预染中谱蛋白Marker使用方法
预染蛋白marker说明书
g 时可以根据自身的实验条件和实验习 n 惯通过预实验确定合适的上样量，这样
可以节约成本，同时获得效果更佳的实 验图片； l 未使用的双色预染蛋白质分子量标准 保存于所要求的储存条件，在 4°C 可放 置 2 个月。
上样量
根据上样孔的大小，本双色预染蛋白分子量 标准通常每次上样 5-10 μl（5×1.5 mm 胶孔 5 μl 足够），即可在电泳时、电泳后或转膜后 观察到非常清楚的蛋白质条带。 注：35 和 50 kDa 之间的弱带为 40 kDa。
15-150 kDa 双色预染蛋白
Marker
Reagent Grade 产品编号: C610011 包装: 250 μl 储存: -15°C～-20°C 品牌: 生工 注：该产品不适用于人或动物诊断或治疗使 用。
一般描述
c 本双色预染蛋白分子量 marker 包含了从 15 te kDa 到 150 kDa 共 8 种纯化的预染蛋白质
内含物
67 mM Tris-HCl, pH 7.5, 20 mM DTT, 5 mM EDTA, 2% (W/V) proclin300.
注意
本彩色预染 marker 已经配制在 1×SDS-PAGE 上样缓冲液中，可直接使用， 不要煮沸。
(15, 20, 25, 35, 50, 70, 100, 150 kDa)，其中 70 kDa 条带为橙色，其余条带为蓝色，适合
io 作为 SDS-PAGE 和 Western 的蛋白质分子
量标准。
B 使用说明
l 室温下解冻后轻轻混匀或者是用移液 枪缓慢吹打均匀，不要煮沸；
n l 取本产品 5 μl 与实验样品同时进行聚 o 丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），建
westernblotting蛋白质印迹实验的流程
实用标准文案细胞总蛋白的提取（1）离心后，弃去上清液，将收集的细胞用手指轻弹重悬于剩余的少量上清液中，转移至1.5ml 离心管内，用1×PBS溶液洗涤2次，每次加入1mL PBS溶液，1000r/min，4℃离心5min，弃上层液体。
洗涤两次后，将上清液完全去除，用手指轻弹细胞团，使其分散重悬（若不分散，则无法与裂解液充分混匀）。
（2）每管加入细胞团等体积的含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA细胞裂解液；如需检测磷酸化蛋白，则需另加入磷酸酶抑制剂。
使细胞裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min。
如暂不提取蛋白，也可在洗涤细胞2次后加入含蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂的1×PBS约100μL，1000r/min，4℃离心5min后，完全弃上层液体，置于-80℃冰箱保存备用。
（3）冰上超声处理细胞，每次超声2s，间隔3s，约10-20次。
（4）13000r/min，4℃离心15min，收集上清溶液至另一干净并预冷的1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存备用。
2. BCA法测定蛋白质浓度（1）配制工作液根据标准品及待测样品的个数，按BCA试剂A和试剂B体积比为50:1配制足量BCA工作液，充分混匀，置于常温备用。
（2）配制标准品取原标准品BSA（2mg/mL）约100μL，取出50μL，用ddH2O按对数法稀释成如下浓度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL；设置96孔板第一横排第一孔为空白孔，第二横排第一、二孔加入20μL 1×PBS，从第三横排起，精彩文档．实用标准文案按浓度梯度由低到高依次取20μL标准品至96孔板中，每一浓度做2个平行孔。
（3）稀释待测样品取5μl待测蛋白样品，用ddH2O稀释到50μL，分别取20μL至96孔板中，每一浓度做2个平行孔；（4）分别加入200μL BCA工作液到蛋白标准品及待测样品中，轻轻混匀，并去掉每孔中的气泡，置于温箱37℃孵育30min。
LI-COR Odyssey 红外荧光扫描成像
一. Odyssey红外成像系统技术特点一般的荧光染料的激发和检测波长都位于可见光谱区，在此波长范围内，化学高分子物质（膜、胶、微孔塑料板等）也会发出荧光，因此易产生高背景的荧光干扰，从而不能有效用于膜上蛋白或者核酸的直接荧光成像。
而在红外波长区这些大分子物质几乎不发出任何荧光信号，使得红外荧光染料在长波下检测时背景荧光很低，具有很好的信噪比，这一特点使得核酸和蛋白的膜上荧光检测成为可能。
LI-COR根据红外荧光的这一特点开发出Odyssey红外成像系统，独特的采用2个红外激光作为激发光源，以扫描成像方式对样品进行检测。
样品载体可以是膜、凝胶和微孔板。
该系统配置的2个红外激光激发光源，激发光波长分别为680nm和780nm，配置的2个高灵敏度光敏二极管可以分别检测720nm和820nm 的发射荧光，因而Odyssey可同时检测两种IRDyes染料的荧光信号。
IRDyes染料的最大吸收值与Odyssey的两个红外激光器680nm和780nm激发波长相匹配，其发射光波长又与Odyssey的两个光敏二极管检测波长相匹配，与同时IRDye700和IRDye800的发射波长峰值相隔100nm，因此Odyssey可以给出最大的灵敏度和最小的信号交叉。
同时由于采用二极管激光器和固态检测器，Odyssey具有很长的使用寿命（激光器使用寿命约4-6万小时），而系统维护的要求却很低。
该系统可广泛应用于信号传导，蛋白磷酸化分析，In-Cell-Western分析等蛋白领域研究。
主要特点1．高灵敏度,效果同于或者好于化学发光法，但不需信号放大步骤，信噪比高。
2．直接检测，无需曝光和显色底物，不需要X光片，不需要暗房，没有放射性废料产生。
3．双色检测，可以在一次杂交中同时检测两种目的分子，直观，省时。
