用20次 用于大胶10µl /次 可用10次)制品说明：本产品是由6种蛋白质分别纯化后混合而成的蛋白质溶液，分子量范围为14KD －94KD ，经SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用考马斯亮蓝R －250（Coomassie Blue R-250）染色后可得清晰的7条蛋白带。
建议使用分离浓度为12%～15%。
适用胶浓度：最优适用于12% (37.5:1 丙烯酰胺:双丙烯酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶。
该Marker 也可用于8-15%的胶。
胶浓度为8-10% 时蛋白Marker 中低分子量的蛋白易于同染料前沿跑在一条线上不易区分，在12-15%的胶上及梯度电泳中，所有的条带都能锐利清晰分开。
推荐上样量：上样量胶厚度大小 5µl 0.75mm thick mini 10µl1.5mm thick mini 0.75mm thick large 20µl 1.5mm thick large操作步骤：1.室温融解Marker 或37- 40°C 温浴几分钟使之融解，混匀均一，不要高温加热。
2.为避免污染最好分装保存以备使用，取所需体积的Marker 置于一干净离心管中并封好口。
3. 上样并进行 SDS-PAGE 电泳。
4.该Marker适用于考马斯亮蓝, 银染或其他蛋白染色方法。
注意：银染比考马斯亮蓝染色敏感度高10～100 倍，相应的银染需要减少用量。
5.变性蛋白Marker储存于-20°C。
6.在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中不要使用该Marker，因为在该Marker的储存缓冲液中存在SDS。
爱必信WB彩色凝胶试剂盒上新啦!让您的WB实验多姿多彩
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让您的WB实验多姿多彩
蛋白免疫印迹实验（Western Blot）实验大家肯定都不陌生，要想做出好看的条带，从制胶开始就不容半点马虎。
WB制胶可谓实验室新手的必修课了，想想小编我在当初实验室的时候，就没少帮师兄师姐配置WB凝胶，泛黄的配方表小编还记忆犹新。
WB凝胶配
方表
说起WB凝胶配置，小编可有一肚子苦水要倒，第一个让人头疼的一点就是多种溶液都需要计算量取，每次调移液器就要调半天。
还有各种试剂的保存条件也不一样，配胶之前还需要从冰箱，室温柜子里分别拿出不同的溶液。
这还不算，最容易出问题的促凝剂APS，需要新鲜配置，4度保存不能超过一周，关键是粉末还特容易吸水，打开后需要密封保存。
小编之前就踩过一次坑，APS粉末吸水结块，称量配置后的APS含量不够，凝胶凝结不好，整个WB实验条带跑的七扭八歪。
蛋白质印迹（Western Blot）实验中产品推荐：。
细胞角蛋白(广谱)抗体试剂(免疫组织化学)说明书
12mL
【预期用途】
体外诊断用途。 在常规染色（如：HE染色）基础上进行免疫组织化学染色，为医师提供诊断的辅助信息。 细胞角蛋白（广谱）抗体试剂（免疫组织化学），用于在 Dako Omnis 仪器上进行的免疫组化分析。该抗 体有助于判定肿瘤是否为恶性或者上皮来源 (1-3)。临床判定任何染色的着色或缺失都必须有恰当对照的 形态学结果作为补充，基于患者的临床病史和其它诊断结果，由有资质的病理医生诊断。
3. Moll R, Franke WW, Schiller Dl. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Cell 1982; 31:11
2. Woodcock-Mitchell J, Eichner R, Nelson WG, Sun TT. Immunolocalization of keratin polypeptides in human epidermis using monoclonal antibodies. J Cell Biol 1982; 95:580
快速指南
步骤
备注
固定/包埋 预处理 抗体 阴性对照 显色
复染 对照组织
福尔马林固定，石蜡包埋
机内脱蜡
EnVision™ FLEX，高pH（编码GV804） 热诱导的抗原修复30分钟
即用型
孵育12.5分钟
FLEX阴性对照，小鼠（编码GA750） 孵育12.5分钟
EnVision™ FLEX（编码GV800）
*用户必须阅读说明书，以了解染色操作和产品处理的详细说明。
蛋白质marker
●使用方法
1. 首先按以下方法配制“稀释液”。
1 M DTT 5×Loading Buffer
* 稀释液可于室温下放置一个月左右。
2 μl 20 μl
2. 按以下方法稀释本制品。
Protein MW Marker（Low） 稀释液 灭菌蒸馏水
5 μl 22 μl 73 μl
* 20 倍的制品稀释液可在-20℃下保存 2～3 个月，但应 避免多次反复冻融。如果一次稀释量较多时，可以小 量分装后在-20℃下保存，以避免反复冻融。
50 μl 300 μl
30 μl
●制品说明
Protein Molecular Weight Marker（Low）是由 六种纯化好的不同分子量的蛋白质组成的，它的分 子量范围为：14.3 KDa～97.2 KDa。进行聚丙烯 酰胺凝胶电泳时，经考马斯亮蓝 R－250 染色后的 各种蛋白质的条带强度均一。每微升本制品的蛋白 量为 12 μg，稀释 20 倍后进行聚丙烯酰胺凝胶电 泳，每次取 5 μl（for SDS-PAGE mini gel）。以 每次使用 5 μl（20 倍稀释液）计算时本制品约可 使用 200 次。
蛋白质分子量标准（低）
Protein Molecular Weight Marker (Low)
使用说明书
TaKaRa Code：D530A
●浓 度：12 μg/μl
●arker（Low） 5×Loading Buffer 1 M DTT（Dithiothreitol）
3. 均匀混合后，100℃加热处理 5 分钟，然后取 5 μl 进行 10％～15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳 （for SDS-PAGE mini gel）。
4. 10%、12%、15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳后，经 考马斯亮蓝 R-250 染色后的结果如下。
预染蛋白marker的说明书26616
