5免疫荧光技术(修改后) 2
免疫荧光技术名词解释细胞生物学
一、免疫荧光技术概述免疫荧光技术是一种通过荧光显微镜观察细胞或组织中特定分子的方法。
它利用抗体与待检测分子结合后，再加上荧光标记的二抗或荧光标记的直抗，通过荧光显微镜观察标记分子的位置和数量。
免疫荧光技术在细胞生物学和免疫学研究中得到了广泛应用，为研究生物分子的定位、表达和相互作用提供了重要技术支持。
二、免疫荧光技术的原理1. 抗体结合在免疫荧光技术中，首先需要用特异性抗体与待检测的分子结合。
这些抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，通过它们与目标分子的结合，实现对待检测分子的高度特异性识别。
2. 荧光标记待检测分子与抗体结合后，需要加入荧光标记的二抗或直抗，使得待检测分子与荧光物质结合形成复合物。
通常使用的荧光分子有FITC、TRITC、Alexa Fluor等，它们在不同激发波长下显示出不同的荧光颜色。
3. 观察和分析最后通过荧光显微镜观察标记的细胞或组织样品，根据荧光信号的强度和分布情况，可以判断待检测分子的位置和数量，从而了解其在细胞内的表达和功能。
三、免疫荧光技术的应用1. 细胞膜标记免疫荧光技术可用于标记细胞膜上的特定蛋白，例如细胞黏附蛋白、受体蛋白等，从而观察它们在细胞膜上的分布情况和动态变化，揭示细胞膜的结构和功能。
2. 细胞器定位通过标记特定的蛋白或抗体，免疫荧光技术可以用于观察细胞器的定位，如线粒体、内质网、高尔基体等，帮助研究者了解细胞器在细胞内的分布和相互作用。
3. 蛋白相互作用免疫荧光技术也被广泛应用于研究蛋白之间的相互作用关系，通过标记不同的蛋白并观察它们在细胞内的共定位情况，可以揭示蛋白间的相互作用网络和信号传导路径。
4. 细胞功能研究通过观察细胞内荧光标记物的动态变化，免疫荧光技术可以帮助研究者了解细胞的代谢活动、信号转导和细胞周期等重要的生物学过程。
四、免疫荧光技术的发展和趋势1. 自动化和高通量随着技术的发展，免疫荧光技术已经向自动化和高通量方向发展。
自动化的设备和流程使得实验操作更加标准和高效，而高通量的技术则可以同时观察大量样品，加快研究进程。
免疫荧光的原理与操作方法
免疫荧光的原理与操作方法
免疫荧光是一种常用的生物学实验技术，其原理是利用特异性抗体与被检测目标结合，并通过荧光标记的二抗或标记的荧光染料来标记抗原或抗体，从而实现对目标物的定量或定位分析。
免疫荧光的操作方法如下：
1. 样品制备：根据需要检测的目标物选择相应的样品，如细胞、组织或酶解物等，然后进行固定和包埋处理，以保持目标物的完整性和稳定性。
2. 抗体处理：将特异性的抗体加入到样品中与目标物结合，通常先经过一定的预处理步骤，如洗涤样品等。
3. 溶液处理：将样品置于含有稀释的荧光标记物（如荧光染料或荧光素等）的缓冲液中，使标记物与样品中的抗原或抗体结合。
4. 洗涤：为去除非特异性结合的无标记物质，需要进行多次洗涤步骤。
洗涤步骤有助于提高免疫荧光实验的特异性和背景噪声的消除。
5. 扫描与图像分析：用荧光显微镜观察标记物质的荧光信号，并通过相应的图像采集与分析软件进行图像记录和荧光信号的定量分析。
需要注意以下几点：
- 对于不透明的组织，需要进行切片和脱水处理，以便抗体和标记物能够渗透到组织中。
- 抗体的选择应根据被检测目标物的性质和特异性来决定。