4．宽广的线性范围，可用于高准确性定量。
5．背景低，图像清晰，激光强度可调，不会丢失弱的信号6．强有力的软件支持，结果分析如确定分子量和定量及图象处理编辑很容易7．系统操作和维护简单Odyssey的应用应用领域：蛋白质研究，核酸研究具体包括：Western分析，In-Gel Western分析，蛋白质定量分析，双色磷酸化分析，考马司亮兰胶的扫描，蛋白双向电泳，双色 EMSA，双色微孔板分析，BD PowerBlot Analysis，Northern Blot，Southern Blot等二．系统安装条件1.位置要求：稳定水平的操作平台放置设备，远离热源，避免阳光直射2.空间及载重要求：操作平台尺寸（长×宽×高）：80×70×80cm操作平台载重：40kg3.温度要求：15-25℃4.湿度要求：不超过60%5.电源：90-250V AC，47-63Hz。
PH0302-超低分子量蛋白Marker II (3.4-100kD)使用手册
PH0302|超低分子量蛋白Marker II(3.4-100kD)Ultra Low Molecular Weight Protein Marker货号：PH0302规格：☐10T（50ul）保存：Store@-20℃◆产品简介本产品包含5种多肽和3种低分子量蛋白质组成，分子量范围为3.4kD-100kD。
可以用来判断SDS-PAGE上多肽和小蛋白的分子量。
◆使用说明第一次收到该产品，室温融化后，彻底混匀，离心快甩将溶液完全收集到管底，根据需要适量分装成小管，-20℃贮存，每次取一小管使用；本产品为即用型，融化后既能使用，不能95℃加热处理。
一.制胶：I配制分离胶1．按照表一将不同体积的双蒸水、40%PAA（19:1）、凝胶缓冲液和乙二醇加入到小烧杯中混合。
2．加入10%APS和TEMED，立即混匀5-10秒，以使溶液充分混匀。
3．在凝胶模具中迅速灌入适量分离胶溶液，然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-3cm的水层，使凝胶表面保持平整。
4．静置30-60分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。
表一（一块0.75mm mini胶用量）分离胶浓缩胶18％T,5%C/6.0ml5％T,3.3%C/2ml 40%PAA（19:1） 2.7ml/40%PAA(29:1)/0.25ml4×凝胶缓冲液 1.5ml0.5ml乙二醇（电泳级） 1.8ml/ddH2O/ 1.25ml10％APS50-65μl20μlTEMED6μl2μl注：如非必须，不要使用1.0mm和1.5mm的凝胶，尽量使用厚度0.75mm的凝胶，这样会减少电泳后染色和脱色的时间。
II配制浓缩胶去除覆盖在分离胶上的水层，用滤纸将残留的水吸去。
1．按照表一将不同体积的双蒸水、40%PAA（29:1）和凝胶缓冲液加入到小烧杯中混合。
2．加入10%过硫酸铵和TEMED，立即混匀5-10秒，以使溶液充分混匀。
3．将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
蛋白Marker说明书
蛋⽩Marker说明书PageRuler Prestained Protein LadderSM0671A prestained SDS-PAGE MW marker with contrasting colored reference bands at10 and 70kDa.The Thermo Scientific PageRuler Prestained Proteis a mixture of ten (10) blue-, orange- and green-srecombinant proteins (10 to 170kDa) for use as sizstandards in protein electrophoresis (SDS-PAGE)Western blotting.This prestained protein MW marker is designed fomonitoring the progress of SDS-polyacrylamide geelectrophoresis, for assessing transfer efficiency onylon and nitrocellulose membranes, and for estimapproximate size of separated proteins that have b visible with gel stains or Western blot detection reagents. The ladder contains one orange refer at 70kDa and one green band at 10kDa.Highlights:Size range– 10 proteins spanning 10 to 170kDaReady-to-use– supplied in a loading buffer for direct loading on gels; no need to boil Sharp bands– color-coded bands of similar intensity for easy visualizationQuality tested – each lot evaluated by SDS-PAGE and Western blottingTwo reference bands– orange at 70kDa and green at 10kDaMembrane-compatible– colored bands transfer to membranes for Western blotting Includes:Dye-stained proteins in 62.5mM Tris-H3PO4 (pH 7.5 at 25°C), 1mM