PRODUCT INFORMATIONThermo ScientificPageRuler Prestained Protein Ladder #26616 2 x 250 µlLot: XXXXXXXX Expiry Date: __WARNING! HARMFUL IF INHALED OR ABSORBEDTHROUGH SKIN. CAUSES RESPIRATORY TRACT, EYEAND SKIN IRRITATION. MAY CAUSE ALLERGIC SKIN REACTION. MAY BE HARMFUL IF SWALLOWED.CONTAINS MATERIAL WHICH CAUSES DAMAGE TO THE FOLLOWING ORGANS: KIDNEYS, LUNGS, UPPER RESPIRATORY TRACT, SKIN, EYES. CONTAINS MATERIALWHICH MAY CAUSE DAMAGE TO THE FOLLOWINGORGANS: LIVER, GASTROINTESTINAL TRACT.Avoid exposure - obtain special instructions before use. Donot breathe vapor or mist. Do not ingest. Do not get in eyesor on skin or clothing. Use only with adequate ventilation. Keep container tightly closed and sealed until ready for use. Wash thoroughly after handling. Refer to MSDS.|2661®~26616|72559?~XXXXXXXXStore at -20°C/onebio /pierce Made in Lithuania IntroductionThe Thermo Scientific™ PageRuler™ Prestained Protein Ladder is a prestained mixture of ten recombinant proteins ranging from 10 kDa to 170 kDa. Three different chromophores are bound to the proteins, producing a brightly colored ladder. The protein ladder is conveniently packaged and ready to use with no heating, diluting or additional reducing agent necessary.Lot-to-lot variation of the apparent molecular weight of prestained proteins is ~5%.Storage Buffer: 62.5mM Tris•H3PO4 (pH 7.5 at 25°C),1mM EDTA, 2% (w/v) SDS, 10mM DTT, 1mM NaN3,33% (v/v) glycerol.Important Product Information•Do not boil the protein ladder.•The protein ladder can be stored at 4ºC for up to 3 month. •For precise protein MW determination uses the PageRuler Broad Range Unstained Protein Ladder (#26630). •Each lot of the PageRuler Prestained Protein Ladder is calibrated against PageRuler Unstained Protein Ladder and calculated apparent molecular weights are reported in the lot specific product information sheet provided with the product.Rev.5Migration Patterns of PageRuler Prestained Protein LadderRecommendations for Loading1. Thaw the ladder at room temperature for a few minutes to dissolve precipitated solids. Do not boil!2. Mix gently, but thoroughly, to ensure the solution is homogeneous.3. Load the following volumes of the ladder on anSDS-polyacrylamide gel:– 5 µl per well for mini gel,– 10 µl per well for large gel.Use the same volumes for Western blotting.The loading volumes listed above are recommended for gels with a thickness of 0.75-1.0 mm. The loading volume should be doubled for 1.5 mm thick gels.Important Notes•Prestained proteins can have different mobilities in various SDS-PAGE-buffer systems. However, they are suitable for approximate molecular weight determination when calibrated against unstained standards in the same system. See the table provided for migration patterns in different electrophoresis conditions.•In low-percentage gels (< 10%), the low-molecular weight proteins in the ladder may migrate with the dye front. •PageRuler Prestained Protein Ladder can be used in Western blotting with all common membranes: PVDF, nylon and nitrocellulose.•Longer transfer times or higher transfer voltages may be required for Western blotting of large (>100 kDa) proteins.Representative picture of PageRuler Prestained ProteinLadder4-20% Tris-glycine SDS-PAGEGeneral ReferencesBurnette, W.N. (1981). “Western blotting”: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem 112(2):195-203.Kurien, B.T. and Scofield, R.H. (2003). Protein blotting: a review. J Imm Meth 274:1-15.Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-5. Towbin, H., et al. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 76:4350-4.This product is manufactured under the license for Strep-tag® technology covered by US patents Nos. 5,506,121, 6,103,493 and foreign counterparts.PRODUCT USE LIMITATIONThis product is developed, designed and sold exclusively for research purposes and in vitro use only. The product was not tested for use in diagnostics or for drug development, nor is it suitable for administration to humans or animals.Please refer to /onebio for Material Safety Data Sheet of the product.© 2013 Thermo Fisher Scientific, Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific, Inc. and its subsidiaries.。
预染蛋白marker的说明书
Thermo Scientific PageRuler Pierce 26616 Fermentas SM0671预染蛋白 Marker/Ladder Westernblot 实验北京代理Thermo 26616（SM0671）Fermentas 预染蛋白Marker/Ladder26616 markerFermentas是一家经过ISO9002认证的来自立陶宛的生物技术公司，是世界第二大工具酶和分子生物学试剂盒生产商。
该公司现在以Fermentas替代原有的MBI Fermentas商标生产和出售分子生物学产品，通过其全球分销商网络推销其产品。
该公司产品包括限制性内切酶、DNA甲基化转移酶、DNA/RNA修饰酶、PCR 产品、核酸Markers等。
PageRuler 预染蛋白LadderThermo Scientific PageRuler 预染Ladder 是一种由10 个蓝染、橙染和绿染的重组蛋白 (10 - 170kDa) 组成的混合物，在SDS-PAGE( 蛋白电泳) 和Western blotting 中作为测定分子量大小的标准品使用。
该预染蛋白分子量marker 旨在监测SDS-PAGE 电泳进程，评估转移到PVDF、尼龙和硝酸纤维素膜上的转移率，并在凝胶染色或使用Western blot 检测试剂后估算可见的分离蛋白的大致分子量。
该蛋白Ladder 包含一个70kDa 的橙色参考条带和一个10kDa 的绿色参考条带。
产品特点:•分子量范围– 10 种蛋白分子量范围在10 到170kDa 之间•易于使用–与上样缓冲液预先混合，可直接凝胶上样，无需煮沸•条带清晰–亮度类似，但颜色不同的条带便于观察•质量检测–每批次均经过SDS-PAGE 和Western blotting 验证•两个参考条带– 70kDa 为橙色，10kDa 为绿色•与膜兼容– Western blotting 时彩色条带将转移到膜上应用：•监测SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳期间蛋白的迁移•监测Western blotting 蛋白转移到膜上的情况•测定SDS 聚丙烯酰胺凝胶和Western blots 上的蛋白分子量Thermo Scientific PageRuler 预染蛋白Ladder 的 SDS-PAGE 条带图谱。
细胞角蛋白(广谱)抗体试剂(免疫组织化学)说明书
1. 供专业人员使用。 2. 该产品中含有叠氮钠 (NaN3)，纯品具有高度的化学毒性。产品中叠氮钠的浓度虽然不能被认定为危险
性浓度，但是叠氮钠可以与铅、铜发生化学反应，形成具有爆炸性危险的叠氮化金属物质。处理时需 要用大量清水冲洗，防止管道中形成金属叠氮化物质。 3. 与所有生物来源的产品相同，必须遵循相关操作步骤。 4. 穿戴合适的个人防护装置，避免皮肤和眼睛接触。 5. 请按照当地、地区以及国家的相关法规，处理未使用的溶液。
【主要组成成份】
1． 提供的试剂 即用型单克隆小鼠抗体以液体形式提供，缓冲液中含有稳定蛋白和0.015 mol/L NaN3。 克隆：AE1/AE3 同型：IgG1，kappa 2．免疫原 人体表皮细胞愈伤组织 (1)。 3．特异性 AE1/AE3 包括两种单克隆抗体，采用人愈伤组织细胞角蛋白免疫小鼠的方法得到 (2)。研究显示， AE1/AE3 能够识别大部分人细胞角蛋白，因此可以作为 IHC 中单层和复层上皮来源的判定工具 (1,2,4)。 抗体 AE1 能够与大部分亚组 A 细胞角蛋白的抗原决定簇发生反应，包括 Moll 分型(4) 中的 10、13、14、 15、16 和 19（分子量分别为 56.5、54'、50、50'、48 和 40 kDa），但是不包括编号为 12、17 和 18（分 子量分别为 55、47 和 45 kDa）的细胞角蛋白(4)。抗体 AE3 能够与亚组 B 细胞角蛋白的抗原决定簇发生 反应，包括编号为 1 和 2、3、4、5、6、7 和 8（分子量分别为 65、67、64、59、58、56、54 和 52 kDa） 的细胞角蛋白(5)。
5. Eichner R, Bonitz P, Sun T-T. Classification of epidermal keratins according to their immunoreactivity, isoelectric point and mode of expression. J Cell Biol 1984; 98:1388
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蛋白免疫印迹实验（Western Blot）实验大家肯定都不陌生，要想做出好看的条带，从制胶开始就不容半点马虎。
WB制胶可谓实验室新手的必修课了，想想小编我在当初实验室的时候，就没少帮师兄师姐配置WB凝胶，泛黄的配方表小编还记忆犹新。
