彩虹245广谱蛋白marker使用说明
宽范围彩色预染蛋白质Marker说明书
Pre-stained Protein Marker (Multicolor Broad Range)
100 μl (20 lanes)
Order: 021-60520536 Shanghai DuMa Biological Technology Co., Ltd.
本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。
Pre-stained Protein Marker (Multicolor Broad Range) 宽范围彩色预染蛋白质 Marker 11- 245 kDa
目 录 号: DM206 储存条件: 4℃（长期保存请置于-20℃） 浓 度: 每种蛋白约 0.1-0.4 μg/μl 产品内容:
宽范围彩色预染蛋白质 Marker
产品简介
本产品包含 12 种预染的蛋白质分子量标准，分 子量范围为 11-245 kDa，其中 75 kDa 蛋白条带为红 色 ，25 kDa 蛋 白条 带为 绿色 ，其 它蛋 白条 带为 蓝 色。 可通过此预染蛋白 Marker 直接观察蛋白电泳及 清晰地 判断 Western Blot 的转移效果。
电泳条件
凝 胶浓 度 为 12-15 ％ SDS-PAGE ，120-200 V 电 泳 30-50 min（Mini 电泳装置）。
注意事项
1. 电泳时间过长将导致蛋白条带发散现象。 2. 不适合rker
11-245 kDa
kDa 245.0 180.0 135.0 100.0 75.0 63.0
1× Transfer buffer(干转): 5.8 g Tris.base (48 mM)，2.9 g Glycine (39 mM) ，0.37 g SDS，20％ 甲醇，用 ddH2O 定容至 1 L。
蛋白标准品（Marker）知识汇总
蛋白Mark er可分为：一、未预染的Ma rker即宽分子量蛋白标准、高分子量蛋白标准以及低分子量蛋白标准;二、预染的Mar ker即单色预染和多色预染。
在wester n blot 过程中，分子量Mar ker就像个螺丝钉一样没虽然是个小细节，然而就是这样一个小细节对实验结果有着不可忽视的作用。
这个 Wester n Blot 参照家族的一员的作用主要是用来指示蛋白条带所对应的分子量大小，只有标准量精确无误了，实验结果才有说服力，除此之外，蛋白标准还有表示转移成功或者蛋白在凝胶上的电泳程度等等的作用，所以选择正确的蛋白Ma rker也是west ern blot实验成功的必要条件之一。
总体来说，蛋白分子量标准可以分成未染蛋白分子量标准、预染蛋白分子量标准二个级别。
以下是关于蛋白分子量标准的小叙：一. 未染色(pre mixed)蛋白分子量标准未染色的蛋白分子量标准是最简单，也是最准确的一种。
由于没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，是精确判断蛋白大小必须的。
现在的Mar ker多数都选用预混和的Mar ker，方便不同大小的蛋白比较。
预混的Mar ker通常有几条带加倍浓度作为指示，因为混合的条带越多，越不好记，谁知道哪条是那条!数到眼都花了。
所以当看到特别浓的那几条标志带就记得是哪里了。
不过要记得，小带通常都不那么容易看清楚的。
在选择上来说，当然是选择其中至少有一条条带和自己的目的蛋白大小相近的最好，越近越好。
如果你的蛋白不幸在两条跨度较大M arker条带之间，选别的Mar ker吧。
预混的Mar ker 使用上不如预染Marke r(pre-staine d)好用，因为电泳过程中完全看不到，要和目标蛋白一起等到最后染色才―开蛊‖，无法对实验起预示参照作用。
彩虹245广谱蛋白marker说明书
彩虹245广谱蛋白marker说明书货号：PR1920规格：20T (100μ1)/50T(250μ1) /100T(250μ1×2) /500T(250μ1×10)保存：-20℃保存，有效期至少2年。
产品特点：▪三色预染，颜色鲜亮，条带整齐，便于观察。
▪稳定性能突出，经检测4℃放置两年无明显降解。
▪用量少，节约成本，仅5ul即可完美呈现（1.5mm，10孔梳）。
▪广谱多带，一支即可满足多种实验需求。
产品简介：本产品包含12种彩色预染的已知分子量标准蛋白，分子量范围为11kD-245kD，每种蛋白含量约为0.2-0.4mg/ml。
预染marker可以用于直接观察蛋白质电泳状况以及清晰地判断Western Blot的转膜效果。
经SDS-PAGE凝胶电泳或转移到PVDF或NC膜上可得到清晰的10条彩色蛋白条带，其中25kD为绿色条带，75kD为红色条带，其余10条是蓝色条带。
使用说明：1. 本产品是即用型液体，可直接上样电泳。
上样前无需加热，稀释或添加还原剂。
2. 上样5ul，SDS-PAGE电泳过程及转膜后可看见清晰的彩虹条带。
3. 建议分离胶浓度为15% 。
电泳示意图说明：彩虹245广谱蛋白marker经15%浓度的SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至PVDF膜上。
注意事项：▪本产品含有较高浓度甘油，常规-20℃保存为液体状态，可直接使用。
若冰箱温度不稳，导致结冰，可适当分装后置于4℃保存，至少稳定6个月。
▪Marker分离效果与PAGE胶浓度相关，若分离胶浓度低于15%，25kD以下条带不易分离，但不影响绿色（25KD）及以上条带。
如果目的条带小于25KD，建议分离胶浓度大于或等于15%。
▪转膜效果与转膜时间有关，需根据客户目的条带大小而定，如果转膜后较大分子量条带有部分未转膜成功，属于正常现象。
相关产品：P10154×蛋白上样缓冲液（含DTT）A101030%丙烯酰胺(29:1)P1300-1SDS-P AGE凝胶制备试剂盒T10705×Tris-甘氨酸电泳缓冲液D106010×电泳转移缓冲液PR1910彩虹180广谱蛋白markerPR1700 预染次高分子量蛋白markerSW3010膜封闭液DA1010DAB显色试剂盒（20×）PE0010ECL Plus荧光检测试剂(ECL超敏发光液)。
marker说明书
CERTIFICATE OF ANALYSISPageRuler ™Prestained Protein Ladder#SM067210 x 250 µl(for 100 mini gel applications 5 µl per well or 50 large gel applications 10 µl per well)Lot: Expiry Date:Storage: stable at 4°C for up to 3 months. For long term storage, store at -20°C.SM067_57_9.docDescriptionPageRuler ™Prestained Protein Ladder is a mixture of 10 recombinant, highly purified colored proteins with apparent molecular weights of 10 kDa to 170 kDa. Ladder proteins are covalently coupled with a blue dye except for two reference bands prestained with different colors. The 72 kDa reference band is orange and 10 kDa reference band is green.The ladder is supplied in gel loading buffer and isready-to-use: no heating, further dilution or addition of a reducing agent is required.ContentsApproximately 0.1-0.2 mg/ml of each protein in the storage buffer (62.5 mM Tris-H 3PO 4 (pH 7.5 at 25°C), 1 mM EDTA, 2% (w/v) SDS, 10 mM DTT, 1 mM NaN 3 and 33% (v/v) glycerol).Applications∙ Monitoring of protein separation during SDS-PAGE (1). ∙ Verifying Western transfer efficiency (2, 3).∙ Approximate sizing of proteins on SDS-polyacrylamidegels and Western blots.Instruction for Use❶ Thaw the ladder at room temperature for a few minutes to dissolve precipitated solids. DO NOT BOIL!❷ Mix gently, but thoroughly, to ensure the solution is homogeneous.❸ Load the following volumes of the ladder on an SDS-polyacrylamide gel:– 5 µl per well for mini gel,– 10 µl per well for large gel.Use the same volumes for Western blotting.❹ After the run is complete, stain the gel or perform Western transfer procedure as desired.Note•Each lot of the PageRuler™ Prestained Protein Ladder is calibrated against a precisely sized, PageRuler™ Unstained Protein Ladder and calculated apparent molecular weights are reported in the picture.•For precise molecular weight determinations use PageRuler™ Unstained Protein Ladder, #SM0661, see.•In 8 or 10% gels low molecular weight proteins may migrate with the dye front.•Loading volumes are intended for use in gels with a thickness of 0.75 mm. For thicker gels, the recommended loading volume should be increased.•PageRuler™ Prestained Protein Ladder could be used in Western blotting with all common membranes: PVDF, nylon and nitrocellulose.•Longer transfer times or higher transfer voltages may be required for Western blotting of large (>100 kDa) proteins.Lot specific MW, kDa4-20% Tris-glycine SDS-PAGEcontinued on back pageQUALITY CONTROL5 µl of PageRuler™ Prestained Protein Ladder resolves 10 bands of equal intensities in 4-20% SDS-PAGE (Tris-glycine buffer) and after Western blotting onto PVDF membrane.Quality authorized by: Jurgita Zilinskiene References1. Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685, 1970.2. Burnette, W.N., "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A, Anal. Biochem., 112 (2), 195-203, 1981.3. Towbin, H., et al., E lectrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354, 1979.This product is manufactured under the license forStrep-tag® technology covered by US patents Nos.5,506,121, 6,103,493 and foreign counterparts. Related Products∙DualColor™ Protein Loading Buffer Pack #R1011∙Loading Buffer Pack #R0891∙Spectra™ Multicolor Broad Range Protein Ladder #SM1841∙PageRuler™ Unstained #SM0661∙PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder #SM1811∙PageSilver™ Silver Staining Kit #K0681∙PageBlue™ Protein Staining Solution #R0571∙10X Tris-glycine-SDS Buffer #B46∙10X Tris-tricine-SDS Buffer #B48∙DTT #R0861 ∙ProteoJET™ Mammalian Cell Lysis Reagent #K0301∙ProteoJET™ Cytoplasmic and Nuclear ProteinExtraction Kit #K0311∙Bradford Reagent, ready-to-use #R1271∙Bovine Serum Albumin Standard Set, ready-to-use #R1281∙Bovine Gamma Globulin Standard Set, ready-to-use #R1291PRODUCT USE LIMITATION.This product is developed, designed and sold exclusively for research purposes andin vitro use only. The product was not tested for use in diagnostics or for drugdevelopment, nor is it suitable for administration to humans or animals.Please refer to for Material Safety Data Sheet of the product.。