EDTA, 2% SDS, 1 1mM NaN3 and 33% glycerol. Applications:Monitoring protein migration during SDS-polyacrylamide gel electrophoresisMonitoring protein transfer onto membranes after Western blottingSm1841The Thermo Scientific Spectra Multicolor Broad RangeProtein Ladder is a 4-color protein standard containing 10prestained recombinant prokaryotic proteins (10 to 260kDa)for use as size standards in gel electrophoresis and Westernblotting.This prestained protein MW marker is designed formonitoring the progress of SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis, for assessing transfer efficiency onto PVDF,nylon and nitrocellulose membranes, and for estimating theapproximate size of separated proteins that have been made visible with gel stains or Western blot detection reagents. Four different chromophores (blue, orange, green, pink) are bound to the different component proteins, producing a brightly colored ladder with an easy-to-remember pattern.Highlights:Size range– 10 proteins spanning 10 to 260kDaMulticolor– four different colors for unambiguous band-size assignmentReady-to-use– supplied in a loading buffer for direct loading on gels; no need to boilSharp bands– color-coded bands of similar intensity for easy visualizationQuality tested – each lot evaluated by SDS-PAGE and Western blottingMembrane-compatible– colored bands transfer to membranes for Western blotting Includes:Dye-stained proteins in 62.5mM Tris-H3PO4 (pH 7.5 at 25°C), 1mM EDTA, 2% SDS, 10mM DTT, 1mM NaN3 and 33% glycerol.Applications:Monitoring protein migration during SDS-polyacrylamide gel electrophoresisMonitoring protein transfer onto membranes after Western blottingSizing of proteins on SDS-polyacrylamide gels and Western blotsProduct Details:Sm1811The Thermo Scientific PageRuler Plus Prestained ProteinLadder is a mixture of nine (9) blue-, orange- andgreen-stained recombinant proteins (10 to 250kDa) for useas size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE)and Western blotting.This prestained protein MW marker is designed formonitoring the progress of SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis, for assessing transfer efficiency onto PVDF,nylon and nitrocellulose membranes, and for estimating theapproximate size of separated proteins that have been made visible with gel stains or Western blot detection reagents. A blue chromophore is bound to all proteins, except proteins of two reference bands of 70kDa and 25kDa that are colored with an orange dye and one green reference band of 10kDa. PageRuler Plus Prestained Protein Ladder is ready to use: no