- 操作过程需注意无菌条件，避免污染样品。
- 实验中的洗涤步骤要彻底，以避免非特异性结合和背景噪声。
免疫荧光法(免疫细胞化学)
免疫荧光法(免疫细胞化学)免疫荧光法（免疫细胞化学）免疫荧光法，也称为免疫细胞化学，是一种用于检测和定位特定分子在细胞或组织中的分布的技术。
该方法利用荧光标记的抗体与目标分子结合，通过显微镜观察荧光信号的发射来确定其位置。
本文将介绍免疫荧光法的基本原理，实验步骤和应用领域。
一、基本原理免疫荧光法依赖于抗原与抗体的特异性结合。
在免疫细胞化学中，荧光标记的抗体与靶分子结合后，可以通过激发荧光，从而使得靶分子在细胞或组织中可见。
这种荧光标记可以通过直接结合或间接结合实现。
直接结合法是将荧光染料直接与抗体结合，制备成荧光标记的抗体。
这种方法操作简单，适合用于单一标记物的检测，但可能导致染色反应无法控制甚至给靶分子造成损伤。
间接结合法则是利用第二抗体与一抗体结合，然后再将第二抗体与荧光标记结合。
这种方法可以使用多个不同的抗体，并能将多个目标同时检测，具有高度特异性和灵敏度。
但是，操作过程相对繁琐，需要较长时间。
二、实验步骤1. 样本制备：取得所需检测的细胞或组织样本，处理好固定和预处理的步骤。
例如，细胞需经过固定、渗透、洗涤等操作，组织则需进行切片和脱水等步骤。
预处理的目的是为了提高抗体的结合效率和信号强度。
2. 抗体染色：将标记了荧光的一抗体或一抗体与标记物结合的复合物加到预处理好的样本上，充分孵育，以实现抗原和抗体结合。
3. 清洗：将标本进行适当的冲洗，使未结合的抗体、标记物等被去除。
4. 结果观察：将标本放置在荧光显微镜下观察，通过不同波长的光源激发和发射荧光信号。
5. 形态学观察：根据样本的特点、形态学特征及标记染色的荧光信号，判断目标分子的定位和表达情况。
三、应用领域免疫荧光法在生物医学和生命科学领域中得到了广泛应用。
以下是其主要应用领域的一些例子：1. 免疫细胞凝集试验：用于检测抗原与抗体间的反应，如血型鉴定等。
2. 免疫组织化学：通过检测和定位特定分子在组织中的分布，来研究疾病的发生和发展机制，如肿瘤标记物的检测等。
免疫荧光技术
葡聚糖凝胶G25或G50，用pH=7.4的0.01%PBS溶胀 后装柱，加入标记后的抗体溶液，然后用上述 PBS洗脱，取洗脱液加入20%三氯醋酸使蛋白沉淀 后，上清液中的荧光素应低于0.01ug/ml。
⑵ 除去标记不适当的抗体：
采用DEAE纤维素离子柱。将DEAE纤维素用pH=7.6的 0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡装柱，加入标记抗体溶液， 进行分步洗脱。 未结合荧光素的抗体，所帶负电少，最先洗出。 中间洗脱出来的是荧光标记合适的抗体部分。 过量结合荧光素的抗体，所帶负电多，最后洗出。 但经此法纯化，标记抗体损失达50%。
⑶ 除去非特异反应物质：
将荧光抗体用同一正常组织或同种动物其它组织 的组织粉预先吸收。 按每ml标记抗体加100mg组织粉比例混合， 4℃ 磁力搅拌1h，静置1h，1800r/min于4℃条件下离 心20min取上清液，再用每ml标记抗体加组织粉 比例重复一次。
（三）荧光抗体的鉴定
荧光素与蛋白结合率：
P:总蛋白质的量。F：荧光色素量。（物质的量）
*
*
固定标本染色以F/P=1.5左右为宜 活细胞染色以F/P=2.4左右为宜.