TaKaRa 蛋白质分子量标准(低)
∙o Protocolso Standard Protocolo Manual/Datasheet∙Cat.# Product Size Note3450 Protein Molecular Weight Marker (Low) 200 lanes3451 Protein Molecular Weight Marker (High) 200 lanes3452 Protein Molecular Weight Marker (Broad) 200 lanesDescriptionProtein Molecular Weight Markers are designed for use in SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis. There are 3 kinds of Protein Molecular Weight Marker, Low (Molecular weight range : 14.3 - 97.2 kDa) , High (Molecular weight range : 44.3 - 200 kDa) and Broad (Molecular weight range : 6.5 - 200 kDa).Each protein is proportioned to yield uniform band intensities when perform staining Coomassie Brilliant Blue R-250 after run on SDS polyacrylamide gel.5µl of 20-fold diluted marker is loaded per lane of SDS-PAGE minigel for standard use. In this case, this marker is sufficient for 200 lanes.Electrophoresis ResultLow(Cat.# 3450) High(Cat.# 3451) Broad(Cat.# 3452)15% SDS-PAGE 7.5% SDS-PAGE 5-20% gradientSDS-PAGEStorageProtein Molecular Weight Marker, 1 MDTT: -20°C5×Loading Buffer : Store at room temperature after used.ComponentProtein Molecular Weight Marker 50 µl5×Loading Buffer1 ml1 M DTT 100 µlConcentration12 µg/µl (Cat.# 3450) 10 µg/µl (Cat.# 3451) 18 µg/µl (Cat.# 3452)Form50 mM Tris-HCl, pH6.81 mM EDTA200mMNaCl50% glycerolComponent Protein Low(Cat.# 3450)Protein Source M.W.(Da)Phosphorylase B Rabbitmuscle97,200Serum Albumin Bovine 66,409Ovalbumin Hen eggwhite44,287Carbonic Bovine 29,000anhydraseTrypsin Inhibitor Soybean 20,100Lysozyme Hen eggwhite14,300High(Cat.# 3451)Protein Source M.W.(Da)Myosin Pig 200,000 β-galactosidaseE. coli116,000Phosphorylase B Rabbitmuscle97,200SerumAlbuminBovine 66,409Ovalbumin Hen eggwhite44,287Broad(Cat.# 3452) < /TR>Protein Source M.W.(Da)Myosin Pig 200,000 β-galactosidase E. coli116,000 Phosphorylase B Rabbit muscle 97,200 Serum Albumin Bovine 66,409Ovalbumin Hen eggwhite44,287CarbonicanhydraseBovine 29,000 Trypsin Inhibitor Soybean 20,100Lysozyme Hen eggwhite14,300Aprotinin Bovinepancreas6,5005×Loading Buffer200 mM Tris-HCl , pH6.810% SDS 0.05%BPB50% GlycerolNote∙All products are intended to be used for research purpose only. They are not to be used for drug or diagnostic purposes, nor are they intended for human use. They shall not to be used products as food, cosmetics, or utensils, etc∙Takara products may not be resold or transferred, modified for resale or transfer, or used to manufacture commercial products without written approval from TAKARA BIO INC.∙If you require licenses for other use, please call at +81 77 543 7247 or contact from our website at ∙Please confirm the content about the license or patent used in this document that relates to the Takara Bio product by clicking the license mark.Moreover, please confirm the "Limited Use Label License" or "patent" concerning the product of another manufacturers or respective owners in their Web site/catalog etc.Page TOP。
蛋白marker标记颜色方法
蛋白marker标记颜色方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：蛋白marker标记颜色方法在生物科学研究中，标记蛋白是非常常见的实验技术之一。
蛋白marker的标记可以帮助研究人员在实验中追踪和定位蛋白，从而更好地理解蛋白的功能和相互作用。
而标记蛋白的颜色选择也是非常重要的，不同颜色的标记能够帮助实验者在实验过程中更清晰地识别和分析样品。
本文将介绍一些常用的蛋白marker标记颜色方法，希望能够帮助读者更好地进行蛋白标记实验。
一、荧光标记荧光标记是蛋白标记颜色中最常用的方法之一。
通过将蛋白与荧光物质结合，可以在光学显微镜下直接观察到蛋白标记的颜色。
常用的荧光标记包括FITC（荧光异硫氰酸酯），TRITC（罗丹明异硫氰酸酯）和Cy5（Cyanine5）。
这些荧光物质在实验中常用于免疫荧光染色、融合蛋白标记等实验中。
荧光标记的优势是信号强度高、灵敏度高且不受环境影响，适用于单细胞和组织的标记。
在实验中，荧光标记的颜色可以根据荧光物质的不同而有所区分。
比如，FITC标记的蛋白呈现绿色，TRITC标记呈现橙红色，Cy5标记呈现红色。
实验者可以根据实验需要选择不同的荧光标记物质，并通过显微镜观察到标记蛋白的颜色。
二、生物素标记生物素标记是一种基于生物素-亲和素相互作用的蛋白标记方法。
生物素是一种维生素H成分，具有与亲和素结合的特性。
在实验中，生物素可以与生物素素结合并形成稳定的结合物，从而实现蛋白的标记。
生物素标记的颜色在实验中常表现为紫色，实验者可以通过观察颜色变化来判断蛋白是否标记成功。
生物素标记的优势是其结合力强、稳定性高，适用于长时间的实验操作。
另外，生物素标记也可以用于有机溶剂、高温、酸碱环境等多种条件下的蛋白标记。
因此，在一些特殊实验条件下，生物素标记是一种非常理想的标记方法。
三、酶标记酶标记是另一种常用的蛋白标记方法。
通过将蛋白与酶结合，可以在实验中通过酶的催化作用来识别蛋白的存在。
常用的酶标记包括辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
干燥温度对风干牛肉贮藏期间品质及蛋白质降解的影响
干燥温度对风干牛肉贮藏期间品质及蛋白质降解的影响李宇辉;吴师师;王瑞;王俊钢;李应彪【摘要】为研究干燥温度对风干牛肉贮藏期品质及蛋白质降解的影响,本研究以新疆褐牛后腿肉为原料,采用不同干燥温度对脉动压力腌制后的牛肉进行干燥(30℃,50 h;40 ℃,20 h;50℃,12 h;60℃,8h)、冷却、真空包装后,置于-4℃冰箱中贮藏(0、3、6、9、15、21 d),研究干燥温度对风干牛肉贮藏期间品质及蛋白质降解情况的影响.结果表明,随着贮藏时间的延长,不同温度下水分含量逐渐减少(p＜0.05);蒸煮损失率先增大后逐渐减小,然后再逐渐增大;不同干燥温度下,水分含量和蒸煮损失率均为30℃＞40℃＞50℃＞60 ℃;贮藏末期50℃干燥的牛肉气味、口感和总体可接受性最高,60℃口感、滋味和总体接受性最低(p＞0.05);弹性在整个贮藏期内变化不显著(p＞0.05).肌原纤维蛋白羰基含量显著增加(p＜0.05),其中干燥温度为60℃时,增加趋势最大;总巯基含量显著减少(p＜0.05),其中干燥温度为60℃时,减少趋势最大;十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)结果表明,30、40、50℃的风干牛肉肌原纤维蛋白条带在贮藏第15 d降解作用增强,而60℃的蛋白质在第9d降解作用增强.综上,干燥温度为50℃时,蛋白质的降解程度较低,能更好地保持风干牛肉整个贮藏期的品质.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)022【总页数】7页(P63-69)【关键词】脉动压;风干牛肉;干燥温度;蛋白质降解【作者】李宇辉;吴师师;王瑞;王俊钢;李应彪【作者单位】新疆农垦科学院农产品加工重点实验室,新疆石河子832000;新疆农垦科学院农产品加工研究所,新疆石河子832000;石河子大学食品学院,新疆石河子832000;石河子大学食品学院,新疆石河子832000;新疆农垦科学院农产品加工重点实验室,新疆石河子832000;新疆农垦科学院农产品加工研究所,新疆石河子832000;石河子大学食品学院,新疆石河子832000【正文语种】中文【中图分类】TS251.5+2风干牛肉是我国新疆地区极具民族特色的肉制品之一。
低分子量蛋白质Marker(14.4kD-97.4kD)使用说明
低分子量蛋白质Marker（14.4kD-97.4kD)使用说明货号：PR1400规格：20T保存：-20℃可保存至少一年。
避免反复冻融，建议分装保存。
产品简介：低分子量蛋白质Marker包含6种蛋白质混合物的冻干粉，分子量范围为14.4kD-97.4kD，每种蛋白的含量约为20-30μg。
经过SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）电泳后，用考马斯亮蓝染色可以得到分布均匀密度相近的6条带。
可以用来判断SDS-PAGE电泳后蛋白质的分子量。
使用说明：1.开封后，溶于400µL体积的1×蛋白上样缓冲液（含巯基还原剂），于沸水浴中加热5分钟，冷却后可根据需要进行小量分装，每管20µL，-20℃贮存，每次取一管使用。
2.如长期贮存后使用，使用前最好取分装后的小管沸水浴预热3-5分钟后再上样电泳，用考马斯亮蓝G-250染色后可见6条蛋白带(见下示意图)。
注意事项：1.建议分离胶浓度12%，浓缩胶浓度5%，制胶时先配制分离胶，聚合后再配制浓缩胶。
电泳时，80v电压大约跑1小时后，待指示剂沿到达分离胶上沿时，将电压调至120v，直到电泳结束。
整个电泳过程大约需3-4个小时。
2.电泳之后可将胶进行染色观察，如果使用配方进行染色时效果不好或考虑其毒性，请选择考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液，该试剂具有染色快，无毒，灵敏性高等特点，是常规染色液的替代品。
相关试剂：P10154×蛋白上样缓冲液（含DTT）P10164×蛋白上样缓冲液（含巯基还原剂）T10705×Tris-甘氨酸电泳缓冲液P1300-1SDS-PAGE凝胶制备试剂盒P1300-500考马斯亮蓝快速染色液。
KCNQ1OT1基因敲除联合鸦胆子素D对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移及侵袭的影响