WB凝胶配
方表
说起WB凝胶配置，小编可有一肚子苦水要倒，第一个让人头疼的一点就是多种溶液都需要计算量取，每次调移液器就要调半天。
还有各种试剂的保存条件也不一样，配胶之前还需要从冰箱，室温柜子里分别拿出不同的溶液。
这还不算，最容易出问题的促凝剂APS，需要新鲜配置，4度保存不能超过一周，关键是粉末还特容易吸水，打开后需要密封保存。
小编之前就踩过一次坑，APS粉末吸水结块，称量配置后的APS含量不够，凝胶凝结不好，整个WB实验条带跑的七扭八歪。
蛋白质印迹（Western Blot）实验中产品推荐：。
WB实验步骤教学文案
W B实验步骤蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳）实验材料：SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水实验仪器、耗材：蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用）配制溶液：●配制10%APS溶液：-20度保存0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水●配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10×）20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水●配制1 ml loading buffer：200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水实验步骤：一．制胶：1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。
3.配制10%分离胶：将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。
加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。
静置40分钟至1小时。
5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。
5%浓缩胶：6.配制7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。
注意：灌胶速度要快，防止凝胶。
8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
静置20分钟，等待浓缩胶聚合。
9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。
赶走气泡。
二．SDS-PAGE电泳:1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。
2. 制备样品：1）蛋白样品：根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。
超低分子量蛋白质Marker(3.3kD-20. 1kD)说明书
第1页共3页
夹层胶 10%/2mL 0.407mL / 0.667mL / 0.926mL
浓缩胶 4%/2mL 0.160mL / 0.496mL / 1.344mL
10%APS TEMED
40µL 5µL
40µL 5µL
40µL 5µL
北京索莱宝科技有限公司
20μL 3µL
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凝胶制备及染色注意事项: 1. 先配制分离胶，聚合后再配制夹层胶，最后配制浓缩胶，3种胶的制胶体积比为4:1.5:1。电泳时，30v 跑1-2小时后，待指示前沿到达分离胶上沿时，把电压调至100v，至电泳结束，整个电泳过程大约需要6-8 小时。 2. 由于多肽所含的氨基酸数目较少，因此如该多肽含有过多的极性氨基酸(碱性或酸性)，则会影响其在 SDS-PAGE 图上的条带迁移率，即其表观分子量可能和多肽的氨基酸理论推算分子量有一定距离。 3. 由于 SDS-PAGE 的图谱上，蛋白质对数分子量和迁移率成正比直线关系的分子量范围为 15,000-200,000， 因此对于分子量小于 10000 的蛋白质或多肽的分子量，只能根据标准分子量进行估计，推断其是否落入预 测的分子量范围。 4. 由于超低分子量多肽（3000 及 3000 以下），极易从凝胶上浸出，因此染色及脱色时间不宜太长，脱色后 凝胶也不宜在水中浸泡保存过久，否则条带会消失。 5. 电泳之后可将胶置于固定液中固定20分钟，再进行染色，能得到较好的蛋白条带；如时间不允许，也可 不进行固定直接染色。如果使用配方7进行染色时效果不好或考虑其毒性，请选择本公司的考马斯亮蓝蛋白 胶快速染色液(货号:P1300)，该产品具有染色快，无毒，灵敏性高等特点，是常规染色液的替代品。
凝胶的配置方法:
49.5%T 3%C 49.5%T 6%C 凝胶缓冲液 甘油 ddH2O
蛋白标准品（Marker）知识汇总
蛋白Mark er可分为：一、未预染的Ma rker即宽分子量蛋白标准、高分子量蛋白标准以及低分子量蛋白标准;二、预染的Mar ker即单色预染和多色预染。
在wester n blot 过程中，分子量Mar ker就像个螺丝钉一样没虽然是个小细节，然而就是这样一个小细节对实验结果有着不可忽视的作用。
这个 Wester n Blot 参照家族的一员的作用主要是用来指示蛋白条带所对应的分子量大小，只有标准量精确无误了，实验结果才有说服力，除此之外，蛋白标准还有表示转移成功或者蛋白在凝胶上的电泳程度等等的作用，所以选择正确的蛋白Ma rker也是west ern blot实验成功的必要条件之一。
总体来说，蛋白分子量标准可以分成未染蛋白分子量标准、预染蛋白分子量标准二个级别。
以下是关于蛋白分子量标准的小叙：一. 未染色(pre mixed)蛋白分子量标准未染色的蛋白分子量标准是最简单，也是最准确的一种。
由于没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，是精确判断蛋白大小必须的。
现在的Mar ker多数都选用预混和的Mar ker，方便不同大小的蛋白比较。
预混的Mar ker通常有几条带加倍浓度作为指示，因为混合的条带越多，越不好记，谁知道哪条是那条!数到眼都花了。
所以当看到特别浓的那几条标志带就记得是哪里了。
不过要记得，小带通常都不那么容易看清楚的。
在选择上来说，当然是选择其中至少有一条条带和自己的目的蛋白大小相近的最好，越近越好。
如果你的蛋白不幸在两条跨度较大M arker条带之间，选别的Mar ker吧。
预混的Mar ker 使用上不如预染Marke r(pre-staine d)好用，因为电泳过程中完全看不到，要和目标蛋白一起等到最后染色才―开蛊‖，无法对实验起预示参照作用。
人可溶性糖蛋白 130（sgp130;sCD130）酶联免疫分析(ELISA) 试剂盒使用说明书