F/P值高则抗体分子结合的荧光素多。
F/P=
IgG (mg/ml)
荧光色素（μg/L ） 160 000x10 3 荧光色素 ( μg/L ） x 0.4 x 6
IgG (mg/ml) 390x10
病毒
无水乙醇,丙酮、CCl4
（3）固定后处理
抗原固定后必须立即以冷PH7.4 PBS冲洗,顺序经过三缸 浸泡,每缸3min，末次再以蒸馏水浸泡1min以脱盐。 标本固定干燥后最好立即进行荧光染色及镜检，如必须 保存则应保持干燥，置于4℃以下保存，一般细菌涂片或 组织切片经过固定后可保存一个月以上，但病毒和某些 组织 抗原标本则需-20℃以下保存。
免疫荧光技术原理与步骤
免疫荧光技术原理与步骤免疫荧光技术（immunofluorescence）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的技术，它通过利用抗体与特定抗原结合后对细胞或组织中的抗原进行标记，然后利用荧光显微镜观察标记物的位置和分布情况。
本文将介绍免疫荧光技术的原理和步骤，帮助读者更好地了解和应用这一技术。
原理。
免疫荧光技术的原理基于抗体与抗原的特异性结合。
当特异性抗体与其相应的抗原结合后，可以利用荧光染料标记抗体，使其在荧光显微镜下发出特定颜色的荧光信号。
这样就可以通过观察荧光信号的位置和强度来确定抗原在细胞或组织中的分布情况。
步骤。
免疫荧光技术的步骤通常包括样品处理、抗体标记、荧光染料标记和观察四个主要步骤。
1. 样品处理。
样品处理是免疫荧光技术的第一步，它包括固定、脱水和透明化等步骤。
固定是为了保持细胞或组织的形态结构和抗原的稳定性，常用的固定剂包括乙醇、乙酸和乙醛等。
脱水和透明化则是为了使样品透明，便于观察。
2. 抗体标记。
抗体标记是免疫荧光技术的关键步骤，它需要选择特异性较好的一抗和二抗。
一抗是直接与抗原结合的抗体，而二抗是与一抗结合的抗体。
在这一步骤中，需要将一抗和二抗分别标记上荧光染料。
3. 荧光染料标记。
荧光染料标记是将标记好荧光的抗体与样品中的抗原结合，形成荧光信号。
这一步骤需要在暗处进行，以避免荧光信号受到光照的干扰。
4. 观察。
观察是免疫荧光技术的最后一步，通过荧光显微镜观察标记物的位置和分布情况。
在观察过程中，需要根据实验设计选择合适的荧光滤光片，以获得清晰的荧光图像。
总结。
免疫荧光技术是一种重要的生物医学研究和临床诊断技术，它通过标记抗体和抗原来观察细胞或组织中特定蛋白的位置和分布情况。
掌握免疫荧光技术的原理和步骤，可以帮助科研工作者和临床医生更好地开展相关工作，为生物医学领域的发展做出贡献。
免疫荧光技术课件PPT课件
蛋白质相互作用研究
总结词
免疫荧光技术可用于研究蛋白质之间的 相互作用，揭示生命活动的分子机制。
VS
详细描述
利用两种不同颜色的荧光标记抗体分别与 两种蛋白质结合，通过荧光共振能量转移 等技术，可以观察到两种蛋白质在空间上 的接近程度，从而推断它们之间的相互作 用。
药物筛选与开发
总结词
免疫荧光技术可用于药物筛选和开发过程中，评估药物对细胞或组织的影响。
多模态成像融合
将免疫荧光技术与光声成像、光学相干成像等其他成像技 术融合，实现多模态、多维度的生物分子成像，将有助于 更全面地了解生物样本的结构和功能。
临床应用转化
加强免疫荧光技术的临床应用研究，将其应用于疾病的早 期诊断、疗效评估和预后判断等领域，提高临床诊疗水平。
THANKS
感谢观看
研究和发展新的抗体和荧光标记技术，提高免疫荧光技术的灵敏度 和特异性，降低假阳性结果。
多标记检测
实现多标记免疫荧光技术，能够在同一样品上同时检测多种目标分 子，提高实验的信息量。
05
免疫荧光技术的应用实例
细胞内抗原定位
总结词
通过免疫荧光技术，可以精确定位细胞内的抗原，有助于研究细胞结构和功能。
详细描述
抗体
结合方式
荧光物质通过化学键与抗体结合，形 成荧光抗体，这种荧光抗体可以特异 性地结合抗原，形成抗原-抗体-荧光 抗体的复合物。
抗体是免疫系统产生的一种蛋白质， 能够特异性地结合抗原，形成抗原-抗 体复合物。
荧光信号的激发与检测
激发方式
荧光信号的激发通常采用特定波 长的光，如紫外光或蓝紫光，这 些光能够激发荧光物质发出可见
光。
检测设备
检测设备通常采用荧光显微镜， 能够检测到荧光信号并对其进行
免疫荧光技术2
三.补体荧光染色法
• 概念：将荧光素标记在抗补体抗体（抗C3抗体），检测抗原抗体 复合物。此法是间接法的一种改良，利用补体结合反应的原理， 在抗原抗体反应时加入补体（多用豚鼠补体），再用荧光素标记 的抗C3抗体进行示踪。主要用于检测抗体。 • 检测过程分两步： 第一步：将待测抗体和补体加在已知抗原的玻片上，作用一 段时间后，洗去未结合的抗体和补体。 第二步：滴加荧光标记抗C3抗体。如果在第一步中抗原抗体 发生特异性结合，则补体被固定，此时加入的标记抗补体抗体即与 补体发生结合，形成“抗原—抗体—补体—荧光标记抗C3抗体”的大 分子免疫复合物
常见荧光素的特性：
FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm，发射光520~530nm， 明亮的黄绿色荧光。 RB200：橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光595~600nm，橘红 色荧光。 TRITC：紫红色粉末，吸收550nm，发射光620nm，橙红色荧光。 PE：吸收光490～560nm，发射光595nm，红色荧光。
四.特殊染色法
1.细胞表面双标记或三标记荧光抗体染色 2.细胞内双色免疫荧光染色 3.反衬染色法
四.现代免疫荧光术