doi:10.3971/j.issn.1000-8578.2023.23.0456KCNQ1OT1基因敲除联合鸦胆子素D 对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移及侵袭的影响龙凤1,2,3，赵玉1﹡，黄勇1，刘晓燕1，周旋1，李雪1，叶海琳1Effects of KCNQ1OT1 Gene Knockout Combined with Bruceine D on Proliferation, Migration, and Invasion of Breast Cancer MDA-MB-231 CellsLONG Feng 1,2,3, ZHAO Yu 1*, HUANG Yong 1, LIU Xiaoyan 1, ZHOU Xuan 1, LI Xue 1, YE Hailin 1 (*: Contributed Equally as the First Author)1. School of Basic Medicine, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China;2. Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Prevention and Treatment of Chronic Diseases in Gansu Provincial (Cultivation Base), Lanzhou 730000, China;3. Provincial Key Laboratory of Molecular Medicine and Chinese Medicine Prevention and Control of Major Diseases in Universities of Gansu Province, Lanzhou 730000, ChinaAbstract: Objective To explore the effect of KCNQ1OT1 gene knockout combined with bruceine D on the proliferation, migration, and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells. Methods Cell Counting Kit-8, wound healing, and Transwell invasion assay were used to detect the effects of bruceine D and siKCNQ1OT1 on the viability, migration, and invasion of MDA-MB-231 cells. Effect of bruceine D and siKCNQ1OT1 on the expression of KCNQ1OT1 in MDA-MB-231 cells was detected by qRT-PCR. Western blot was used to detect the effect of bruceine D and siKCNQ1OT1 on the expression of EMT-related proteins and CDC42, p-MKK7, MKK7 proteins in MDA-MB-231 cells. Results Bruceine D and siKCNQ1OT1 could significantly inhibit the viability, migration, and invasion of MDA-MB-231 cells, and the inhibitory effect was enhanced when they were combined (all P <0.05); bruceine D downregulated the expression of KCNQ1OT1 in MDA-MB-231 cells (all P <0.05); bruceine D combined with siKCNQ1OT1 significantly decreased CDC42, p-MKK7, N-cadherin, and Vimentin expression in MDA-MB-231 cells and increased the expression of E-cadherin (all P <0.05). Conclusion Bruceine D combined with siKCNQ1OT1 significantly inhibit the proliferation, migration, invasion, and EMT of human breast cancer MDA-MB-231 cells, and its molecular mechanism may be related to the blocking of CDC42/MKK7 signaling pathway.Key words: Breast cancer; Bruceine D; KCNQ1OT1; Migration; InvasionFunding: Gansu Province’s “Double First Class” Scientific Research Key Project (No. GSSYLXM-01); Gansu Province Higher Education Innovation Fund (No. 2021A-078); Education Unveiling and Leadership Project (No. 2021jyjbgs-03)Competing interests: The authors declare that they have no competing interests.摘 要：目的 探讨KCNQ1OT1基因敲除联合鸦胆子素D 对乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响及其机制。
WesternBlotMarker使用说明
WesternBlotMarker使用说明Western Blot Marker使用说明货号：PR1800规格：10T(50μl)/20T(100μl)保存：-20℃可保存2年。
避免反复冻融，建议分装保存。
产品简介:Western Blot Marker是专门为Western Blot试验设计的分子量标准。
传统的Western Blot 试验需要使用预染蛋白Marker来跟踪检测阳性抗原信号和转膜效率。
但预染蛋白Marker用在Western Blot 试验中有三大缺点：（1）预染蛋白Marker无法在胶片上曝光，曝光信号需要根据膜上的预染蛋白Marker来判断，因此后续的图片需要拼接才能两者合而为一；（2）预染蛋白Marker都经过化学修饰，经过化学修饰的蛋白在SDS-PAGE电泳过程中迁移率发生改变，分子量信息不再准确，往往导致Western Blot结果判断出现较大偏差；（3）预染蛋白Marker 无法检测作为杂交过程的阳性对照。
Western Blot Marker由7种不同分子量的蛋白组成（19、20、35、45、60、65、110KDa），其中19、45、65KDa条带为蓝色预染marker，其它四个条带都可与人、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、兔的IgG恒定区结合。
Western Blot Marker可以直接结合二抗，或通过结合一抗间接结合二抗，因此蛋白Marker就能与抗原在同一张胶片上曝出信号，阳性信号可以直接通过Western Blot Marker的位置来判断。
另外，预染发光Western Blot Marker还可作为Western Blot试验的阳性对照。
使用说明:1.取出后于室温放置融化；2.温和地充分混匀，取5μl该Western Blot Marker至上样孔中，进行SDS-PAGE电泳。
3.电泳完毕后转至PVDF膜或NC膜，与一抗二抗孵育。
4.孵育完毕，将Western Blot Marker与抗原一起通过ECL曝光至胶片。
PH0307 彩虹预染超低分子量蛋白Marker (1.2-45KD)使用手册
PH0307|彩虹预染超低分子量蛋白Marker(1.2-45KD)(Rainbow Prestained Ultra Low Molecular Weight Protein Marker)Catalog No：PH0307Size：☐50ul Store at-20℃◆简介彩虹预染超低分子量蛋白质Marker可以直接观察蛋白电泳及清晰判断Western Blotting的转膜效果。
本产品包含3种多肽和3种低分子量蛋白质组成，分子量范围为 1.2kD-45kD，分子量大小为1.2kD，4.6kD，10kD，16kD，27kD，45kD(注：蛋白大小已在18%Tricine-SDS-PAGE中用非预染蛋白Marker标定过)。
◆保存-20℃保存，开封后有效期12个月◆使用参考1.超低分子量多肽的蛋白电泳较常规的蛋白电泳更为复杂，请仔细参阅说明书后再进行操作。
2.第一次收到产品后，室温彻底融化混匀，离心快甩将溶液收集到管底，根据需要适量分装，-20℃贮存，每次使用时取一管使用。
3.本蛋白Marker为即用型产品，使用前取一管Marker样品室温彻底融化后可以直接上样，不要加热。
一般说来，0.75mm×5mm（厚度×宽度）的加样孔上样5μl，其他规格梳子请适当调整上样量。
【注】如非必须，尽量使用厚度0.75mm的凝胶，这样会减少电泳后染色和脱色的时间。
4.制胶：先配制分离胶，聚合后再配制浓缩胶。
电泳时，80v跑30-60分钟左右，待指示前沿到达分离胶上沿时，把电压调至130-150v，至所有条带分离清楚后即可停止电泳。
整个电泳过程大约需要2-3个小时。
5.如果是较小的多肽（小于5KD），电泳之后可将胶置于固定液中固定30分钟，再进行染色，能得到较好的蛋白条带；如果不固定直接染色，小蛋白可能会不清楚。
6.染色：如果进行染色时效果不好或考虑其毒性，请选择本公司的考马斯亮蓝蛋白快速染色液，该产品具有染色快，无毒，灵敏性高等特点，是常规染色液的理想替代品。
细胞角蛋白(广谱)抗体试剂(免疫组织化学)说明书
1. 供专业人员使用。 2. 该产品中含有叠氮钠 (NaN3)，纯品具有高度的化学毒性。产品中叠氮钠的浓度虽然不能被认定为危险
性浓度，但是叠氮钠可以与铅、铜发生化学反应，形成具有爆炸性危险的叠氮化金属物质。处理时需 要用大量清水冲洗，防止管道中形成金属叠氮化物质。 3. 与所有生物来源的产品相同，必须遵循相关操作步骤。 4. 穿戴合适的个人防护装置，避免皮肤和眼睛接触。 5. 请按照当地、地区以及国家的相关法规，处理未使用的溶液。
【主要组成成份】
1． 提供的试剂 即用型单克隆小鼠抗体以液体形式提供，缓冲液中含有稳定蛋白和0.015 mol/L NaN3。 克隆：AE1/AE3 同型：IgG1，kappa 2．免疫原 人体表皮细胞愈伤组织 (1)。 3．特异性 AE1/AE3 包括两种单克隆抗体，采用人愈伤组织细胞角蛋白免疫小鼠的方法得到 (2)。研究显示， AE1/AE3 能够识别大部分人细胞角蛋白，因此可以作为 IHC 中单层和复层上皮来源的判定工具 (1,2,4)。 抗体 AE1 能够与大部分亚组 A 细胞角蛋白的抗原决定簇发生反应，包括 Moll 分型(4) 中的 10、13、14、 15、16 和 19（分子量分别为 56.5、54'、50、50'、48 和 40 kDa），但是不包括编号为 12、17 和 18（分 子量分别为 55、47 和 45 kDa）的细胞角蛋白(4)。抗体 AE3 能够与亚组 B 细胞角蛋白的抗原决定簇发生 反应，包括编号为 1 和 2、3、4、5、6、7 和 8（分子量分别为 65、67、64、59、58、56、54 和 52 kDa） 的细胞角蛋白(5)。
5. Eichner R, Bonitz P, Sun T-T. Classification of epidermal keratins according to their immunoreactivity, isoelectric point and mode of expression. J Cell Biol 1984; 98:1388
爱必信WB彩色凝胶试剂盒上新啦!让您的WB实验多姿多彩
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蛋白免疫印迹实验（Western Blot）实验大家肯定都不陌生，要想做出好看的条带，从制胶开始就不容半点马虎。
WB制胶可谓实验室新手的必修课了，想想小编我在当初实验室的时候，就没少帮师兄师姐配置WB凝胶，泛黄的配方表小编还记忆犹新。
WB凝胶配
方表
说起WB凝胶配置，小编可有一肚子苦水要倒，第一个让人头疼的一点就是多种溶液都需要计算量取，每次调移液器就要调半天。
还有各种试剂的保存条件也不一样，配胶之前还需要从冰箱，室温柜子里分别拿出不同的溶液。
这还不算，最容易出问题的促凝剂APS，需要新鲜配置，4度保存不能超过一周，关键是粉末还特容易吸水，打开后需要密封保存。
小编之前就踩过一次坑，APS粉末吸水结块，称量配置后的APS含量不够，凝胶凝结不好，整个WB实验条带跑的七扭八歪。
蛋白质印迹（Western Blot）实验中产品推荐：。
蛋白Marker说明书