人可溶性糖蛋白130（sgp130;sCD130）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆、组织等样本中可溶性糖蛋白130（sgp130;sCD130）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人可溶性糖蛋白130（sgp130;sCD130）水平。
用纯化的人可溶性糖蛋白130（sgp130;sCD130）捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入人可溶性糖蛋白130（sgp130;sCD130），再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的人可溶性糖蛋白130（sgp130;sCD130）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人可溶性糖蛋白130（sgp130;sCD130）含量。
注：标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、0 ng/mL.样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
基于网络药理学和实验探讨半夏-陈皮药对治疗卒中后抑郁的作用机制
基于网络药理学和实验探讨半夏-陈皮药对治疗卒中后抑郁的作用机制徐春悦,冀旭艳,卫治,李宝玲摘要目的:基于网络药理学和实验的方法探讨疏脑解郁汤中半夏-陈皮药对治疗卒中后抑郁的作用机制㊂方法:通过中医药系统药理学平台(TCMSP)数据库检索半夏㊁陈皮的主要化学成分及相关靶点,并结合相关文献对TCMSP所获得的有效成分进行补充㊂根据药物动力学筛选出中药活性组分;通过UniProt数据库进行靶点信息筛选;运用GeneCards㊁OMIM㊁DrugBank数据库获取卒中后抑郁的主要靶点;通过Cytoscape3.8.2软件构建 药物-成分-靶点 网络,通过STRING构建蛋白-蛋白互作(PPI)网络并挖掘网络中潜在的功能㊂通过Metascape平台进行基因本体(GO)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析,通过实验运用蛋白质印迹法对重要靶点进行验证㊂结果:共筛选出半夏㊁陈皮13个有效成分㊁118个作用靶点;卒中后抑郁相关靶点1366个㊂半夏㊁陈皮作用于卒中后抑郁的GO生物过程主要涉及细胞对有机环状化合物的反应㊁膜电位的调控㊁正调控细胞凋亡㊁离子运输的调节㊁对缺氧的反应;KEGG通路主要涉及癌症通路㊁血清素能突触㊁雌激素信号通路㊁环磷酸腺苷信号通路㊁神经活性配体-受体通路㊁内质网中的蛋白质加工㊁长寿调节途径㊁花生四烯酸代谢等㊂蛋白质印迹法结果显示:半夏-陈皮组与模型组比较,Bcl-2/Bax表达升高㊂结论:半夏-陈皮治疗卒中后抑郁通过多成分㊁多靶点㊁多通路的相互作用机制;半夏-陈皮可上调Bcl-2/Bax表达,正调控神经细胞凋亡进程㊂关键词卒中后抑郁;半夏-陈皮;网络药理学;作用机制;靶点d o i:10.12102/j.i s s n.1672-1349.2023.08.008The Mechanism of Pinellia-Tangerine Peel Drugs in the Treatment of Post-stroke Depression Based on Network Pharmacology and ExperimentsXU Chunyue,JI Xuyan,WEI Zhi,LI BaolingShanxi Provincial Institute of Traditional Chinese Medicine,Shanxi Traditional Chinese Medicine Hospital,Taiyuan030012,Shanxi, ChinaCorresponding Author LI Baoling,E-mail:159****************Abstract Objective:To explore the mechanism of pinellia-tangerine peel drugs in Shunao Jieyu Decoction in the treatment of post-stroke depression based on network pharmacology and experiments.Methods:The main chemical components and related targets of pinellia and tangerine peel were searched through Traditional Chinese Medicine Systematic Pharmacology Platform(TCMSP) database,and the active ingredients obtained from TCMSP were supplemented with relevant literature.The active components of Chinese medicine were screened according to pharmacokinetics.The target information was calibrated by UniProt database.The main targets of post-stroke depression were obtained using GeneCards,OMIM and DrugBank databases.The"drug-component-target" network was constructed by Cytoscape3.8.2software,and the protein-protein interaction(PPI)network was constructed by STRING and the potential functional panels in the network were mined.Gene Ontology(GO)biological processes and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathway analysis were carried out by Metascape platform,important targets were validated by protein Western Blot.Results:A total of13active ingredients and118action targets of pinellia and tangerine peel were screened,and1366 targets related to