heating, further dilution or addition of a reducing agent is required before loading onto a gel.Highlights:Size range– nine proteins spanning 10 to 250kDaReady-to-use– supplied in a loading buffer for direct loading on gels; no need to boilSharp bands– color-coded bands of similar intesity for easy visualizationQuality tested – each lot evaluated by SDS-PAGE and Western blottingBright reference bands– orange at 70 and 25kDa, and green at 10kDaMembrane-compatible– colored bands transfer to membranes for Western blotting Includes:Dye-stained proteins in 62.5mM Tris-H3PO4 (pH 7.5 at 25°C), 1mM EDTA, 2% SDS, 10mM DTT, 1mM NaN3 and 33% glycerol.Applications:Monitoring protein migration during SDS-polyacrylamide gel electrophoresisMonitoring protein transfer onto membranes after Western blottingSizing of proteins on SDS-polyacrylamide gels and Western blotsProduct Details:。
DNA，RNA，蛋白实验操作步骤v2
DNA提取仔细看试剂盒说明书！使用前：1.在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇（加入量看瓶标签）2.若缓冲液GA或GB有沉淀，37℃水浴溶解，摇匀后使用简要步骤如下：1.冻存全血37℃快速融化，取200μL血液加20μL Proteinase K溶液，混匀。
2.加200μL缓冲液GB，颠倒混匀数次，70℃放置10min，溶液应变清亮，瞬时离心。
3.加200μL无水乙醇，振荡混匀15s，可能会有絮状沉淀，瞬时离心。
4.将所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3（吸附柱放入收集管），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。
5.向CB3中加入500μL缓冲液GD（检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。
6.向CB3中加入600μL漂洗液PW（检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。
7.重复步骤6.8.将CB3放回收集管，12000rpm（~13400g）离心2min，弃废液。
将CB3置于室温放置数分钟，以挥发残留的乙醇。
9.将CB3转入一1.5mL Ep管，向吸附膜中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm（~13400g）离心2min，备用。
DNA/RNA浓度测定使用仪器：ND-1000使用方法：1.保持检测区域的清洁。
准备无RNA酶水，使用前润洗点样区1-2次。
2.打开软件，在点样区滴加1μL无RNA酶水，选择核酸种类（DNA/RNA），设置blank。
3.滴加1μL待测样本，记录浓度和纯度。
4.用纸巾擦去样品，再用无RNA酶水清洗1-2次。
5.关闭软件，关闭电脑，将机器盖上防尘布。
DNA PCR扩增反应体系：模板DNA 500ng10*buffer 2.5 μL25mM MgCl2 1.5 μL2.5mM dNTP 2μL10μM引物各0.4μLTaq酶0.25μL补水至25ul反应条件：95℃3min，（94℃30s，60℃30s，72℃30s），35个循环，72℃5minPCR产物2%琼脂糖凝胶电泳1.小胶（1/4）25mL ,中胶（1/2）50 mL ,大胶 100 mL。
蛋白marker标记颜色方法
蛋白marker标记颜色方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：蛋白marker标记颜色方法在生物科学研究中，标记蛋白是非常常见的实验技术之一。
蛋白marker的标记可以帮助研究人员在实验中追踪和定位蛋白，从而更好地理解蛋白的功能和相互作用。
而标记蛋白的颜色选择也是非常重要的，不同颜色的标记能够帮助实验者在实验过程中更清晰地识别和分析样品。
本文将介绍一些常用的蛋白marker标记颜色方法，希望能够帮助读者更好地进行蛋白标记实验。
一、荧光标记荧光标记是蛋白标记颜色中最常用的方法之一。
通过将蛋白与荧光物质结合，可以在光学显微镜下直接观察到蛋白标记的颜色。
常用的荧光标记包括FITC（荧光异硫氰酸酯），TRITC（罗丹明异硫氰酸酯）和Cy5（Cyanine5）。
这些荧光物质在实验中常用于免疫荧光染色、融合蛋白标记等实验中。
荧光标记的优势是信号强度高、灵敏度高且不受环境影响，适用于单细胞和组织的标记。
在实验中，荧光标记的颜色可以根据荧光物质的不同而有所区分。
比如，FITC标记的蛋白呈现绿色，TRITC标记呈现橙红色，Cy5标记呈现红色。
实验者可以根据实验需要选择不同的荧光标记物质，并通过显微镜观察到标记蛋白的颜色。
二、生物素标记生物素标记是一种基于生物素-亲和素相互作用的蛋白标记方法。