SM0671PageRuler Prestained Protein LadderA prestained SDS-PAGE MW marker with contrasting colored reference bands at10 and 70kDa.The Thermo Scientific PageRuler Prestained Proteis a mixture of ten (10) blue-, orange- and green-srecombinant proteins (10 to 170kDa) for use as sizstandards in protein electrophoresis (SDS-PAGE)Western blotting.This prestained protein MW marker is designed fomonitoring the progress of SDS-polyacrylamide geelectrophoresis, for assessing transfer efficiency onylon and nitrocellulose membranes, and for estimapproximate size of separated proteins that have b visible with gel stains or Western blot detection reagents. The ladder contains one orange refer at 70kDa and one green band at 10kDa.Highlights:•Size range– 10 proteins spanning 10 to 170kDa•Ready-to-use– supplied in a loading buffer for direct loading on gels; no need to boil •Sharp bands– color-coded bands of similar intensity for easy visualization•Quality tested – each lot evaluated by SDS-PAGE and Western blotting•Two reference bands– orange at 70kDa and green at 10kDa•Membrane-compatible– colored bands transfer to membranes for Western blottingIncludes:•Dye-stained proteins in 62.5mM Tris-H3PO4 (pH 7.5 at 25°C), 1mM EDTA, 2% SDS, 1 1mM NaN3 and 33% glycerol.Applications:•Monitoring protein migration during SDS-polyacrylamide gel electrophoresis•Monitoring protein transfer onto membranes after Western blotting•Sizing of proteins on SDS-polyacrylamide gels and Western blotsProduct Details:SDS-PAGE band profile of the Thermo ScientificPageRuler Prestained Protein Ladder. Images arefrom a 4-20% Tris-glycine gel (SDS-PAGE) andsubsequent transfer to membrane.Sm1841Spectra Multicolor Broad Range Protein LadderA prestained, 4-color, SDS-PAGE MW marker especially for proteins between 10 and 260kDa.The Thermo Scientific Spectra Multicolor Broad RangeProtein Ladder is a 4-color protein standard containing 10prestained recombinant prokaryotic proteins (10 to 260kDa)for use as size standards in gel electrophoresis and Westernblotting.This prestained protein MW marker is designed formonitoring the progress of SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis, for assessing transfer efficiency onto PVDF,nylon and nitrocellulose membranes, and for estimating theapproximate size of separated proteins that have been made visible with gel stains or Western blot detection reagents. Four different chromophores (blue, orange, green, pink) are bound to the different component proteins, producing a brightly colored ladder with an easy-to-remember pattern.Highlights:•Size range– 10 proteins spanning 10 to 260kDa•Multicolor– four different colors for unambiguous band-size assignment•Ready-to-use– supplied in a loading buffer for direct loading on gels; no need to boil•Sharp bands– color-coded bands of similar intensity for easy visualization•Quality tested – each lot evaluated by SDS-PAGE and Western blotting•Membrane-compatible– colored bands transfer to membranes for Western blotting Includes:•Dye-stained proteins in 62.5mM Tris-H3PO4 (pH 7.5 at 25°C), 1mM EDTA, 2% SDS, 10mM DTT, 1mM NaN3 and 33% glycerol.Applications:•Monitoring protein migration during SDS-polyacrylamide gel electrophoresis•Monitoring protein transfer onto membranes after Western blotting•Sizing of proteins on SDS-polyacrylamide gels and Western blotsProduct Details:SDS-PAGE band profile of the Thermo ScientificSpectra Multicolor Broad Range Protein Ladder.Images are from a 4-20% Tris-glycine gel(SDS-PAGE) and subsequent transfer to membrane.S m1811PageRuler Plus Prestained Protein LadderA prestained SDS-PAGE MW marker with contrasting colored reference bands at 10, 25 and 70kDa.The Thermo Scientific PageRuler Plus Prestained ProteinLadder is a mixture of nine (9) blue-, orange- andgreen-stained recombinant proteins (10 to 250kDa) for useas size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE)and Western blotting.This prestained protein MW marker is designed formonitoring the progress of SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis, for assessing transfer efficiency onto PVDF,nylon and nitrocellulose membranes, and for estimating theapproximate size of separated proteins that have been made visible with gel stains or Western blot detection reagents. A blue chromophore is bound to all proteins, except proteins of two reference bands of 70kDa and 25kDa that are colored with an orange dye and one green reference band of 10kDa. PageRuler Plus Prestained Protein Ladder is ready to use: no heating, further dilution or addition of a reducing agent is required before loading onto a gel.Highlights:•Size range– nine proteins spanning 10 to 250kDa•Ready-to-use– supplied in a loading buffer for direct loading on gels; no need to boil•Sharp bands– color-coded bands of similar intesity for easy visualization•Quality tested – each lot evaluated by SDS-PAGE and Western blotting•Bright reference bands– orange at 70 and 25kDa, and green at 10kDa•Membrane-compatible– colored bands transfer to membranes for Western blotting Includes:•Dye-stained proteins in 62.5mM Tris-H3PO4 (pH 7.5 at 25°C), 1mM EDTA, 2% SDS, 10mM DTT, 1mM NaN3 and 33% glycerol.Applications:•Monitoring protein migration during SDS-polyacrylamide gel electrophoresis•Monitoring protein transfer onto membranes after Western blotting•Sizing of proteins on SDS-polyacrylamide gels and Western blotsProduct Details:SDS-PAGE band profile of the Thermo Scientific PageRuler Plus Prestained Protein Ladder. Images are from a 4-20% Tris-glycine gel(SDS-PAGE) and subsequent transfer to membrane.。
WB实验步骤教学文案
W B实验步骤蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳）实验材料：SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水实验仪器、耗材：蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用）配制溶液：●配制10%APS溶液：-20度保存0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水●配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10×）20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水●配制1 ml loading buffer：200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水实验步骤：一．制胶：1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。
3.配制10%分离胶：将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。
加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。
静置40分钟至1小时。
5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。
5%浓缩胶：6.配制7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。
注意：灌胶速度要快，防止凝胶。
8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
静置20分钟，等待浓缩胶聚合。
9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。
赶走气泡。
二．SDS-PAGE电泳:1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。
2. 制备样品：1）蛋白样品：根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。
超低分子量蛋白质Marker(3.3kD-20. 1kD)说明书
第1页共3页
夹层胶 10%/2mL 0.407mL / 0.667mL / 0.926mL
浓缩胶 4%/2mL 0.160mL / 0.496mL / 1.344mL
10%APS TEMED
40µL 5µL
40µL 5µL
40µL 5µL
北京索莱宝科技有限公司
20μL 3µL
20μL 3µL