流式细胞术（FCM） 荧光偏振免疫分析技术（FPIA） 时间分辨荧光免疫测定（TrFIA）
流式细胞术（FCM）
是以荧光免疫技术为基础而发展起来的一种专门的细胞分析技术。
（二）待标记抗体的标准
• 用于标记的抗体须特异性强，纯度高，效价高，经荧光素标记后 抗体活性损失少。标记前，可用梅花状琼脂双向扩散法测定抗体 效价，即中央孔加抗原（1mg/ml),周围孔加倍比稀释的抗体（1： 2~1：64），抗体效价在1：32以上较为理想。荧光标记的抗体可 以是多克隆抗体或单克隆抗体，亦可以是SPA，后者可作为荧光 二抗的通用试剂。
免疫荧光技术
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。
它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。
一、基本原理：免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。
在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
二、应用范围：其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。
根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。
三、基本实验步骤：1、细胞准备。
对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
2、固定。
根据需要选择适当的固定剂固定细胞。
固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。
PBS洗涤3×5 min.3、通透。
使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。
免疫荧光技术
多激光器系统（多通道激光检测）：
在可见光范围内使用 多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光， 氦氖绿HeNe（G）激光器提供发射波长为543nm的绿光， 氦氖红HeNe（R）激光器发射波长为633nm的红光， 新的405nm的半导体激光器的出现可以提供近紫外谱线。
时效性：标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯 塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；
使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须 保证镜油为无荧光镜油；
电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。
免疫荧光技术常见问题
镧系 镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激 发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发 射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。
藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE） PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最 大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激 光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐 使用575±13nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。
可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。在对DNA染色时，需 用RNase对细胞进行处理，以排除RNA对DNA荧光定量精度的影响。在488nm 波长激发下，PI的发射光谱为610-620nm。 FL2探测器检测PI。
细胞爬片免疫荧光实验流程
免疫荧光技术
免疫荧光技术在肿瘤治疗中的应用：通过检测肿瘤细胞表面的抗原，帮助医生制定个性化的治疗方 案
免疫荧光技术在传染病治疗中的应用：通过检测病原体表面的抗原，帮助医生制定针对性的治疗方 案
免疫荧光技术的 优缺点
优点
灵敏度高：能够检测到低浓度 的抗原或抗体
行标记
荧光信号的检测和成像
荧光信号的产生：通过荧光染料标记抗体或抗原，与靶标结合后产生荧 光信号
荧光信号的检测：使用荧光显微镜或流式细胞仪等设备，对荧光信号进 行检测和定量分析
荧光信号的成像：通过荧光显微镜或流式细胞仪等设备，对荧光信号进 行成像和分析，获得细胞或组织中靶标的分布和表达情况
荧光信号的定量分析：通过对荧光信号的检测和成像，对靶标进行定量 分析和评估，为科学研究和临床诊断提供依据。
蛋白质相互作用研究
免疫荧光技术 可以检测蛋白 质之间的相互
作用
免疫荧光技术 可以定量分析 蛋白质相互作 用的强度和动
力学
免疫荧光技术 可以研究蛋白 质相互作用的
机制和功能
免疫荧光技术 可以应用于药 物筛选和疾病
诊断
疾病诊断和治疗
免疫荧光技术在疾病诊断中的应用：通过检测细胞表面的抗原，帮助医生快速准确地诊断疾病
免疫荧光技术的 发展趋势和未来 展望