生物素是一种维生素H成分，具有与亲和素结合的特性。
在实验中，生物素可以与生物素素结合并形成稳定的结合物，从而实现蛋白的标记。
生物素标记的颜色在实验中常表现为紫色，实验者可以通过观察颜色变化来判断蛋白是否标记成功。
生物素标记的优势是其结合力强、稳定性高，适用于长时间的实验操作。
另外，生物素标记也可以用于有机溶剂、高温、酸碱环境等多种条件下的蛋白标记。
因此，在一些特殊实验条件下，生物素标记是一种非常理想的标记方法。
三、酶标记酶标记是另一种常用的蛋白标记方法。
通过将蛋白与酶结合，可以在实验中通过酶的催化作用来识别蛋白的存在。
常用的酶标记包括辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
PH0304 宽分子量蛋白Marker10-200kD使用手册
1PH0304|宽分子量蛋白Marker (10-200kD)Catalog No ：PH0304Size ：☐20T (100ul)Storage ：Store@-20℃
◆简介
本产品包含14种蛋白质混合物，分子量范围为10kD-200kD，经过SDS-PAGE 电泳，用考马斯亮蓝染色后可以得到14条带，可以用来判断SDS-PAGE 电泳后蛋白质的分子量。
◆保存
Store at -20℃；有效期12个月
◆使用参考
a 第一次收到该产品，室温融化后，彻底混匀，离心快甩将溶液完全收集到管底，根据需要适量分装成小管，-20℃贮存，每次取一小管使用。
b 取出分装后的Marker，常温融化，轻柔彻底混匀，管底不能见沉淀物。
注：此Marker 为即用型，溶化后直接上样，不要95℃处理！
c 上样量根据胶的厚度和梳子的宽度确定。
一般说来，0.75mm×5mm（厚度×宽度）的加样孔上样5μl，其他规格梳子请适当调整上样量。
注：使用银染时，由于灵敏度高于考马斯亮蓝染色方法，可以适当降低Marker 上样量。
d 电泳结束后，染色，观察结果。
电泳结果如出现带型缺失现象或样品聚集在分离胶上沿，可在Marker 中加入终浓度为100mM 的DTT 后再上样。
12%分离胶电泳示意图
梳子尺寸：0.75mm*5mm
上样量：5ul。
Invitrogen
成像系统和荧光染料的改进为科学家们提供了更有力的工具，使他们可以利用蛋白质免疫印迹技术挖掘更多数据。
荧光蛋白质免疫印迹提供准确定量的结果和稳定的信号，并且能够在单张印迹膜上检测多个目标蛋白，这就是所说的多重成像检测。
多重检测有助于使研究更高和更多产，例如，可以同时观察到目标蛋白和上样内参蛋白（图1），区分具有相似分子量的蛋白质（图2），并评价复杂的生物学通路（图3）。
在多重检测中，同时检测2种目标蛋白称为二重实验，同时检测3种目标蛋白称为三重实验，以此类推。
使用Invitrogen™ iBright™ FL1500成像系统并进行适当实验设计，最多可进行4重荧光蛋白质免疫印迹检测（图4）。
在本指南中，我们将分享成功进行多重荧光蛋白质免疫印迹检测的最佳实践和技巧。
开始前的重要提示在开始多重检测实验之前，请考虑以下几点以尽量减少背景荧光：• 为了消除背景荧光的主要来源，需要使用具有低自发荧光的转印膜，例如硝酸纤维素膜或低荧光PVDF膜（货号22860）。
• 处理膜时必须佩戴手套并使用清洁的圆头镊子，尽量避免膜上出现可能会增强背景荧光并造成荧光伪迹的污染和刮痕。
• 使用高质量的已过滤缓冲液（例如，Thermo Scientific™Blocker™ FL荧光封闭缓冲液（货号37565））。
封闭和洗涤缓冲液中的微粒和污染物可能会遗留在膜上并产生荧光伪迹。
另外，在封闭去污步骤中谨慎使用去污剂，因为普通的去污剂会自发荧光，可能增强非特异性背景。
• 样品缓冲液可能含有自发荧光的组分（如溴酚蓝），这可能会增强背景。
我们建议使用荧光相容性样品缓冲液（例如，Invitrogen™荧光兼容型上样缓冲液，货号LC2570）。
• 如果蛋白marker中含有用荧光基团标记的蛋白质，或者在某些波长下会发出荧光的化合物染色的蛋白质，在凝胶电泳中则可减少上样量。
过量上样可能会遮挡邻近泳道中的信号。
建议使用Invitrogen™ iBright™预染蛋白质marker（货号LC5615）进行多重荧光检测。
westernblot操作规范
Western blot操作流程1. 样品的准备a 收集蛋白样品（Protein sample preparation）可以使用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对丁某些特定的业细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些业细胞组份蛋白，也可以使用相应的蛋白抽提试剂盒进行抽提。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对丁一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
b样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2>< 5X 的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5冲勺SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5邓勺SDS-PAGE蛋白上样缓冲液的配置100C或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
如果不立即电泳，样品可放置丁-20 C或者-80 C保存。
2. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）a准备SDS-PAGE凝胶[1] .按产品说明将制胶玻璃板装配到制胶器上。
（注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗一遍，晾干）[2] .装配好后，可加水检查是否密封，防止漏胶。