凝胶制备及染色注意事项: 1. 先配制分离胶，聚合后再配制夹层胶，最后配制浓缩胶，3种胶的制胶体积比为4:1.5:1。电泳时，30v 跑1-2小时后，待指示前沿到达分离胶上沿时，把电压调至100v，至电泳结束，整个电泳过程大约需要6-8 小时。 2. 由于多肽所含的氨基酸数目较少，因此如该多肽含有过多的极性氨基酸(碱性或酸性)，则会影响其在 SDS-PAGE 图上的条带迁移率，即其表观分子量可能和多肽的氨基酸理论推算分子量有一定距离。 3. 由于 SDS-PAGE 的图谱上，蛋白质对数分子量和迁移率成正比直线关系的分子量范围为 15,000-200,000， 因此对于分子量小于 10000 的蛋白质或多肽的分子量，只能根据标准分子量进行估计，推断其是否落入预 测的分子量范围。 4. 由于超低分子量多肽（3000 及 3000 以下），极易从凝胶上浸出，因此染色及脱色时间不宜太长，脱色后 凝胶也不宜在水中浸泡保存过久，否则条带会消失。 5. 电泳之后可将胶置于固定液中固定20分钟，再进行染色，能得到较好的蛋白条带；如时间不允许，也可 不进行固定直接染色。如果使用配方7进行染色时效果不好或考虑其毒性，请选择本公司的考马斯亮蓝蛋白 胶快速染色液(货号:P1300)，该产品具有染色快，无毒，灵敏性高等特点，是常规染色液的替代品。
凝胶的配置方法:
49.5%T 3%C 49.5%T 6%C 凝胶缓冲液 甘油 ddH2O
使 用 说 明 书 - 250 bp DNA Ladder Marker
250 bp DNA Ladder Marker
使 用 说 明 书
Takara Code ：D515A
包 装 量： 500 μl （约100次） 浓 度： 约500 ng/5 μl 保存温度
4℃（长期保存请置于-20℃）。
制品说明
250 bp DNA Ladder Marker 为已含有1×Loading Buffer 的DNA 溶液，可取5 μl 直接电泳，使用十分方便。
250 bp DNA Ladder Marker 由DNA 片段250 bp 、500 bp 、750 bp 、1000 bp 、1500 bp 、2250 bp 、3000 bp 、4500 bp 组成，共8条带。
每次取5 μl 电泳时，每条带的DNA 量约为50 ng ，其中1000 bp 的DNA 片段量约为150 ng ，显示亮带。
使用注意
1. 电泳时的加样孔宽度小于6 mm 时，每次取5 μl 制品电泳便可得到清晰条带。
如果加样孔增宽，须适当增加Marker 制品的加样量。
2. 对DNA 电泳而言，Agarose 的纯度对DNA 条带的清晰度影响很大。
因此，电泳时应尽量选用质量好的Agarose ，推荐使用胶浓度为0.7％～2%。
3. 进行Agarose 电泳时，Agarose 的浓度与DNA 片段的分离性能关系密切。
Agarose 浓度越大，对短片段DNA 分离性能越好；反之，Agarose 浓度越小，越有利于长片段DNA 的分离。
V2012.01。
考马斯亮蓝法测蛋白含量测定试剂盒说明书
考马斯亮蓝法测蛋白含量测定试剂盒说明书分光光度法50管/48样注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：样品可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。
此外，可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分析。
测定原理：在酸性溶液中，考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合形成蓝色复合物；该复合物在620nm处有最大吸收峰，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。
该方法灵敏度高，适合微量蛋白质分析。
自备仪器和用品：离心机、分光光度计、石英比色皿、移液器和蒸馏水。
试剂组成和配制：试剂一：液体30 mL×1瓶，4℃保存。
样品中可溶性蛋白质提取：1. 液体样品：澄清液体样品可以直接测定。
2. 组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：20的比例（建议称取约0.05 g组织，加入1mL提取液（自备，根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水））冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即待测液。
（动物样品常常需要稀释）3. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
测定操作：1. 分光光度计预热30 min，蒸馏水调零。
2. 在石英比色皿中加入：试剂（μL）测定管空白管样本500蒸馏水500试剂一500 500混匀后，测定波长620 nm吸光值，△A=A测定-A空白。
注意：空白管只需要测定一次。
计算公式：标准曲线：y = 14.253x - 0.0007 R2 = 0.9997 x: 蛋白标准品浓度(mg/mL)y: 吸光值差值1.按液体样本体积计算：Cpr（mg/mL）=(△A+0.0007)÷14.253=0.07×(△A+0.0007)2.按组织样本质量计算：Cpr（mg/g）=(△A+0.0007)÷14.253×V总÷W=0.07×(△A+0.0007)÷WV总：提取液体积，1 mL; W：样本质量，g。
基于miR-126-5p
基于miR-126-5p/Bcl-2/mPTP通路探究稳心汤对缺氧/复氧诱导H9c2心肌细胞损伤修复的作用机制解紫从1,刘咏梅1,陈恒文1,谭雨晴1,2,李军1摘要目的:观察稳心汤对缺氧/复氧诱导的H9c2心肌细胞损伤的影响,并基于miR-126-5p/Bcl-2/心肌细胞线粒体通透性转换孔(mPTP)调控通路明确其作用机制㊂方法:使用5%CO2㊁1%O2㊁94%N2培养箱构建H9c2心肌细胞缺氧/复氧模型,并通过细胞转染技术达到miR-126-5p的过表达与抑制㊂待干预结束后观察心肌细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)释放水平㊁心肌细胞活性氧(ROS)含量;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测心肌细胞凋亡;流式细胞仪检测心肌细胞线粒体mPTP开放水平;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测细胞色素C(Cyt-C)释放水平与Bcl-2㊁Caspase-3㊁Caspase-9蛋白表达水平;实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测miR-126-5p及Bcl-2㊁Caspase-3㊁Caspase-9的RNA表达水平㊂结果:与miR-126-5p低表达组比较,miR-126-5p过表达可显著降低LDH释放水平;减少心肌细胞ROS含量;改善心肌细胞凋亡率;提高心肌细胞CalceinAM水平,减少mPTP开放㊂miR-126-5p过表达可以减少H9c2心肌细胞Cyt-C释放水平,miR-126-5p低表达可部分减少H9c2心肌细胞Cyt-C释放水平㊂miR-126-5p过表达可上调Bcl-2蛋白与基因表达,下调Caspase-3与Caspase-9蛋白与基因表达㊂miR-126-5p低表达可部分上调miR-126-5p表达水平与Bcl-2蛋白与基因表达;部分下调Caspase-3与Caspase-9蛋白与基因表达㊂结论:稳心汤改善缺氧/复氧诱导的H9c2心肌细胞损伤可能与调控miR-126-5p/Bcl-2/mPTP信号通路有关,从而减轻氧化应激反应,降低线粒体膜通透性,抑制心肌细胞凋亡,延缓心肌损伤㊂关键词稳心汤;H9c2心肌细胞;miR-126-5p/Bcl-2/心肌细胞线粒体通透性转换孔(mPTP);缺氧/复氧;心肌损伤d o i:10.12102/j.i s s n.1672-1349.2023.15.009The Effect of Wenxin Formula on the Damage and Repair of H9c2Myocardial Cells Induced by Hypoxia/Reoxygenation Based on miR-126-5p/Bcl-2/mPTP Regulatory PathwayXIE Zicong,LIU Yongmei,CHEN Hengwen,TAN Yuqing,LI JunGuang'anmen Hospital,China Academy of Chinese Medicine Science,Beijing100053,ChinaCorresponding Author LI Jun,E-mail:***************Abstract Objective:To observe the effect of Wenxin Formula on H9c2myocardial cell injury induced by hypoxia/reoxygenation,and to clarify its mechanism based on the regulatory pathway of miR-126-5p/Bcl-2/mitochondrial permeability conversion pore(mPTP). Methods:The hypoxia and reoxygenation model of H9c2myocardial cells were constructed in a three-gas incubator,and the overexpression and inhibition of miR-126-5p were achieved by cell transfection.After the intervention,the release level of lactate dehydrogenase(LDH)and the content of reactive oxygen species(ROS)in cardiomyocytes were observed.Myocardial cell apoptosis was detected by TUNEL.The open level of mPTP was detected by flow cytometry.The release level of cytochrome-C(Cyt-C)and the expression levels of Bcl-2,Caspase-3,and Caspase-9were detected by Western Blot.Real-time quantitative fluorescence polymerase reaction(qRT-PCR)was used to detect the expression levels of miR-126-5p,Bcl-2,Caspase-3and,Caspase-9RNA.Results:Compared with miR-126-5p low expression group,miR-126-5p overexpression significantly reduced the LDH release level;reduced ROS content in cardiomyocytes;improved myocardial cell apoptosis rate;calceinam level increased and mPTP opening decreased.Overexpression of miR-126-5p could reduce the Cyt-C release level of H9c2cardiomyocytes,and low expression of miR-126-5p could partially reduce the Cyt-C release level of H9c2cardiomyocytes.Overexpression of miR-126-5p could up-regulate the expression of Bcl-2protein and gene,and down-regulate the expression of Caspase-3and Caspase-9protein and gene.When miR-126-5p expression was low,the expression level of miR-126-5p and Bcl-2could be partially up-regulated.Partially down-regulated the expression levels of Caspase-3 and Caspase-9.Conclusion:The Wenxin Formula could improve H9c2myocardial cells injury induced by hypoxia/reoxygenation which may be related to the regulation of miR-126-5p/Bcl-2/mPTP signaling pathway,so as to reduce oxidative stress response,reduce mitochondrial membrane permeability,inhibit cardiomyocyte apoptosis,and delay myocardial injury.Keywords Wenxin Formula;H9c2myocardial cells;miR-126-5p/Bcl-2/mPTP;hypoxia/reoxygenation;myocardial injury基金项目国家自然科学基金资助项目(No.81973836);中国中医科学院科技创新工程重大攻关项目(No.CI2021A00902);首都卫生发展科研专项(No.2020-1-4151)作者单位 1.中国中医科学院广安门医院(北京100053);2.北京中医药大学(北京100029)通讯作者李军,E-mail:***************引用信息解紫从,刘咏梅,陈恒文,等.基于miR-126-5p/Bcl-2/mPTP通路探究稳心汤对缺氧/复氧诱导H9c2心肌细胞损伤修复的作用机制[J].中西医结合心脑血管病杂志,2023,21(15):2754-2765.冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heartdisease,CHD)已成为重大公共卫生问题㊂据‘中国心血管健康与疾病报告2021“[1]推算,中国心血管病现患人数约3.3亿人,其中冠心病病人1139万人,急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)患病率与死亡率均呈上升趋势,心血管病死亡率已高于肿瘤及其他疾病,居于首位㊂目前,冠心病可通过经皮冠状动脉支架植入术(percutaneous coronary intervention,PCI)㊁冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting,CABG)及口服常规二级预防药物等治疗,多数病人可从中获益[2]㊂仍有部分病人病情复杂,如存在手术风险㊁冠状动脉病变程度严重㊁PCI术后再狭窄㊁支架内血栓等,均可不同程度影响冠心病病人的疗效㊂中医药运用益气温阳㊁活血通络㊁解毒等方法治疗冠心病,疗效确切,可改善病人临床症状,减轻炎症反应,提高病人生活质量,但作用机制仍待阐明[3-4]㊂稳心汤是本课题组结合多年临床实践与名老中医经验总结出的有效方剂,药物组成有姜黄㊁黄芪㊁党参㊁赤芍㊁川芎㊁莪术㊁肉桂㊁瓜蒌㊁大黄㊁细辛㊁甘草,可益气活血㊁散寒止痛㊁通阳降浊,善治冠心病气虚血瘀证[5]㊂方中以姜黄㊁黄芪为君药,可补气活血,其中黄芪有效成分黄芪甲苷㊁姜黄有效成分姜黄素均已证实在治疗冠心病中具有较好效果,可调节炎症反应,改善血管内皮功能,缓解心肌缺血[6-7]㊂本课题组通过稳心汤干预急性心肌梗死大鼠,观察其作用机制,发现稳心汤可改善大鼠心功能㊁抑制心肌纤维化㊁调节心室重构,其机制可能与上调miR-126-5p,并调控其下游Bcl-2㊁Caspase-9等基因表达相关[8-9]㊂因此,本研究在前期实验基础上,通过缺氧/复氧诱导H9c2心肌细胞损伤模型,模拟冠心病心肌受损,基于miR-126-5p/Bcl-2/心肌细胞线粒体通透性转换孔(mPTP)调控通路观察稳心汤改善心肌损伤的作用机制㊂1材料与方法1.1实验细胞H9c2心肌细胞系购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心㊂1.2实验药物实验用稳心汤购自中国中医科学院广安门医院㊂实验用黄芪甲苷标准品(货号:110781)与姜黄素标准品(货号:110823)均购自中国食品药品鉴定研究院㊂实验用盐酸曲美他嗪片(每片20mg)购自中国中医科学院广安门医院㊂药物用不含胎牛血清(FBS)的DMEM培养基充分溶解(使用DMSO助溶),配制成2mg/mL的母液,分装于冻存管中,-20ħ保存㊂每次实验时需用不含FBS的DMEM培养基根据所需浓度进行稀释㊂1.3实验试剂DMEM高糖培养基(Gibco,C11995500BT);FBS (四季青,11011-8611);青链霉素混合液(P1400)㊁磷酸缓冲液(PBS,P1020)㊁通用细胞冻存液(24800)㊁RIPA 裂解液(R0010)㊁二喹啉甲酸法(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(PC0020)㊁5ˑ蛋白上样缓冲液(含DTT, P1040)㊁10ˑ电泳转移缓冲液(D1060)㊁5ˑTris-甘氨酸电泳缓冲液(T1070)㊁20ˑTBST(T1080)㊁彩虹245plus广谱蛋白Marker(5-245KD)(PR1930-50T)均购自Solarbio公司;Trypsin0.25%胰蛋白酶溶液(HyClone,SH30042.01);细胞增殖毒性检测(CCK-8)试剂盒(日本同仁,CK04);乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物,C0017);纯化线粒体氧化应激活性氧(ROS)鲁米诺化学发光法定量检测试剂盒(GENMED SCIENTIFICS,GMS10112.2);二甲基亚砜(DMSO,D2650)㊁Tunel(11684795910)㊁DAPi(D9542)购自Sigma公司㊂氯仿㊁异丙醇㊁无水乙醇购自北京化学试剂公司;Trizol试剂(Invitrogen公司,14105); FastQuant RT Kit逆转录试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司,N2625];SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒(美国应用生物公司,1403448);miR-126-5p㊁Bcl-2㊁Caspase-3㊁Caspase-9引物购自赛百盛生物科技有限公司;Lipofectamine TM RNAiMAX转染试剂(Thermo,13778150);Bcl-2Rabbit pAb(A0208)㊁Caspase-9Rabbit pAb(A11451)㊁Caspase-3 (A2156)㊁Cytochrome C Rabbit pAb(A0225)购自Abclonal公司;Omni-Easy TM一步法PAGE凝胶快速制备试剂盒(10%,PG212)㊁Omni-ECL TM增强型化学发光检测试剂盒(皮克级,SQ101)购自雅酶公司;脱脂奶粉(普利莱,P1622);eBlot L1PVDF膜转膜试剂A (L00791C)㊁eBlot L1PVDF膜转膜试剂B(L00793C)㊁eBlot L1PVDF膜平衡浓缩液(L00734C)购自GenScript;甲醇(天津赛孚瑞);山羊抗兔IgG(H+L), HRP(111035003)㊁山羊抗鼠IgG(H+L),HRP (115035003)购自Jackson公司;β-actin鼠单抗(锐尔康生物,REK0001)㊂1.4实验仪器CO2细胞培养箱(Thermo,3111);CO2细胞培养箱(ESCO,CCL-050T-8-IVF);超净台(上海苏净实业有限公司,SW-CJ-2D);低速离心机(上海安亭科学仪器厂,KA-1000);多功能酶标仪(TECAN,Spark);电热恒温水浴锅[林茂科技(北京)有限公司,DZKW-4];倒置荧光显微镜(OLYMPUS,CKX53);流式细胞仪[碧迪医疗器械(上海)有限公司,Calibur II型];化学发光仪(Molecμlar Devices,SpectraMax L);低温高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司,TGL-16); qTower3(Analytikjena,3107A-1368),聚合酶链式反应(PCR)扩增仪(AGS,AGT9601);生物安全柜(北京东联哈尔仪器制造有限公司,BSC-1360II A2);涡旋震荡仪(宁波市鄞州群安实验仪器有限公司,MIX-28);电泳仪(Thermo scientific,Mini Ge Tank);转膜仪(GenScript eBlot TM L1);摇床(泰州诺米医疗科技有限公司,NYC-80);曝光仪(上海易孛特,eBlot)㊂1.5实验方法1.5.1细胞培养H9c2心肌细胞所用完全培养基由DMEM高糖培养基㊁10%FBS㊁1%青链霉素混合液组成㊂培养环境为37ħ㊁5%CO2细胞培养箱㊂培养过程中需定期观察细胞形态及数量,待细胞融合度达到80%~90%时,使用胰蛋白酶消化,进行细胞传代㊁冻存及相关检测㊂1.5.2缺氧/复氧模型构建取对数生长期的H9c2心肌细胞铺于细胞培养瓶中,待细胞贴壁过夜后,将细胞置于含5%CO2㊁1% O2㊁94%N2的培养箱缺氧24h,再将细胞放于正常培养箱内培养12h,构建H9c2心肌细胞缺氧/复氧模型㊂1.5.3细胞转染细胞经常规消化终止后调整细胞密度为5ˑ104个/mL,铺于6孔细胞培养板内,每孔1500μL,继续常规培养24h,待细胞融合度达到70%以上时,无菌状态下无血清培养基稀释miRNA至200nmol/L,同时加入4μL的lipo2000转染试剂,室温反应15min进行细胞转染㊂转染24h后,根据细胞分组进行实验㊂1.5.4细胞分组及处理将转染后的miR-126-5p过表达细胞和低表达细胞分别进行分组㊂1)miR-126-5p过表达H9c2心肌细胞分组:mim-Control组正常培养;mim-Model组缺氧/复氧培养;mim-WXT-H组在缺氧/复氧培养基础上,同时予稳心汤20μg/mL干预;mim-WXT-M组在缺氧/复氧培养基础上,同时予稳心汤10μg/mL干预;mim-WXT-L 组在缺氧/复氧培养基础上,同时予稳心汤5μg/mL干预;mim-Cur组在缺氧/复氧培养基础上,同时予姜黄素50μg/mL干预;mim-AS-IV组在缺氧/复氧培养基础上,同时予黄芪甲苷50μg/mL干预;mim-QMTQ组在缺氧/复氧培养基础上,同时予盐酸曲美他嗪片10μg/mL 干预㊂2)miR-126-5p低表达H9c2心肌细胞分组: in-Control组正常培养;in-Model组缺氧/复氧培养;in-WXT-H组在缺氧/复氧培养基础上,同时予稳心汤20μg/mL干预;in-WXT-M组在缺氧/复氧培养基础上,同时予稳心汤10μg/mL干预;in-WXT-L组在缺氧/复氧培养基础上,同时予稳心汤5μg/mL干预;in-Cur组在缺氧/复氧培养基础上,同时予姜黄素50μg/mL干预;in-AS-IV组在缺氧/复氧培养基础上,同时予黄芪甲苷50μg/mL干预;in-QMTQ组在缺氧/复氧培养基础上,同时予盐酸曲美他嗪片10μg/mL干预㊂1.5.5检测心肌细胞上清LDH释放水平调整细胞密度为5ˑ104个/mL,铺于96孔细胞培养板内,每孔100μL,予不同处理后,按照说明书操作步骤,每孔分别加入60μL的LDH检测工作液,混匀,室温避光孵育30min,然后在490nm处测定吸光度㊂1.5.6检测心肌细胞ROS含量调整细胞密度为5ˑ104个/mL,铺于6孔细胞培养板内,每孔1500μL,予不同处理后,弃上清,按照说明书加入试剂,打开化学发光仪,整合测读10s,获得相对发光单位(relative light unit,RLU)㊂1.5.7原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测心肌细胞凋亡调整细胞密度为5ˑ104个/mL,铺于24孔细胞培养板内,每孔500μL,予不同处理后,弃培养基,使用TUNEL进行检测,荧光显微镜拍照,其中TUNEL为绿荧光,DAPi为蓝色荧光㊂1.5.8心肌细胞线粒体通透性转换孔开放检测调整细胞密度为5ˑ104个/mL,铺于6孔细胞培养板内,每孔1500μL,予不同处理后,消化细胞,调整细胞密度为1ˑ106/mL,每个样品体积为1mL;使用流式细胞仪检测Calcein AM水平,Calcein AM染色后经CoCl2处理会导致仅线粒体内呈现Calcein的绿色荧光,当线粒体膜通透性转换孔开放,通透性增加时, Calcein AM荧光强度降低㊂1.5.9蛋白质免疫印记法(Western Blot)检测细胞色素C(Cyt-C)释放水平及Bcl-2㊁Caspase-3㊁Caspase-9的表达水平调整细胞密度为5ˑ104个/mL,铺于100mm直径的细胞培养皿内,每培养皿8mL㊂予不同处理后,消化细胞,取细胞上清保存备用㊂使用RIPA蛋白抽提试剂进行蛋白提取,用BCA法检测蛋白浓度,加入4ˑLDS和超纯水使各样品浓度值相同,沸水浴变性5min㊂然后制备PAGE凝胶㊁电泳㊁转膜㊁封闭㊁一抗孵育㊁二抗孵育,然后将ECL加到PVDF膜上后避光反应3~5min,eBlot曝光仪进行曝光,选择合适曝光时间的图片,通过Image J软件进行灰度值分析㊂一抗具体信息见表1㊂表1一抗信息抗体名称大小稀释度种属Caspase-947/37/35kD1ʒ500兔Caspase-332/17kD1ʒ500兔Cyt-C14kD1ʒ500兔Bcl-226kD1ʒ500兔1.5.10实时荧光定量逆转录PCR法(qRT-PCR)检测miR-126-5p及Bcl-2㊁Caspase-3㊁Caspase-9表达水平调整细胞密度为5ˑ104个/mL,铺于6孔细胞培养板内,每孔1500μL,予不同处理后,消化细胞,收集混悬液至离心管中,1000r/min离心5min,弃上清,加入Trizol1mL重悬细胞㊂提取细胞RNA,根据试剂盒进行反转录,在95ħ5min;95ħ30s,55ħ30s,72ħ35s,40个循环;72ħ8min条件下进行PCR扩增㊂引物序列见表2,以2-әәCt计算㊂表2引物序列基因名称正向引物(5'-3')反向引物(5'-3')miR-126-5p CATTATTACTTTTGGTACGCGA GTGCGTGTCGTGGAGTCG Bcl-2GGGATGCCTTTGTGGAACTA ATTTGTTTGGGGCAGGTCT Caspase-3TGGTTTTGTGACAGTTGACCA ACAAATGCTTGGTGGATCGTAG Caspase-9ATGGTCACGGCTTTGATGGA TCTTTCTGCTCACCACCACA U6CTCGCTTCGGCAGCACA ACGCTTCACGAATTTGCGT1.6统计学处理采用SPSS28.0软件进行数据分析㊂符合正态分布的定量资料以均数ʃ标准差(xʃs)表示,多组间比较采用ANOVA单因素分析;不符合正态分布的定量资料以中位数或四分位间距[M(Q1,Q3)]表示,采用Kruskal-Wallis检验㊂定性资料以例数或百分比(%)表示,采用χ2检验㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1心肌细胞上清LDH释放水平miR-126-5p过表达各组结果显示,与mim-Control组比较,mim-Model组H9c2心肌细胞上清中LDH含量明显升高(P<0.05);与mim-Model组比较, mim-WXT-H组㊁mim-WXT-M组㊁mim-WXT-L组㊁mim-Cur 组㊁mim-AS-IV组㊁mim-QMTQ组LDH含量明显降低(P<0.05)㊂miR-126-5p低表达各组结果显示,与in-Control组比较,in-Model组H9c2心肌细胞上清中LDH含量明显升高(P<0.05);与in-Model组比较, in-WXT-H组㊁in-WXT-M组㊁in-WXT-L组㊁in-Cur 组㊁in-AS-IV组㊁in-QMTQ组LDH含量均明显降低(P<0.05)㊂详见表3㊂miR-126-5p过表达心肌细胞与低表达心肌细胞不同处理条件下比较,发现两Control组㊁两WXT-H 组㊁两QMTQ组LDH释放水平比较差异无统计学意义(P>0.05),两Model组㊁两WXT-M组㊁两WXT-L 组㊁两Cur组㊁两AS-IV组LDH释放水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05)㊂整体说明miR-126-5p高表达可以减少LDH释放水平㊂详见图1㊂表3各组H9c2心肌细胞上清LDH含量比较(xʃs)单位:U/L 组别LDH组别LDH mim-Control组13.67ʃ1.15in-Control组15.67ʃ1.15 