post-stroke depression were identified.The GO biological process of the action of pinellia-tangerine peel drugs in the treatment of post-stroke depression mainly involved cellular response to organic cyclic compounds,regulation of membrane potential, positive regulation of apoptosis,regulation of ion transport,and response to hypoxia.The KEGG pathway was mainly involved in the cancer pathway,serotonergic synapses,estrogen signaling pathway,cyclic adenosine phosphate signaling pathway,neuroactive ligand-receptor pathway,protein processing in the endoplasmic reticulum,longevity regulation pathway,and arachidonic acid metabolism.The results of protein Western Blot showed that compared with the model group,the expression of Bcl-2/Bax was increased in the pinellia-tangerine peel group.Conclusion:Pinellia-tangerine peel drugs in the treatment of post-stroke depression was through the interaction mechanism of multi-component,multi-target,and multi-pathway,which could up-regulate Bcl-2/Bax expression and positively regulate the process of neuronal apoptosisKeywords post-stroke depression;pinellia-tangerine peel;network pharmacology;mechanism of action;targets卒中后抑郁(post-strokedepression,PSD)是脑基金项目山西省重点研发计划项目(No.201803D31189)作者单位山西省中医药研究院,山西省中医院(太原030012)通讯作者李宝玲,E-mail:159****************引用信息徐春悦,冀旭艳,卫治,等.基于网络药理学和实验探讨半夏-陈皮药对治疗卒中后抑郁的作用机制[J].中西医结合心脑血管病杂志, 2023,21(8):1402-1408.卒中常见的并发症之一[1]㊂有研究表明,约33.33%的中风幸存者受卒中后抑郁的影响,导致卒中后抑郁病人自杀率较高[2]㊂目前的治疗药物存在价格昂贵㊁副作用显著等不足㊂因此,迫切需要寻找经济有效的中医药方法治疗卒中后抑郁㊂本课题组前期临床研究及动物实验均证实,疏脑解郁汤治疗卒中后抑郁有较好的疗效[3-4]㊂由于中药复方多成分㊁多靶点的调节作用,因此,疏脑解郁汤治疗卒中后抑郁的作用机制尚未明确㊂疏脑解郁汤是李宝玲主任针对卒中后抑郁病人气郁㊁痰阻㊁血瘀病机,临床应用多年的经验方,半夏-陈皮是疏脑解郁汤中理气化痰的代表药对㊂本研究基于网络药理学结合实验充分挖掘疏脑解郁汤中半夏-陈皮药对在分子水平多成分㊁多靶点对卒中后抑郁的整体调节作用,为疏脑解郁汤的实验研究及临床合理应用提供理论依据㊂1资料与方法1.1半夏㊁陈皮有效成分的收集与筛选通过中医药系统药理学平台(TCMSP,https:///)分别检索半夏㊁陈皮的化合物成分,并根据药物代谢动力学进行筛选,初步筛选出活性化合物及其作用的蛋白质靶点㊂筛选标准为口服生物利用度(OB)ȡ30%且类药性(DL)ȡ0.18㊂筛选结束后,统一在蛋白质数据库(UniProt,https://)将蛋白质靶点信息进行标准化,并参照文献报道补充未预测到的蛋白质靶点信息㊂1.2卒中后抑郁相关靶点筛选在人类基因数据库(GeneCards,https:///)㊁OMIM数据库()中以 post-stroke depression post stroke depression 为关键词进行检索,在DrugBank数据库(https://www.drugbank.ca)进行靶点补充㊂合并所有检索结果,删除重复值得到疾病靶点㊂1.3 药物-活性成分-靶点 网络构建将卒中后抑郁的靶点基因与半夏-陈皮成分靶点通过韦恩图获得半夏㊁陈皮主要活性成分作用于卒中后抑郁的预测靶点,利用Cytoscape3.8.2软件构建 药物-成分-靶点 网络㊂1.4蛋白-蛋白互作(PPI)网络构建与分析将筛选获得的潜在作用靶点输入STRING平台(https:// /),设置种属为 Homo Sapiens (人类),相互作用阈值设定为 highest confidence (>0.9),其余设置为默认值,得到PPI网络,并通过Cytoscape3.8.2中的MCODE插件对PPI网络进一步分析,得到潜在的蛋白质功能模块㊂1.5靶点富集分析利用Metascape平台对半夏-陈皮治疗卒中后抑郁相关靶点进行信号通路分析,将有效成分与疾病的交集靶点录入Metascape平台,设置P<0.01,分析主要的生物学过程与代谢通路并进行富集分析,保存数据结果并借助SangerBox网站(/)进行可视化分析㊂1.6实验验证1.6.1实验动物SD大鼠90只,雄性,无特定病原体(SPF)级,体质量(200ʃ20)g,购自北京斯贝福技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2019-0010㊂饲养环境:室温(22ʃ3)ħ,相对湿度45%~55%㊂1.6.2实验试剂与仪器Bax购自武汉三鹰公司,批号:00039968;Bcl-2购自Abcam公司,批号: GR249198-76;GAPDH购自生工生物工程有限公司,批号:GC14AA0011;二抗(Goat Anti-rabbit)购自BiOS 公司,批号:BJ08079044;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自Solarbio公司,批号20200918;二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自SEVEN公司,批号: 20191101;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)快速凝胶配置试剂盒购自SEVEN公司,批号:20200914;Buffer购自SEVEN公司,批号: 