[3] .根据表1确定凝胶浓度体积，按表3配制分离胶溶液。
按表中成分顺序加入烧杯配制。
[4] .小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中,灌到足够高度。
注意：为浓缩胶留有足够空间（分离胶面距加样孔底1cm,即梳齿长再加1 cm。
）[5] .轻轻在顶层加入几毫升覆盖物（无水乙醇、去离子水或正丁醇），以阻止空气氧对凝胶聚合的抑制作用。
[6] .凝胶充分聚合。
时间约30~60min,聚合后在覆盖层和凝胶的界面问有一活晰的折光线。
westernblot操作流程
Western Blotting 操作指南【基本操作流程】提取细胞或组织蛋白、测定含量↓制备SDS-PAGE胶↓蛋白样品变性、电泳↓电泳转膜↓封闭↓一抗↓TBST洗涤↓HRP标记的二抗↓TBST洗涤↓ECL试剂作用↓X-光片曝光、显影↓结果分析以下实验中提及仪器为：BIO-RAD mini电泳、湿转、半干转系统抗体：一抗推荐进口品牌Abcam、CST、santcruz【主要试剂配置】试剂可自行配置或购买现成商品化试剂1、 30％丙烯酰胺储存液：29.0g丙烯酰胺（Acr），1.0g亚甲双丙烯酰胺（Bis），混匀后加ddH2O，定容至100ml，棕色瓶保存于4℃。
（注意：未聚合的丙烯酰胺有神经毒性，须在通风橱内小心操作）。
2、 1.5M Tris-HCl(pH 8.0)： 18.17g Tris碱加ddH2O溶解，盐酸调pH至8.0，定容至100ml，4℃保存。
3、 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：18.17gTris碱加ddH2O溶解，盐酸调pH至8.0，定容至100ml，4℃保存。
4、 1M Tris-HCl(pH 6.8)： 12.11 gTris碱加ddH2O溶解，盐酸调pH至6.8，定容至100ml，4℃保存。
5、 2×上样缓冲液（10ml）：0.6ml 1mol/L Tris-HCL (pH6.8)，4ml甘油，2ml10% SDS， 2ml 1mol/L 二硫苏糖醇（DTT），1ml 1%溴酚蓝，0.9ml ddH2O，可在4℃存放数周，或在-20℃保存数月。
6、 10% （w/v） SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O， 68℃助溶，盐酸调至pH 7.2，定容至100ml，室温保存。
7、 10%过硫酸铵（AP）： 0.1gAP加ddH2O至1ml，-20℃保存一个月左右或4℃一星期。
8、 5×电泳缓冲液（1L）： 15.1g Tris碱， 94g甘氨酸，50ml 10％SDS，加ddH2O溶解，调pH 8.3定容至1L，临用前稀释5倍。
westernblot中的marker作用
westernblot中的marker作用
Western blot（西方印迹）是一种用于检测蛋白质的方法。
在Western blot实验中，分子量标记物（Marker）扮演着重要的角色，它是一组已知分子量的蛋白质标准，用于帮助研究者在分析结果时确定待测蛋白的分子量。
Marker通常被加载到Western blot胶体电泳膜的一侧，与待测样品一同进行电泳和转印。
Marker的作用包括：
1. 分子量标定：Marker包含一系列已知分子量的蛋白质，通过与Marker上的带状蛋白质带进行比较，可以精确地确定待测蛋白的分子量。
Marker的分子量通常以千达尔顿（kDa）为单位给出。
2. 验证电泳和转印效果：Marker在电泳和转印的过程中移动到膜上，可以帮助研究者验证这些步骤的效果。
通过检查Marker的带状分布，可以确保电泳和转印过程中没有发生异常。
3. 确定蛋白质迁移距离：通过测量Marker的迁移距离，可以估算待测蛋白质的迁移距离。
这对于进一步的数据分析和结果解释非常重要。
4. 标定凝胶浓度：Marker还可以用于帮助研究者选择适当的凝胶浓度。
不同分子量的Marker在不同的凝胶浓度下会产生不同的迁移模式，因此可以根据Marker的迁移特性选择合适的凝胶浓度。
总体而言，Marker在Western blot实验中起到了标定、验证和标定凝胶浓度等多个方面的作用，使实验结果更加准确和可靠。
小分子蛋白western注意事项及操作技巧
摘自丁香园：跟大家分享一下小分子蛋白的western-blot相关注意事项以及操作技巧：我搞得蛋白质是一个11KD的分泌性蛋白，并且是我实验设计中一个重要的指标，最初学习WB技术，受困于二抗不合格一直连内参都做不出来。
后面改换抗体之后，才相对顺利一点，其他指标也相继出来了。
所以抗体真的很重要。
但是在做WB实验的7、8个月过程中，我的核心的一个蛋白一直处于混沌状态，可能跑30次能现身一次，现身之后又没影好几个月，就这样捉摸不定，搞得我很烦，但又无可奈何。
询问了实验室的同学们，说法各一：1、有人说小分子量蛋白就是难跑，为什么难大家也说不清楚。
2、有的说分泌性蛋白本身胞内含量少，不好跑，需要加大上样量，似乎也是实话。
3、还有的说小分子量蛋白容易降解，你的蛋白质降解了吧，我姑且信了。
但是95%的时候我跑出的条带都是大白板，纵然我通过PCR、细胞的免疫荧光都能够发现这个蛋白，但是就是WB做不出来，4、也有朋友告诉我说分泌型蛋白你还是做ELISA吧，可是一来这个蛋白的ELISA试剂盒好贵的，二来我就是想做WB。
所以就开始了上下求索之路。
95%的时间跑出来的条带是这样的。
这一求索就是几个月的时间。
期间一直觉得电泳没什么技术含量，电转的过程才是重点，于是纠结于电转条件；也纠结过电转液的配置等。
就在最近，再次翻阅论坛里面大神的回帖，其中一个大神提到：小分子量蛋白容易在电泳过程中弥散，电泳在压缩胶里多压一会，在分离胶里面跑一半就好了。
对这个话百思不得其解，于是开始查询一些实验技术方面的文献，其中有几篇文献对我很有启发，其中有些技术原理方面的内容如下：在含SDS缓冲液的样品中，小分子多肽的浓缩是较困难的，因为小分子多肽与SDS形成的复合体具有与SDS本身类似的电荷和大小，所以偏离了相对迁移率和分子质量对数的相互关系，因此浓缩对于小分子多肽的SDS-PAGE来说就成了一个突出问题。