mim-Model组32.67ʃ2.52①in-Model组40.33ʃ2.52③mim-WXT-H组26.00ʃ2.64②in-WXT-H组30.33ʃ1.15④mim-WXT-M组17.67ʃ1.15②in-WXT-M组24.00ʃ1.00④mim-WXT-L组24.33ʃ1.15②in-WXT-L组29.33ʃ2.31④mim-Cur组26.67ʃ1.15②in-Cur组23.67ʃ0.58④mim-AS-IV组18.33ʃ0.58②in-AS-IV组20.33ʃ0.58④mim-QMTQ组21.33ʃ1.53②in-QMTQ组23.00ʃ0.00④注:mim-Model组与mim-Control组比较,①P<0.05;与mim-Model组比较,②P<0.05;in-Model组与in-Control组比较,③P<0.05;与in-Model组比较,④P<0.05㊂图1miR-126-5p过表达与低表达各组H9c2心肌细胞上清液LDH含量比较2.2心肌细胞ROS水平miR-126-5p过表达各组结果显示,与mim-Control组比较,mim-Model组H9c2心肌细胞ROS含量明显升高(P<0.05);与mim-Model组比较,mim-WXT-H组㊁mim-WXT-M组㊁mim-WXT-L组㊁mim-Cur 组㊁mim-AS-IV组㊁mim-QMTQ组的ROS含量均明显降低(P<0.05)㊂miR-126-5p低表达各组结果显示,与in-Control组比较,in-Model组H9c2心肌细胞ROS 含量明显升高(P<0.05);与in-Model组比较, in-WXT-H组㊁in-WXT-M组㊁in-WXT-L组㊁in-Cur组㊁in-AS-IV组㊁in-QMTQ组的ROS含量均明显降低(P<0.05)㊂详见表4㊂miR-126-5p过表达心肌细胞与低表达心肌细胞不同处理条件下比较,发现两Control组㊁两Model 组㊁两WXT-H组㊁两WXT-M组㊁两WXT-L组㊁两Cur 组㊁两AS-IV组㊁两QMTQ组ROS含量比较,差异均有统计学意义(P<0.05)㊂miR-126-5p高表达可以减轻心肌受损后氧化应激反应㊂详见图2㊂表4各组H9c2心肌细胞ROS含量(xʃs)单位:RLU 组别ROS组别ROSmim-Control组29.10ʃ27.35in-Control组149.71ʃ74.95 mim-Model组289.40ʃ32.73①in-Model组1428.12ʃ760.34③mim-WXT-H组159.07ʃ22.43②in-WXT-H组376.84ʃ60.23④mim-WXT-M组81.39ʃ37.72②in-WXT-M组286.30ʃ30.96④mim-WXT-L组95.17ʃ50.09②in-WXT-L组441.75ʃ50.95④mim-Cur组151.21ʃ82.20②in-Cur组600.75ʃ73.90④mim-AS-IV组24.65ʃ30.14②in-AS-IV组541.11ʃ22.42④mim-QMTQ组19.26ʃ14.39②in-QMTQ组397.41ʃ17.59④注:mim-Model组与mim-Control组比较,①P<0.05;与mim-Model组比较,②P<0.05;in-Model组与in-Control组比较,③P<0.05;与in-Model组比较,④P<0.05㊂图2miR-126-5p过表达与低表达各组H9c2心肌细胞ROS含量比较2.3心肌细胞凋亡情况miR-126-5p过表达各组结果显示,与mim-Control 组比较,mim-Model组H9c2心肌细胞凋亡率明显升高(P<0.05);与mim-Model组比较,mim-WXT-H组㊁mim-WXT-M组㊁mim-WXT-L组㊁mim-Cur组㊁mim-QMTQ 组凋亡率均明显降低(P<0.05),mim-AS-IV组凋亡率有降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)㊂miR-126-5p低表达各组结果显示,与in-Control组比较,in-Model组H9c2心肌细胞凋亡率明显升高(P< 0.05);与in-Model组比较,in-WXT-H组㊁in-WXT-M 组㊁in-WXT-L组㊁in-Cur组㊁in-AS-IV组㊁in-QMTQ组的凋亡率虽有降低趋势,但差异均无统计学意义(P> 0.05)㊂说明miR-126-5p低表达心肌细胞凋亡率较高,且用药后改善效果不佳㊂详见图3㊁图4㊁表5㊂miR-126-5p过表达心肌细胞与低表达心肌细胞不同处理条件下比较,发现两Control组心肌细胞凋亡率比较,差异有统计学意义(P<0.05),两Model组㊁两WXT-H组㊁两WXT-M组㊁两WXT-L组㊁两Cur组㊁两AS-IV组㊁两QMTQ组心肌细胞凋亡率比较,差异均无统计学意义(P>0.05),说明miR-126-5p表达较低时,容易发生心肌细胞凋亡㊂详见图5㊂图3各组mim-H9c2心肌细胞TUNEL染色结果(A1为mim-Control组TUNEL凋亡细胞;A2为mim-Control组DAPi总细胞;B1为mim-Model组TUNEL凋亡细胞;B2为mim-Model组DAPi总细胞;C1为mim-WXT-H组TUNEL凋亡细胞;C2为mim-WXT-H组DAPi总细胞;D1为mim-WXT-M组TUNEL凋亡细胞;D2为mim-WXT-M组DAPi总细胞;E1为mim-WXT-L组TUNEL凋亡细胞;E2为mim-WXT-L组DAPi总细胞;F1为mim-Cur组TUNEL凋亡细胞;F2为mim-Cur组DAPi总细胞;G1为mim-AS-IV组TUNEL凋亡细胞;G2为mim-AS-IV组DAPi总细胞;H1为mim-QMTQ组TUNEL凋亡细胞;H2为mim-QMTQ组DAPi总细胞)图4各组in-H9c2心肌细胞TUNEL染色结果(A1为in-Control组TUNEL凋亡细胞;A2为in-Control组DAPi总细胞;B1为in-Model组TUNEL凋亡细胞;B2为in-Model组DAPi总细胞;C1为in-WXT-H组TUNEL凋亡细胞;C2为in-WXT-H组DAPi总细胞;D1为in-WXT-M组TUNEL凋亡细胞;D2为in-WXT-M组DAPi总细胞;E1为in-WXT-L组TUNEL凋亡细胞;E2为in-WXT-L组DAPi总细胞;F1为in-Cur组TUNEL凋亡细胞;F2为in-Cur组DAPi总细胞;G1为in-AS-IV组TUNEL凋亡细胞;G2为in-AS-IV组DAPi总细胞;H1为in-QMTQ组TUNEL凋亡细胞;H2为in-QMTQ组DAPi总细胞)表5各组H9c2心肌细胞凋亡率(xʃs)单位:%组别细胞凋亡率组别细胞凋亡率mim-Control组0.00ʃ0.00in-Control组8.54ʃ5.18 mim-Model组32.61ʃ22.46①in-Model组33.02ʃ24.29③mim-WXT-H组17.28ʃ11.23②in-WXT-H组10.41ʃ13.87 mim-WXT-M组10.34ʃ6.61②in-WXT-M组22.08ʃ20.38 mim-WXT-L组 4.40ʃ5.15②in-WXT-L组24.32ʃ24.34 mim-Cur组16.41ʃ5.19②in-Cur组32.55ʃ21.47 mim-AS-IV组22.37ʃ12.95in-AS-IV组23.93ʃ16.69 mim-QMTQ组13.10ʃ11.32②in-QMTQ组23.25ʃ23.41注:mim-Model组与mim-Control组比较,①P<0.05;与mim-Model组比较,②P<0.05;in-Model组与in-Control组比较,③P<0.05;与in-Model组比较,④P<0.05㊂图5miR-126-5p过表达与低表达各组H9c2心肌细胞凋亡率比较2.4mPTP开放结果miR-126-5p过表达各组结果显示,与mim-Control组比较,mim-Model组H9c2心肌细胞CalceinAM水平明显降低(P<0.05),mPTP开放程度升高;与mim-Model组比较,mim-WXT-H组㊁mim-WXT-M组㊁mim-WXT-L组㊁mim-Cur组㊁mim-AS-IV 组㊁mim-QMTQ组的CalceinAM水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05),mPTP开放程度降低㊂miR-126-5p 低表达各组结果显示,与in-Control组比较,in-Model 组H9c2心肌细胞CalceinAM水平明显降低(P<0.05);与in-Model组比较,in-WXT-H组㊁in-WXT-M组㊁in-WXT-L 组㊁in-Cur组㊁in-AS-IV组㊁in-QMTQ组的CalceinAM水平明显升高(P<0.05)㊂详见表6㊂miR-126-5p过表达心肌细胞与低表达心肌细胞不同处理条件下比较发现,两Control组㊁两Model组㊁两WXT-H组㊁两WXT-M组㊁两WXT-L组㊁两AS-IV组㊁两QMTQ组CalceinAM水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),说明miR-126-5p过表达与低表达,可以降低线粒体膜通透性,从而抑制心肌细胞凋亡㊂详见图6㊂表6各组H9c2心肌细胞CalceinAM水平比较(xʃs)组别CalceinAM组别CalceinAM mim-Control组99.67ʃ0.06in-Control组93.10ʃ0.66 mim-Model组66.00ʃ1.10①in-Model组25.60ʃ7.65③mim -WXT-H组88.10ʃ1.57②in-WXT-H组70.20ʃ1.30④mim-WXT-M组98.53ʃ0.06②in-WXT-M组86.93ʃ2.32④mim-WXT-L组97.80ʃ0.20②in-WXT-L组80.53ʃ0.78④mim-Cur组98.73ʃ0.81②in-Cur组79.87ʃ6.15④mim-AS-IV组97.60ʃ0.10②in-AS-IV组71.17ʃ0.25④mim-QMTQ组93.48ʃ0.78②in-QMTQ组88.00ʃ1.18④注:mim-Model组与mim-Control组比较,①P<0.05;与mim-Model组比较,②P<0.05;in-Model组与in-Control组比较,③P<0.05;与in-Model组比较,④P<0.05㊂图6miR-126-5p过表达与低表达各组H9c2心肌细胞Calcein水平比较2.5心肌细胞Cyt-C含量miR-126-5p过表达各组结果显示,与mim-Control组比较,mim-Model组H9c2心肌细胞Cyt-C 释放水平明显升高(P<0.05);与mim-Model组比较, mim-WXT-H组㊁mim-WXT-M组㊁mim-WXT-L组㊁mim-Cur组㊁mim-AS-IV组㊁mim-QMTQ组的Cyt-C释放水平明显降低(P<0.05)㊂说明miR-126-5p过表达心肌细胞缺氧后Cyt-C释放增加,经稳心汤及其有效成分干预后可以减少Cyt-C的释放㊂详见图7㊁图8㊂miR-126-5p低表达组结果显示,与in-Control组比较,in-Model组H9c2心肌细胞Cyt-C释放水平明显升高(P<0.05);与in-Model组比较,in-WXT-H组㊁in-WXT-M组㊁in-Cur组㊁in-AS-IV组㊁in-QMTQ组的Cyt-C释放水平明显降低(P<0.05),in-WXT-L组未见降低趋势㊂说明miR-126-5p低表达心肌细胞缺氧后Cyt-C释放增加,经稳心汤及其有效成分干预后可以减少Cyt-C的释放㊂详见图9㊁图10㊂图7miR-126-5p过表达H9c2细胞不同处理下Cyt-C相对表达结果(mim-Model组与min-Control组比较,*P<0.05;与mim-Model组比较,#P<0.05)图8miR-126-5p过表达H9c2细胞不同处理下Cyt-C相对表达条带图(1为mim-Control组;2为mim-Model组; 3为mim-WXT-H组;4为mim-WXT-M组;5为mim-WXT-L组;6为mim-Cur组;7为mim-AS-IV组;8为mim-QMTQ组)图9miR-126-5p低表达H9c2细胞不同处理下Cyt-C相对表达结果(in-Modec组与in-Control组比较,*P<0.05;与in-Model组比较,#P<0.05)图10miR-126-5p低表达H9c2细胞不同处理下Cyt-C相对表达条带图(1为in-Control组;2为in-Model组;3为in-WXT-H组;4为in-WXT-M组;5为in-WXT-L组;6为in-Cur组;7为in-AS-IV组;8为in-QMTQ组)2.6Western Blot检测Caspase-9㊁Caspase-3㊁Bcl-2蛋白表达miR-126-5p过表达组结果显示:1)就Caspase-9㊁Caspase-3蛋白相对表达而言,与mim-Control组比较,mim-Model组H9c2心肌细胞Caspase-9㊁Caspase-3表达明显升高(P<0.05);与mim-Model 组比较,mim-WXT-M组㊁mim-WXT-L组㊁mim-Cur组㊁mim-AS-IV组㊁mim-QMTQ组Caspase-9㊁Caspase-3表达水平明显降低(P<0.05);mim-WXT-H组未见明显降低㊂2)就Bcl-2蛋白相对表达而言,与mim-Control组比较,mim-Model组H9c2心肌细胞Bcl-2表达明显降低(P<0.05);与mim-Model组比较,mim-WXT-H组㊁mim-WXT-M组㊁mim-WXT-L组㊁mim-AS-IV 