20191115;彩虹130广谱蛋白marker购自Solarbio公司,批号:917A021;脱脂奶粉购自Solarbio公司,批号:322R0515;等渗缓冲盐溶液(TBST)自制;电泳液自制;电转液自制㊂超敏电化学发光(ECL)检测试剂盒购自赛文SEVEN生物技术有限公司,批号: 20200904㊂双向电泳系统(PROTEANi12IEF Mini-PROTEAN Tetra PROTEAN11XL)购自美国Bio-Rad 公司;半干式转印系统(TRans-Blot SemiDry PowerPac Universal)购自美国Bio-Rad公司;高性能成像分析仪(HD2)购自美国ProteinSimple公司㊂1.6.3模型制备采用大脑中动脉栓塞(MCAO)+慢性不可预见温和应激(CUMS)进行卒中后抑郁模型构建,参照Zea longa线栓法[5]制作局灶性脑缺血后再灌注大鼠模型,术后1周,选取神经功能评分1~3分的大鼠,联合慢性不可预知性刺激建立卒中后抑郁模型㊂1.6.4分组及给药卒中后抑郁大鼠模型建立成功后,随机分为正常组㊁卒中后抑郁组㊁盐酸帕罗西汀组㊁半夏-陈皮组㊂随机分组后,连续灌胃28d,其中正常组㊁卒中后抑郁组给予生理盐水灌胃,给药剂量均为10mL/kg,每日1次㊂正常组㊁模型组灌胃生理盐水(10mL/kg);盐酸帕罗西汀组灌胃盐酸帕罗西汀溶液,剂量2mg/kg㊂疏脑解郁汤中半夏10g,陈皮10g,半夏-陈皮组以大鼠与人等效剂量的2倍予以0.42g/kg 给药,每日1次,连续灌胃28d㊂1.6.5观察指标给药结束后,进行组织取材,采用蛋白免疫印迹法检测相关蛋白㊂各组大鼠以10%水合氯醛(3mL/kg)腹腔注射麻醉,下腔静脉采血后,于冰袋上进行断头取脑㊂取出脑组织后,冰上剥离海马组织,置于1.5mL的EP管内,保存于-80ħ冰箱㊂根据BCA蛋白定量浓度,以总蛋白50μg进行上样㊂配制10%分离胶㊁5%浓缩胶㊂按照浓缩胶80V㊁分离胶120V的恒压条件电泳,待溴酚蓝到达胶底时停止电泳㊂按照25V㊁30min的条件进行半干转㊂使用含5%蛋白溶液封闭,4ħ冰箱过夜㊂封闭过夜后将膜取出,用TBST洗涤3次,每次10min㊂加入一抗4ħ冰箱过夜,回收一抗,TBST洗涤3次,加入二抗孵育1.5h㊂TBST洗涤3次,利用超敏化学发光试剂盒进行显色反应㊂最后,将PVDF膜置于高性能成像分析仪HD2系统进行曝光显影㊂2结果2.1半夏-陈皮活性成分靶点的获取初步提取半夏化学成分116种㊁陈皮化学成分63种,经药物代谢动力学筛选去重后获得靶点活性成分13种,其中半夏8种㊁陈皮5种,详见表1㊂半夏成分作用靶点83个㊁陈皮成分作用靶点61个,合并后删除重复值共得到靶点118个㊂表1半夏-陈皮主要活性成分中药MOL ID标记主要活性成分OB(%)血脑屏障(BBB)DL 半夏MOL002670BX1卡文定碱35.640.630.81 MOL001755BX224-乙基胆甾-4-烯-3-酮36.08 1.220.76MOL002714BX3黄芩素33.52-0.050.21MOL002776BX4黄芩苷40.12-1.740.75MOL000358BX5β-谷甾醇36.910.990.75MOL000449BX6豆甾醇43.83 1.000.76MOL000519BX7松柏苷;松苷31.11-0.180.32MOL006967BX8核糖呋喃烷苷㊁黄嘌呤-944.72-1.840.21陈皮MOL000359CP1谷甾醇36.910.870.75 MOL005815CP2柠檬酸86.900.160.51MOL005100CP35,7-二羟基-2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮47.74-0.300.27MOL004328CP4柚皮素59.29-0.370.21 MOL005828CP5川陈皮素61.67-0.080.522.2半夏-陈皮治疗卒中后抑郁核心靶点预测及筛选通过GeneCards数据库获得疾病靶点5423个㊂根据经验设定Score大于中位数的目标靶点为卒中后抑郁的潜在靶点,通过GeneCards得到卒中后抑郁靶点Score最大值为70.2,最小值为0.24,两次中位数筛选为4.73,故设定Score>4.73的靶点为卒中后抑郁的潜在靶点㊂结合OMIM㊁DrugBank数据库补充相关靶点,合并后删除重复值,最终得到1366个卒中后抑郁相关靶点㊂通过Venny(b.csic.es/ tools/venny/index.html)在线工具,绘制半夏-陈皮与卒中后抑郁相关靶点的韦恩图,详见图1㊂图1半夏-陈皮与卒中后抑郁相关靶点韦恩图2.3 药物-活性成分-靶点 网络分析网络中包含133个节点,其中药物节点2个㊁活性化合物节点13个㊁靶点节点118个,网络中圆形代表药物,菱形代表基因,六边形代表化合物活性成分,菱形代表靶基因㊂在网络中,每条边表示节点与节点之间的互作关系[6]㊂运用Cytoscape中的 Network analyze 进行度值分析,度值表示节点与其他节点的连接数目㊂根据活性化合物成分和靶点的中心度值大小进行筛选,排名居前5位的分别为MOL002670卡文定碱㊁MOL004328柚皮素㊁MOL000358β-谷甾醇㊁MOL005828川陈皮素㊁MOL000449豆甾醇㊂在靶点中,排名居第1位的是雌激素受体1(ESR1),其余靶点包括凋亡蛋白(Bax)㊁抗凋亡蛋白(Bcl-2)㊁雄激素受体(AR)㊁半胱氨酸天冬酶-3 (Casp3)㊁半胱天冬蛋白酶-9(Casp9)㊁癌基因(JUN)㊁嘌呤核苷酸磷酸化酶(PNP)㊁细胞周期蛋白A2 (CCNA2),详见图2㊂图2药物-活性成分-靶点网络图2.4半夏-陈皮治疗卒中后抑郁靶点PPI网络的构建将半夏㊁陈皮活性成分靶点与卒中后抑郁靶点取交集,进而将交集靶点提交至STRING平台,得到PPI 网络,详见图3㊂利用Cytoscape3.8.2中的MCODE 插件,通过分子复合物检测算法分析相互作用关系,得到模块(module)㊂module是PPI网络的潜在子网,连线密度较高,是密度较高的部分[6]㊂因此,module被认为是具有生物学意义的集合,有必要进一步识别内在module㊂详见图4㊂图3半夏-陈皮与卒中后抑郁靶点PPI网络图图4半夏-陈皮与卒中后抑郁靶点PPI网络中的module2.5富集分析通过Metascape平台进行基因本体(GO)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析㊂设置P<0.01,主要的生物过程包括细胞对有机环状化合物的反应㊁膜电位的调控㊁正调控细胞死亡㊁离子运输的调节㊁对缺氧的反应㊁脂质代谢过程的调节㊁磷脂酶C激活G蛋白偶联受体信号通路㊂详见图5㊂图5GO生物过程富集分析柱状图对代谢通路进行富集分析,结果显示,主要的通路涉及癌症通路㊁血清素能突触㊁雌激素信号通路㊁环磷酸腺苷(cAMP)信号通路㊁神经活性配体-受体通路㊁内质网中的蛋白质加工㊁长寿调节途径㊁花生四烯酸代谢等㊂利用气泡