发展趋势
自动化：免பைடு நூலகம்荧光 技术将更加自动化， 提高检测效率和准 确性
多重检测：免疫荧 光技术将实现多重 检测，提高检测的 灵敏度和特异性
便携式：免疫荧光 技术将更加便携式 ，方便现场检测和 快速诊断
智能化：免疫荧光 技术将更加智能化 ，实现自动分析和 诊断
免疫荧光实验技术
595～600nm（橙 FITC的衬比染色或双
红色）
标记FAT
四甲基异硫氰酸罗 丹明 (TRITC) 藻红蛋白（PE）
Eu3+螯合物
550nm 490-560nm 340nm
620nm（橙红色） FITC的衬比染色或双 标记FAT
575nm（红色） 双标记FAT、流式细 胞术
613nm
时间分辨荧光免疫测 定
免疫荧光技术实验 封闭，抗体孵育
封闭：目的是为了减少抗体的非特异性结合，最常 用的封闭剂为 BSA, （PBS pH 7.5）,其他可选择的封 闭剂还有 1% 凝胶 gelatin, 1% bovine 或与二抗种 属相同的血清（3-10%）等。室温和4℃均可以。
抗体孵育：直接免疫荧光法中的一抗和间接免疫荧 光法中的二抗都是荧光抗体，因此在这些抗体孵育 的时候必须注意避光。此外，为保证结合质量和防 止干燥，抗体孵育应尽量在湿盒中进行。
免疫荧光技术简介:荧光
发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强 度。
激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录 的相应的荧光发射强度。
荧光寿命：荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的 时间。
荧光淬灭：荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退 称为荧光淬灭。如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、 I-等 。
荧光显微镜
Chance Favors Only the Prepared Mind.
免疫荧光技术简介:抗体
抗体（Antibody）：抗体指机体的免疫系统在抗原刺 激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞 所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球 蛋白。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分 泌液中。
医学免疫学检验-免疫荧光技术课件
医学免疫学检验-免疫荧光技术课件xx年xx月xx日CATALOGUE目录•免疫荧光技术概述•免疫荧光技术的基本原理和步骤•免疫荧光技术的临床应用•免疫荧光技术的质量控制和标准化•总结与展望01免疫荧光技术概述免疫荧光技术是一种将抗原-抗体反应与荧光标记相结合的免疫学技术，通过荧光显微镜观察样本中待测抗原的含量和分布。
定义免疫荧光技术利用抗原-抗体反应的特异性，将荧光标记物与抗体结合，对待测样本中的抗原进行特异性识别和结合，形成抗原-抗体复合物，再通过荧光显微镜观察复合物发出的荧光信号，从而确定抗原含量和分布。
原理免疫荧光技术的定义和原理1免疫荧光技术的应用范围23免疫荧光技术广泛应用于感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等临床疾病的诊断和鉴别诊断。
临床诊断免疫荧光技术还可用于细胞生物学、分子生物学等基础研究中，研究细胞和分子的定位、表达、相互作用等。
基础研究免疫荧光技术可用于药物筛选和药物作用机制研究，通过观察药物与细胞或组织的作用，评估药物的疗效和安全性。
药物研发20世纪40年代免疫荧光技术由瑞典科学家Axelsson和英国科学家Coons首次建立。
20世纪60年代免疫荧光技术得到广泛应用和发展，逐渐成为医学、生物学等领域的重要技术手段。
21世纪初随着新技术如激光共聚焦显微镜、多光子显微镜等的应用，免疫荧光技术不断发展，提高了分辨率和灵敏度，拓展了应用范围。
免疫荧光技术的发展历程02免疫荧光技术的基本原理和步骤免疫荧光技术的核心原理是抗原-抗体反应，即利用特异性抗体与相应抗原的结合反应，实现目标抗原的检测和识别。
免疫荧光技术利用荧光标记物作为示踪剂，将荧光染料标记在特异性抗体上，形成荧光抗体，再与目标抗原结合，形成的抗原-抗体复合物在一定激发波长下能发射出荧光信号，从而实现抗原的定量和定位检测。
样品制备将待检测组织或细胞制备成单细胞悬液，固定在载玻片上，制成涂片或组织切片。
免疫荧光染色将制备好的样品进行预处理，加入荧光抗体标记的一抗，室温孵育一定时间；洗涤后加入荧光标记的二抗，再次室温孵育一定时间；洗涤后加入缓冲甘油等封片介质，封片。
免疫荧光技术
荧光分子的辐射能力在受到激发光较长 时间的照射后会减弱甚至猝灭，一些化合物对 荧光有猝灭作用，因此荧光物质的保存应注意 避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他 化合物的接触。
荧光抗体的制备
作为标记的荧光素应符合以下要求：
①应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团， 与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及 其降解产物易于清除。
基本特点：