于是回去翻了翻自己曾经偶然跑出来的条带的模样，给我的感觉就是压缩的不好，然后还有弥散的现象（就是那种蛋白晕开的模样，例如这条带下面的波浪边缘，当然也可能是胶不均匀的原因吧，反正我当时就觉得是弥散的现象）然后我就突然有种恍然大悟的感觉，也许说的不对，但是我个人的感觉是：一般较大的分子量的蛋白（如20-70KD）与上样缓冲液中的SDS结合后，因为本身蛋白分子大，SDS附着在上面之后，还是和胶里面的SDS成分有较大差异的，那么在一定电流方向的作用下，就能够顺着电流方向向下电泳；而小分子蛋白被SDS包裹结合形成复合物后，因为蛋白分子小，包裹上SDS后就和胶里面本身的SDS差别没那么大了，那么此时就算有电流作用，它也不会那么听话的顺流而下，毕竟和周遭的胶里面的SDS区别不大，在电泳向下走的过程中，可能向其他方向混乱的运动，走着走着就晕染开了，就像墨点到宣纸上一样。
蛋白电泳预制胶（HEPES Tris-Glycine）说明书
蛋白电泳预制胶（HEPES/Tris-Glycine）说明书【产品名称】蛋白电泳预制胶（HEPES/Tris-Glycine）【产品介绍】四正柏提供HEPES和Tris-Glycine两种凝胶体系的蛋白电泳预制胶，常用于PAGE和Western Blot检测。
采用自动化的灌胶生产技术，确保了产品质量的高稳定性和重复性采用玻璃胶板，有效减少蛋白非特异性吸附，使蛋白条带更为尖锐，清晰胶夹打开极为轻松，只需用刀片在胶夹一侧轻轻一划即可打开凝胶中不含SDS,可用于变性和非变性电泳兼容市场上主流的mini电泳槽，如BIORAD,Invitrogen,天能和君意东方等提供多种浓度的均一胶和梯度胶均一胶可选浓度：6%，7.5%，8%，10%，12%，15%梯度胶可选浓度：4-12%，4-15%，4-20%，8-16%，8-20%【基本信息】预制胶板尺寸：长98mm，宽84mm，厚度4.1mm预制胶尺寸：长81mm，宽74mm，厚度1.5mm浓缩胶：4%，1.5cm丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺的比例：29:1包装规格：10片/盒【储存条件及有效期】1.HEPES体系预制胶2~8℃冷藏，不可冷冻，保质期18个月2.Tris-Glycine体系预制胶2~8℃冷藏，不可冷冻，保质期12个月3.常温运输4.冬季，泡沫盒保温运输【HEPES和Tris-Glycine两种体系蛋白电泳预制胶比较】参数Hepes-Tris体系预制胶Tris-Glycine体系预制胶分辨率高中等电压及电泳时间150V，40-50min180V，60min电泳缓冲液提供变性或非变性蛋白专用电泳缓冲液普通Tris-Glycine缓冲液（需自行配制或另购）【订购信息】1.HEPES体系预制胶产品编号浓度孔数最大上样量电泳缓冲液转膜缓冲液分离范围变性非变性4APA034H-060TS4APA034H-060TN6%1060μl30-300KDa4APA034H-060FS4APA034H-060FN1530μl4APA034H-075TS4APA034H-075TN7.5%1060μl40-200KDa4APA034H-075FS4APA034H-075FN1530μl4APA034H-080TS4APA034H-080TN8%1060μl40-200KDa4APA034H-080FS4APA034H-080FN1530μlHepes-trisTris-glycine4APA034H-100TS 4APA034H-100TN 10%1060μl 20-160KDa 4APA034H-100FS 4APA034H-100FN 1530μl 4APA034H-120TS 4APA034H-120TN 12%1060μl 10-85KDa 4APA034H-120FS 4APA034H-120FN 1530μl 4APA034H-150TS 4APA034H-150TN 15%1060μl 10-50KDa 4APA034H-150FS 4APA034H-150FN 1530μl 4APA034H-412TS 4APA034H-412TN 4-12%1060μl 15-200KDa 4APA034H-412FS 4APA034H-412FN 1530μl 4APA034H-415TS 4APA034H-415TN 4-15%1060μl 10-200KDa 4APA034H-415FS 4APA034H-415FN 1530μl 4APA034H-420TS 4APA034H-420TN 4-20%1060μl 3.5-200KDa 4APA034H-420FS 4APA034H-420FN 1530μl 4APA034H-816TS 4APA034H-816TN 8-16%1060μl 5-5200KDa 4APA034H-816FS 4APA034H-816FN 1530μl 4APA034H-820TS 4APA034H-820TN 8-20%1060μl 6.5-200KDa4APA034H-820FS 4APA034H-820FN1530μl产品编号浓度孔数最大上样量电泳缓冲液转膜缓冲液分离范围4APA034G-060T 6%1060μl Tris-Glycine Tris-Glycine60-200KDa4APA034G-060F 1530μl 4APA034G-075T 7.5%1060μl 50-200KDa 4APA034G-075F 1530μl 4APA034G-080T 8%1060μl 40-200KDa 4APA034G-080F 1530μl 4APA034G-100T 10%1060μl 20-160KDa 4APA034G-100F 1530μl 4APA034G-120T 12%1060μl 15-85KDa 4APA034G-120F 1530μl 4APA034G-150T 