叶绿体提取及观察

实验作业
• 菠菜叶手切片在光学显微镜下能看见 到几种细胞？
• 一、器材 主要设备：普通离心机、粗天平、光学 显微镜。 小型器材： 研钵，滴管，50ml烧杯，离 50ml 心管，漏斗，脱脂棉，玻璃载片和盖片 二、材料 新鲜菠菜 三、试剂 0.35mol/L氯化钠溶液
实验方法
一、叶绿体的分离和观察 1、选取新鲜的菠菜叶子，洗净擦干或吸 干表面水滴后，去除叶梗及粗脉，称 取10g于50ml，0.35 mol/L NaCl溶液中 10g 50ml 0.35 NaCl 。 2、将菠菜和NaCl溶液一起在瓷研体中研 磨，磨成匀浆为止。
叶绿体的分离和观察
叶绿体的发育过程
• 叶绿体含有叶绿素和类胡萝卜素，是 光合作用的场所。主要由叶绿体膜、 类囊体和基质三部分构成，其中类囊 体包括基粒类囊体和基质类囊体。 • 叶绿体是由分生组织中小而无色的、 未分化的前质体（proplastid）发育而 来。黑暗条件下，前质体形成白化体 （etioplast），当植物转入光下生长时 ，白化体即转化为叶绿体。
3、将匀浆用脱脂棉过滤于烧杯中。 4、取滤液4ml在1 000r/min下离心4min ；弃去沉淀。 5、将上清液在3000r/min下离心3min.弃 去上清液，将沉淀即为叶绿体（混有 部分细胞核）。 6、将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮。
实验结果观察
一、用胶头滴管取叶绿体悬液分别在载 玻片上滴一滴，加盖玻片后即可在普 通光学显微镜下观察叶绿体的形态 。 二、在载玻片上滴一滴0.35mol/LNaCL 溶液，用手术刀刮取一定的叶肉，将 叶肉置于NaCL液滴中。然后用盖玻 片盖紧，进行观察。
实验原理
离心技术（ 离心技术（centrifugal technique） technique）是根据颗粒在作匀速 圆周运动时都会受到一个向外的 力而发展起来的一种分离技术。 力而发展起来的一种分离技术。 可用于细胞器的分离。 可用于细胞器的分离。分离过程 包括两个主要阶段： 包括两个主要阶段：破碎细胞和 细胞成分的分离。 细胞成分的分离。常用离心技术 一般包括差速离心法 差速离心法和 一般包括差速离心法和密度梯度 离心法。
差速离心分离叶绿体 细胞经过破碎后制成匀浆，在等 渗介质中进行差速离心，是分离 细胞器的常用方法。利用细胞各 组分质量大小、形状和密度的不 同，选择不同的离心Biblioteka Baidu和离心时 间，即可分离得到所需要的细胞 器或大分子组分。
分离完整叶绿体有三个主要困难： 1）有细胞壁包裹。 2）叶绿体中由于淀粉积累成致 密颗粒,会在离心过程中使叶绿体 破碎。 3）匀浆过程中，液泡中储藏的 有毒物质——酚类化合物会释放 出来。 菠菜是分离完整叶绿体的极好材料 ，其细胞中所含的质体较大，而 且它们都能在不积累淀粉和酚类 物质的条件下生长。
1.4 Diagrammatic representation of a plant cell
1.18 (C) Grana stacks and stroma lamellae; (D) Chloroplast
Summary: Chloroplasts
• -responsible for photosynthesis (convert CO2 into carbohydrates using solar energy) • -contain double membranes (like nucleus and mitochondia) • -thylakoid granum (类囊体叶绿体基 类囊体叶绿体基 粒): site for photosynthesis-light reaction • -Stroma(基质 site for 基质): 基质 photosynthesis-carbon reaction
1．差速离心法 • 采用逐渐增加离心速度或低速和 高速交替进行离心，使沉降速度 不同的颗粒在不同的分离速度和 离心时间下，分批分离的方法， 称为差速离心法。常用于从组织 匀浆中分离各种细胞器，见表1。
• 表1 差速离心形成的沉淀（植物）
• 2．密度梯度离心 当不同颗粒存在浮力密度差时， 在离心力场下，在密度梯度介质中 ，颗粒或向下沉降，或向上浮起， 一直移动到与它们各自的密度恰好 相等的位置上形成区带，从而使不 同浮力密度的物质得到分离。