组㊁mim-QMTQ组的Bcl-2表达水平明显升高(P<0.05); mim-Cur组Bcl-2表达有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)㊂说明miR-126-5p过表达心肌细胞缺氧后Caspase-9㊁Caspase-3蛋白表达水平均呈上升趋势,Bcl-2蛋白表达水平呈下降趋势;经稳心汤及其有效成分干预后可以减少Caspase-9㊁Caspase-3蛋白表达,提高Bcl-2表达水平㊂详见图11㊁图12㊂图11miR-126-5p过表达各组Caspace-9㊁Caspace-3㊁Bcl-2蛋白相对表达条带图(1为mim-Control组;2为mim-Model组;3为mim-WXT-H组;4为mim-WXT-M组;5为mim-WXT-L组;6为mim-Cur组;7为mim-AS-IV组;8为mim-QMTQ组)图12miR-126-5p过表达各组Caspase-9㊁Caspase-3㊁Bcl-2蛋白相对表达比较(A为各组Caspase-9表达;B为各组Caspase-3表达;C为各组Bcl-2表达㊂mim-Model组与mim-Control组比较,*P<0.05;与mim-Model组比较,#P<0.05)miR-126-5p低表达各组结果显示:1)就Caspase-9㊁Caspase-3蛋白相对表达而言,与in-Control组比较, in-Model组H9c2心肌细胞Caspase-9㊁Caspase-3蛋白表达明显升高(P<0.05);与in-Model组比较, in-WXT-M组㊁in-WXT-L组㊁in-Cur组㊁in-AS-IV组㊁in-QMTQ组的Caspase-9㊁Caspase-3表达水平明显降低(P<0.05);in-WXT-H组Caspase-9有降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);in-WXT-H组的Caspase-3表达水平明显降低(P<0.05)㊂2)就Bcl-2蛋白相对表达而言,与in-Control组比较,in-Model 组H9c2心肌细胞Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05);与in-Model组比较,in-WXT-M组㊁in-WXT-L组㊁in-AS-IV 组㊁in-QMTQ组的Bcl-2表达水平明显升高(P<0.05); in-WXT-H组Bcl-2表达无明显变化,in-Cur组Bcl-2表达明显降低(P<0.05)㊂说明miR-126-5p过表达心肌细胞缺氧后Caspase-9㊁Caspase-3蛋白表达水平均呈上升趋势,Bcl-2蛋白表达水平呈下降趋势;经稳心汤及其有效成分干预后可以减少Caspase-9㊁Caspase-3蛋白表达,提高Bcl-2表达水平㊂详见图13㊁图14㊂图13miR-126-5p低表达各组Caspase-9㊁Caspase-3㊁Bcl-2蛋白相对表达结果(A为各组Caspase-9表达;B为各组Caspase-3表达;C为各组Bcl-2表达㊂in-Model组与in-Control组比较,*P<0.05;与in-Model组比较,#P<0.05)图14miR-126-5p低表达各组Caspase-9㊁Caspase-3㊁Bcl-2相对表达条带图(1为in-Control组;2为in-Model组;3为in-WXT-H组;4为in-WXT-M组;5为in-WXT-L组;6为in-Cur组;7为in-AS-IV组;8为in-QMTQ组)2.7miR-126-5p㊁Bcl-2㊁Caspase-9㊁Caspase-3基因表达水平miR-126-5p过表达各组结果显示:与mim-Control组比较,mim-Model组H9c2心肌细胞miR-126-5p㊁Bcl-2水平明显降低(P<0.05);与mim-Model组比较,mim-WXT-H组㊁mim-WXT-M组㊁mim-WXT-L组㊁mim-Cur 组㊁mim-AS-IV组㊁mim-QMTQ组的miR-126-5p㊁Bcl-2基因表达水平明显升高(P<0.05)㊂与mim-Control 组比较,mim-Model组H9c2心肌细胞Caspase-3㊁Caspase-9水平明显升高(P<0.05);与mim-Model 组比较,mim-WXT-H组㊁mim-WXT-M组㊁mim-WXT-L 组㊁mim-Cur组㊁mim-AS-IV组㊁mim-QMTQ组的Caspase-3表达水平明显减少(P<0.05),mim-WXT-L 组㊁mim-Cur组㊁mim-AS-IV组㊁mim-QMTQ组的Caspase-9表达水平明显减少(P<0.05),mim-WXT-H 组㊁mim-WXT-M组Caspase-9表达差异无统计学意义(P>0.05)㊂详见表7㊂表7miR-126-5p过表达组H9c2心肌细胞基因表达水平(xʃs)组别miR-126-5p Bcl-2Caspase-3Caspase-9 mim-Control组 1.00ʃ0.00 1.00ʃ0.00 1.00ʃ0.00 1.00ʃ0.00 mim-Model组0.70ʃ0.21①0.44ʃ0.10① 1.97ʃ0.04① 2.02ʃ0.90①mim-WXT-H组 1.35ʃ0.85②0.72ʃ0.12② 1.75ʃ0.17② 2.09ʃ0.38 mim-WXT-M组 1.18ʃ0.07② 1.13ʃ0.11② 1.38ʃ0.07② 1.64ʃ0.05 mim-WXT-L组 1.11ʃ0.09② 1.10ʃ0.11②0.80ʃ0.17② 1.16ʃ0.15②mim-Cur组 1.25ʃ0.86②0.82ʃ0.14② 1.15ʃ0.05② 1.20ʃ0.04②mim-AS-IV组 1.12ʃ0.03② 1.41ʃ0.11② 1.20ʃ0.07② 1.15ʃ0.10②mim-QMTQ组0.95ʃ0.36② 1.18ʃ0.12②0.87ʃ0.10② 1.00ʃ0.02②注:mim-Model组与mim-Control组比较,①P<0.05;与mim-Model组比较,②P<0.05㊂miR-126-5p低表达各组结果显示:与in-Control 组比较,in-Model组H9c2心肌细胞miR-126-5p水平明显降低(P<0.05);与in-Model组比较,in-WXT-H 组㊁in-WXT-M组㊁in-WXT-L组㊁in-Cur组㊁in-AS-IV 组㊁in-QMTQ组miR-126-5p水平明显升高(P<0.05);与in-Control组比较,in-Model组H9c2心肌细胞Bcl-2水平明显降低(P<0.05);与in-Model组比较, in-WXT-M组㊁in-WXT-L组㊁in-AS-IV组㊁in-QMTQ组Bcl-2水平明显升高(P<0.05);in-WXT-H组㊁in-Cur 组Bcl-2水平差异无统计学意义(P>0.05);与in-Control组比较,in-Model组H9c2心肌细胞Caspase-3水平明显升高(P<0.05);与in-Model组比较, in-WXT-H组㊁in-WXT-M组㊁in-WXT-L组㊁in-Cur组㊁in-AS-IV组㊁in-QMTQ组Caspase-3水平明显降低(P<0.05);与in-Control组比较,in-Model组H9c2心肌细胞Caspase-9水平明显升高(P<0.05);与in-Model组比较,in-WXT-M组㊁in-WXT-L组㊁in-Cur 组㊁in-AS-IV组㊁in-QMTQ组Caspase-9水平明显降低(P<0.05),in-WXT-H组Caspase-9水平差异无统计学意义(P>0.05)㊂详见表8㊂表8miR-126-5p低表达组H9c2心肌细胞基因表达水平(xʃs)组别miR-126-5p Bcl-2Caspase-3Caspase-9 in-Control组 1.00ʃ0.00 1.00ʃ0.00 1.00ʃ0.00 1.00ʃ0.00 in-Model组0.47ʃ0.06①0.18ʃ0.07① 1.80ʃ0.05① 1.97ʃ0.04①in-WXT-H组 1.11ʃ0.07②0.19ʃ0.02 1.67ʃ0.04② 1.88ʃ0.05 in-WXT-M组 1.00ʃ0.02②0.47ʃ0.04② 1.26ʃ0.05② 1.71ʃ0.06②in-WXT-L组 1.12ʃ0.10②0.42ʃ0.06② 1.11ʃ0.26② 1.16ʃ0.28②in-Cur组0.87ʃ0.09②0.14ʃ0.03 1.08ʃ0.12② 1.13ʃ0.10②in-AS-IV组0.87ʃ0.13②0.38ʃ0.06②0.83ʃ0.04②0.97ʃ0.11②in-QMTQ组0.76ʃ0.10②0.41ʃ0.09② 1.05ʃ0.05② 1.05ʃ0.06②注:in-Model组与in-Control组比较,①P<0.05;与in-Model组比较,②P<0.05㊂3讨论冠心病在中医理论中可归属于 胸痹 心痛 范畴㊂‘金匮要略“曰: 夫脉当取太过不及,阳微阴弦,即胸痹而痛,所以然者,责其极虚也 ㊂说明胸痹心痛的基本病机为 阳微阴弦 ,胸痹病人常虚实夹杂,以虚为主㊂目前,多数学者认为冠心病的发生发展多与 气血 相关㊂史大卓教授认为冠心病的基本病机为 虚在气,留在瘀 ,常用治法为 益气活血法 [10]㊂有学者通过观察冠心病的中医证候分布特点,发现气虚血瘀证居于首位,且男性与女性一致[11]㊂因此,可认为气虚血瘀是冠心病的主要病机㊂益气活血法则是冠心病的主要治法㊂通过观察益气活血法在冠心病方面的应用,发现常用的益气活血剂有补气剂㊁活血化瘀剂㊁稳心汤㊁养心颗粒㊁补阳还五汤㊁益气活血通脉汤等,主要药物包含黄芪㊁党参㊁丹参㊁三七,且作用机制主要集中在炎症反应㊁细胞凋亡等方面[12]㊂微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一种小型非编码RNA,其长度为18~22nt,可以通过识别同源序列干扰㊁转录㊁翻译表观遗传学过程来调节基因的表达[13]㊂已有研究证明,miRNA可以参与诸多生物学过程如细胞生长㊁组织分化㊁细胞增殖㊁胚胎发育与细胞凋亡,与心血管疾病㊁肿瘤和衰老等诊断㊁治疗及预测密切相关[14]㊂冠心病及急性心肌梗死等常伴有心肌损伤[15]㊂近年来,随着科技的进步,研究发现miRNA 可以参与诸多冠心病及心肌梗死的病理改变及治疗,在改善心功能㊁抑制细胞凋亡㊁促进血管新生从而改善心肌损伤等方面具有独特的临床价值[16-18]㊂李娅琳[19]通过观察冠心病病人外周血中miR-126的表达与炎性因子的相关性,发现miR-126与冠心病严重程度呈正相关,当miR-126下调时,可促进机体内血管细胞黏附因子-1(sVCAM-1)及IL-1㊁IL-6㊁TNF-α的释放,从而参与冠心病发生发展㊂已有研究者分析发现,细胞凋亡可通过Beclin-Bcl-2/Bcl-xl复合物㊁mTOR及TNF-α㊁内质网应激等途径激活[20-21]㊂Bcl-2相关蛋白与细胞凋亡密切相关㊂有遗传学表明,Bcl-2对控制细胞程序性死亡至关重要,而Bcl-2蛋白家族则是导致半胱氨酸蛋白酶家族激活的关键调节因子[22]㊂Caspase可参与细胞生长分化与凋亡调节,与真核细胞的凋亡密切相关㊂刘嘉烁等[23]通过观察药物对H2O2诱导的心肌细胞凋亡作用机制,发现橙皮苷可以显著促进抗凋亡基因与Bcl-2蛋白的表达,进而抑制促凋亡基因(Bax)和Caspase蛋白表达,从而阻抑细胞凋亡㊂研究表明,当大鼠脑动脉发生栓塞时,Bcl-2的表达明显降低,Bax与p-p38MAPK的表达明显升高,用药干预后则Bcl-2表达增多,Bax表达减少,说明活化p-p38MAPK通路可调节Bcl-2与Bax的表达进而改善血管缺血再灌注损伤[24]㊂亦有研究发现,当细胞凋亡率明显升高时,Bcl-2蛋白表达显著降低,Caspase-3蛋白表达显著升高,说明细胞凋亡可能与激活Bcl-2/Caspase-3信号通路有关[25]㊂本研究结果显示,当心肌细胞缺氧损伤后,miR-126-5p 表达降低,可以负向调节LDH与ROS的释放,同时增加心肌细胞凋亡率,提高线粒体膜通透性,增加心肌细胞Cyt-C释放水平,减少Bcl-2表达,进而上调Caspase-3及Caspase-9表达㊂用稳心汤及黄芪甲苷与姜黄素干预后,可以上调miR-126-5p表达㊂miR-126-5p 高表达可以明显降低心肌细胞LDH释放水平,减少ROS释放,改善心肌细胞凋亡率,减少mPTP开放,降低线粒体膜通透性,同时减少凋亡因子释放㊂其机制可能与上调Bcl-2表达水平㊁下调Caspase-3和Caspase-9表达水平相关㊂综上所述,本研究通过构建心肌细胞缺氧/复氧模型模拟冠心病心肌损伤过程,证明稳心汤可减轻氧化应激反应,降低线粒体膜通透性,减少Cyt-C等凋亡因子释放,进而抑制心肌细胞凋亡,延缓心肌损伤㊂其作用机制可能与miR-126-5p/Bcl-2/mPTP调控通路有㊃4672㊃C H I N E S EJ O U R N A L O FI N T E G R A T I V E M E D I C I N E O N C A R D I O-C E R E B R O V A S C U L A R D I S E A S E A u g u s t2023 V o l.21 N o.15。
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彩虹245广谱蛋白marker使用说明
货号：PR1920
规格：20T(100μ1)/50T(250μ1)/100T(250μ1×2)/500T(250μ1×10)
保存：-20℃保存，有效期至少2年。
产品特点：
●三色预染，颜色鲜亮，条带整齐，便于观察。
●稳定性能突出，经检测4℃放置两年无明显降解。
●用量少，节约成本，仅5ul即可完美呈现（1.5mm，10孔梳）。
●广谱多带，一支即可满足多种实验需求。
产品简介：
彩虹245广谱蛋白marker包含12种彩色预染的已知分子量标准蛋白，分子量范围为
11kD-245kD，每种蛋白含量约为0.2-0.4mg/ml。
预染marker可以用于直接观察蛋白质电泳状况以及清晰地判断Western Blot的转膜效果。
经SDS-PAGE凝胶电泳或转移到PVDF或NC膜上可得到清晰的12条彩色蛋白条带，其中25kD为绿色条带，75kD为红色条带，其余10条是蓝色条带。
使用说明：
1.彩虹245广谱蛋白marker是即用型液体，可直接上样电泳。
上样前无需加热，稀释或添加还原剂。
2.上样5ul，SDS-PAGE电泳过程及转膜后可看见清晰的彩虹条带。
3.建议分离胶浓度为15%。
电泳示意图说明：
彩虹245广谱蛋白marker经15%浓度的SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至PVDF膜上。
注意事项：
1，本产品含有较高浓度甘油，常规-20℃保存为液体状态，可直接使用。
若冰箱温度不稳，导致结冰，可适当分装后置于4℃保存，至少稳定6个月。
2，Marker分离效果与PAGE胶浓度相关，若分离胶浓度低于15%，25kD以下条带不易分离，但不影响绿色（25KD）及以上条带。
如果目的条带小于25KD，建议分离胶浓度大于或等于15%。
3，转膜效果与转膜时间有关，需根据客户目的条带大小而定，如果转膜后较大分子量条带有部分未转膜成功，属于正常现象。
相关试剂：
P10154×蛋白上样缓冲液（含DTT）
P1300-1SDS-PAGE凝胶制备试剂盒
T10705×Tris-甘氨酸电泳缓冲液
D106010×电泳转移缓冲液
PR1910彩虹180广谱蛋白marker
PR1700预染次高分子量蛋白marker
SW3010膜封闭液
DA1010DAB显色试剂盒（20×）
PE0010ECL Plus荧光检测试剂(ECL超敏发光液)。