15%1060μl 10-50KDa4APA034G-150F 1530μl 4APA034G-412T 4-12%1060μl 20-200KDa 4APA034G-412F 1530μl 4APA034G-415T 4-15%1060μl 20-200KDa 4APA034G-415F 1530μl 4APA034G-420T 4-20%1060μl 5-200KDa 4APA034G-420F 1530μl 4APA034G-816T 8-16%1060μl 10-200KDa4APA034G-816F 1530μl 4APA034G-820T 8-20%1060μl 3-200KDa4APA034G-820F1530μl【电泳操作说明】电泳缓冲液：Hepes 凝胶体系预制胶每盒赠送10包变性蛋白或非变性蛋白电泳缓冲液粉末，每包粉末可用500ml ddH 2O（去离子水）进行溶解，得到500ml 1×电泳液。
超低分子量蛋白质Marker(3.3kD-20. 1kD)说明书
第1页共3页
夹层胶 10%/2mL 0.407mL / 0.667mL / 0.926mL
浓缩胶 4%/2mL 0.160mL / 0.496mL / 1.344mL
10%APS TEMED
40µL 5µL
40µL 5µL
40µL 5µL
北京索莱宝科技有限公司
20μL 3µL
20μL 3µL
凝胶制备及染色注意事项: 1. 先配制分离胶，聚合后再配制夹层胶，最后配制浓缩胶，3种胶的制胶体积比为4:1.5:1。电泳时，30v 跑1-2小时后，待指示前沿到达分离胶上沿时，把电压调至100v，至电泳结束，整个电泳过程大约需要6-8 小时。 2. 由于多肽所含的氨基酸数目较少，因此如该多肽含有过多的极性氨基酸(碱性或酸性)，则会影响其在 SDS-PAGE 图上的条带迁移率，即其表观分子量可能和多肽的氨基酸理论推算分子量有一定距离。 3. 由于 SDS-PAGE 的图谱上，蛋白质对数分子量和迁移率成正比直线关系的分子量范围为 15,000-200,000， 因此对于分子量小于 10000 的蛋白质或多肽的分子量，只能根据标准分子量进行估计，推断其是否落入预 测的分子量范围。 4. 由于超低分子量多肽（3000 及 3000 以下），极易从凝胶上浸出，因此染色及脱色时间不宜太长，脱色后 凝胶也不宜在水中浸泡保存过久，否则条带会消失。 5. 电泳之后可将胶置于固定液中固定20分钟，再进行染色，能得到较好的蛋白条带；如时间不允许，也可 不进行固定直接染色。如果使用配方7进行染色时效果不好或考虑其毒性，请选择本公司的考马斯亮蓝蛋白 胶快速染色液(货号:P1300)，该产品具有染色快，无毒，灵敏性高等特点，是常规染色液的替代品。
凝胶的配置方法:
49.5%T 3%C 49.5%T 6%C 凝胶缓冲液 甘油 ddH2O
蛋白marker制备工艺
蛋白marker制备工艺哎呀，说起蛋白marker制备工艺，这可真是个技术活儿，得慢慢来，不能急。
咱们先得搞清楚，蛋白marker是啥玩意儿。
简单来说，它就是实验室里用来比较蛋白质大小的参照物，就像尺子一样，不过这尺子是蛋白质做的。
好了，咱们开始吧。
首先得有原料，也就是蛋白质。
这蛋白质得是纯的，不能有杂质，不然做出来的marker就不准确了。
我们得用一种叫做“色谱”的技术来提纯蛋白质。
这过程就像过筛子，把蛋白质一点点地过滤，留下最纯净的部分。
接下来，得给这些蛋白质上色，这样在电泳的时候才能看得见。
这上色的过程叫做“标记”。
我们得用一种特殊的染料，这种染料能和蛋白质紧密结合，但又不会影响蛋白质的大小和形状。
这染料得选好，不然marker的颜色就不均匀，看起来就不好看了。
上完色之后，咱们得把这些蛋白质切成一段一段的，这样在电泳的时候才能分开。
这切割的过程叫做“酶切”。
我们得用一种叫做“限制性内切酶”的东西，这种酶就像剪刀一样，能在特定的位置把蛋白质切断。
这剪刀得选好，不然切出来的蛋白质段就不一样长，marker就不准确了。
切完蛋白质之后，咱们得把这些蛋白质段混合在一起，这样做出来的marker才能包含各种大小的蛋白质。
这混合的过程叫做“混合”。
我们得用一种特殊的缓冲液，这种缓冲液能让蛋白质段均匀地分散开，不会聚集在一起。
这缓冲液得调好，不然marker的蛋白质段就会混在一起，看起来就一团糟。
最后，咱们得把这些混合好的蛋白质段装进一个小瓶子里，这就是成品的蛋白marker了。
这装瓶的过程得小心，不能让空气进去，不然marker就会变质。
我们得用一种叫做“真空灌装”的技术，这样就能确保marker的新鲜度。
好了，蛋白marker的制备工艺大概就是这样。
虽然听起来挺复杂的，但只要一步步来，细心操作，就能做出准确、好看的蛋白marker。
这玩意儿虽然小，但在实验室里可是大有用处，没有它，咱们就没法准确地比较蛋白质的大小了。
pcr中marker的作用
pcr中marker的作用
嘿，朋友们！今天咱就来好好唠唠 PCR 中 marker 的作用。
你知道吗，这 marker 啊，那可真是太重要啦！
咱就打个比方吧，PCR 就像是一场未知的旅程，而 marker 呢，就是那指引方向的明灯！它能帮我们在这场复杂的实验中找到正确的路。
想象一下，如果没有 marker，那我们不就像在黑暗中摸索，完全不知道自己走到哪一步了，多迷茫啊！
它就像一个可靠的地标，让我们清楚地知道我们的产物在什么位置。
这有多关键呢？就好比你去一个陌生的地方找东西，有了明确的标记，是不是一下子就能找到目标啦？PCR 中的 marker 就是这样的存在呀！
它还能帮我们判断实验的成败呢！要是 marker 出了问题，那可不得了，这就好像是导航失灵了一样，我们怎么能顺利到达目的地呢？所以说，marker 绝对不是可有可无的角色。
在实验中，它默默地发挥着自己的作用，为我们的研究提供着重要的支持。
没有它，PCR 实验可能就会变得混乱不堪，结果也会让人摸不着头脑。
朋友们，现在你们知道 marker 在 PCR 中有多重要了吧！它真的是不可或缺的呀！咱可千万不能小瞧了它的作用！。