图对富集基因数排名居前20位的通路进行可视化分析㊂纵轴表示通路名称,横轴表示富集因素百分比,气泡大小表示富集在该通路的基因数目㊂详见图6㊂图6KEGG通路富集分析气泡图2.6蛋白免疫印迹法结果分析蛋白免疫印迹法结果显示:相较于正常组,模型组Bax表达升高,Bcl-2表达减少;相较于模型组,盐酸帕罗西汀组㊁半夏-陈皮组Bax表达减少,Bcl-2表达升高,Bcl-2/Bax上调㊂详见图7㊂图7各组Bax、Bcl-2蛋白表达条带图(A为正常组;B为模型组;C为盐酸帕罗西汀组;D为半夏-陈皮组)3讨论半夏㊁陈皮作用于卒中后抑郁的主要活性成分包括卡文定碱㊁柚皮素㊁β-谷甾醇㊁川陈皮素㊁豆甾醇㊂相关研究表明,柚皮素通过抑制氧化应激介质和核转录因子(NF)-κB/脑源性神经营养因子(BDNF)表达,改善反复低氧应激小鼠的抑郁行为[7]㊂Wang等[8]研究发现,川陈皮素通过AMP依赖性蛋白激酶(AMPK)途径促进自噬,改善NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 (NLRP3)炎症小体介导的炎症,调控抑郁症㊂本研究KEGG分析涉及的通路主要包括癌症通路血清素能突触㊁雌激素信号通路㊁环磷酸腺苷(cAMP)信号通路㊁神经活性配体-受体通路等,结合前期研究结果[9],说明疏脑解郁汤调控卒中后抑郁的机制与cAMP/BDNF通路有关㊂本课题组前期免疫组化实验发现,与正常组比较,模型组BDNF表达降低,差异有统计学意义;与模型组比较,疏脑解郁汤组BDNF 表达升高,差异有统计学意义[9]㊂疏脑解郁汤高剂量组可显著提高卒中后抑郁大鼠学习记忆能力,改善卒中后抑郁大鼠抑郁症状,对卒中后抑郁大鼠海马组织损伤具有保护作用[10]㊂cAMP/蛋白激酶A(PKA)/磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)/BDNF通路在学习记忆中发挥着重要的作用㊂突触后神经元钙离子浓度增加可激活腺苷酸环化酶,引起PKA活化[11-12]㊂cAMP可使丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)被运送到细胞核,之后CREB引起下游靶基因BDNF表达,从而影响原始突触的生长和新的突触形成,进而影响学习记忆[13-15]㊂GO生物过程富集分析显示半夏-陈皮具有正调控细胞凋亡的作用㊂相关研究表明,卒中后抑郁的发生发展与神经细胞凋亡密切相关,慢性应激通过促进神经元细胞凋亡,减少突触联系,最终导致抑郁样行为发生[16-18]㊂另有研究显示,橙皮苷通过上调抑凋亡蛋白Bcl-2和下调促凋亡蛋白Bax表达,抑制氯化铝诱导的阿尔茨海默病大鼠神经细胞凋亡[19]㊂BDNF 前体通过调控额前皮质凋亡信号影响脑卒中后抑郁大鼠行为[20]㊂PPI网络中密度较高的module显示,Bax㊁Bcl-2是半夏㊁陈皮调控卒中后抑郁的重要靶点,因此,对Bax㊁Bcl-2进行实验证实显得尤为重要㊂中药复方具有多成分㊁多靶点的作用特点,充分挖掘疏脑解郁汤干预卒中后抑郁的作用机制,采用药对形式进行研究㊂疏脑解郁汤中除了半夏㊁陈皮药对,还有活血化瘀㊁宁心安神类药对,复方成分靶点网络更复杂,仍需进一步开展研究㊂综上所述,半夏㊁陈皮药对作为疏脑解郁汤的主要理气化痰药对,可上调Bcl-2/Bcl-2比例,正调控细胞死亡进程,预测疏脑解郁汤调控卒中后抑郁的作用机制与改善神经细胞凋亡有关㊂参考文献:[1]王少石,周新雨,朱春燕.卒中后抑郁临床实践的中国专家共识[J].中国卒中杂志,2016,11(8):685-693.[2]王梅杰,邓雨芳,周翔,等.加拿大‘最佳实践建议:卒中后抑郁㊁认知㊁疲劳“解读[J].中国全科医学,2021,24(17):2214-2217. 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PH0304 宽分子量蛋白Marker10-200kD使用手册
1PH0304|宽分子量蛋白Marker (10-200kD)Catalog No ：PH0304Size ：☐20T (100ul)Storage ：Store@-20℃
◆简介
本产品包含14种蛋白质混合物，分子量范围为10kD-200kD，经过SDS-PAGE 电泳，用考马斯亮蓝染色后可以得到14条带，可以用来判断SDS-PAGE 电泳后蛋白质的分子量。
◆保存
Store at -20℃；有效期12个月
◆使用参考
a 第一次收到该产品，室温融化后，彻底混匀，离心快甩将溶液完全收集到管底，根据需要适量分装成小管，-20℃贮存，每次取一小管使用。
b 取出分装后的Marker，常温融化，轻柔彻底混匀，管底不能见沉淀物。
注：此Marker 为即用型，溶化后直接上样，不要95℃处理！
c 上样量根据胶的厚度和梳子的宽度确定。
一般说来，0.75mm×5mm（厚度×宽度）的加样孔上样5μl，其他规格梳子请适当调整上样量。
注：使用银染时，由于灵敏度高于考马斯亮蓝染色方法，可以适当降低Marker 上样量。
d 电泳结束后，染色，观察结果。
电泳结果如出现带型缺失现象或样品聚集在分离胶上沿，可在Marker 中加入终浓度为100mM 的DTT 后再上样。
12%分离胶电泳示意图
梳子尺寸：0.75mm*5mm
上样量：5ul。
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彩虹130广谱蛋白marker说明书
货号：PR1950
规格：20T(100μL)/50T(250μL)/100T(250μL×2)/500T(250μL×10)
保存：-20℃保存，有效期至少2年。
产品特点：
●三色预染，颜色鲜亮，条带整齐，便于观察。
●用量少，节约成本，仅5ul即可完美呈现（1.5mm，10孔梳）。
●广谱多带，一支即可满足多种实验需求。
产品简介：
本产品包含9种彩色预染的已知分子量标准蛋白，分子量范围为15kD-130kD，每种蛋白含量约为
0.2-0.4mg/ml。
预染marker可以用于直接观察蛋白质电泳状况以及清晰地判断Western Blot的转膜效果。
经SDS-PAGE凝胶电泳或转移到PVDF或NC膜上可得到清晰的9条彩色蛋白条带，其中70kD条带为红色，25kD条带为绿色，其余条带为蓝色。
使用说明：
1.本产品是即用型液体，可直接上样电泳。
上样前无需加热，稀释或添加还原剂。
2.上样5ul，SDS-PAGE电泳过程及转膜后可看见清晰的彩虹条带。
3.建议分离胶浓度为15%。
电泳示意图说明：
第1页，共2页
第2页，共2
页注意事项：
1.本产品含有较高浓度甘油，常规-20℃保存为液体状态，可直接使用。
若冰箱温度不稳，导致结冰，可
适当分装后置于4℃保存，至少稳定6个月。
2.Marker分离效果与PAGE胶浓度相关，若分离胶浓度低于15%，25kD以下条带不易分离，但不影响绿色
（25KD）及以上条带。
如果目的条带小于25KD，建议分离胶浓度大于或等于15%。
3.转膜效果与转膜时间有关，需根据客户目的条带大小而定，如果转膜后较大分子量条带有部分未转膜
成功，属于正常现象。