①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性 ②酶促反应专一性，保证特异性 ③底物反应放大作用，提高敏感性 ④酶标试剂保存稳定 ⑤操作简便，安全易行
主要试剂的制备与要求
一、酶与酶作用底物
（一）用于标记酶的要求： • 酶活性高 • 标记后酶活性稳定，且不影响标记抗原
与抗体的免疫反应性 • 酶催化底物后信号易判定或测定 • 酶活性不受样品中其他成分的影响 • 酶、辅助因子及底物理化性质稳定，安
标记抗体的纯化：透析法 层析分离法
荧光抗体的鉴定
F/P比率： 将制备的荧光抗体稀释至A280≈1.0，分别
测读A280（蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素 的特异吸收峰
F/P值越高，说明抗体分子上结合的荧光 素越多，反之则越少。一般用于固定标本的 荧光抗体以F/P＝1.5为宜，用于活细胞染色
的以F/P＝2.4为宜。
于自动化，最常用。
2.微颗粒 结合容量大，反应迅速，逐
渐普遍用于自动化分析。
3.膜载体 硝酸纤维素膜（NC）、尼龙
膜等微孔滤膜，广泛应用于定性或半定 量的斑点ELISA。
四、免疫吸附剂
• 免疫荧光用于梅毒螺旋体抗体的检测是梅 毒特异性诊断常用方法之一。
• 用荧光抗体染色法可检出病毒及其繁殖情 况。
• 在寄生虫感染诊断中，间接免疫荧光试验 （IFAT）是当前公认的最有效的检测疟疾 抗体的方法。
免疫荧光技术课件概要ppt
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
3. 四乙基罗达明（tetraethyl rhodamineB200，RB200) RB200是褐红 色粉末状，溶于乙醇和丙酮，不溶于水。 最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为 596～600nm，呈橙红色荧光。因为 RB200比较低廉，广泛用于染色和双标 记示踪或染色。RB200不能直接和蛋白 质结合，要先经五氯化磷（PCI5）作用 下转变成黄酰氯（S02C1），在碱性条件 下易与赖氨酸s氨基反应而结合在蛋白分 子上。其分子质量为580u。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
在一定的条件下，电子可吸收能量 （如光能，热能，电能，机械能等）跃 迁到较高能量级（即激发态），这个过 程叫激发。处于激发态的电子是不稳定 的，它总是要跃迁回到基态，并将多余 的能量释放出来。跃迁方式可能是辐射 跃迁，也可能是非辐射跃迁。以非辐射 跃迁时，能量大多转化为热能，而以辐 射方式跃迁时，能量转化成相应波长的 光，这个过程叫发射。
一、标记方法：
采用FITC标记抗体的方法
常用Marsshall（1958）法标记荧光抗 体，也可以根据条件用Chadwick等 （1960）标记法或Clark等（1963）的透 析标记法。
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免疫荧光方法【精品】
免疫荧光（Immunofluorescence, IF）实验方法免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。
免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。
细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。
这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。
固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。
免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或 Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。
最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。
总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
基本实验步骤：（1）细胞准备。
对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
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两种方法:
• 酶免疫组织化学染色技术（免 疫组化） • 酶免疫测定法（酶联免疫吸附 实验，Enzyme-Linked immunosorbent assay,ELISA)
常用的酶
（一）选择酶的要求
1.自然界存在广，易获得
2.易纯化、性稳、活力高
3.形成的酶结合物稳定，并保留酶、 抗体或抗原的活性
3.洗涤
采用 PH7.2-7.4PBS洗涤，规一化，每 次浸泡1~2min，拍干，共洗涤3~4次
4.酶促反应条件
温度 37℃
时间 10min
pH 5.5
底物量 一致
5.排除干扰：多设 对 照
ELISA试验应设对照
应设对照
阳性对照
阴性对照
操
作
应得结果
颜色深
颜色浅or无色 无色
同标本一样
同标本一样
原理：
利用酶标记Ag或Ab后不改变Ag、Ab 反应特异性，同时又不影响酶的活性，结 合在AgAb上的酶催化底物，生成有色产 物，根据产物颜色深浅推测出待测物中相 应物质（Ab、Ag)有无及含量多少。
Ag + AbE
AgAbE + 底物 呈色反应
免疫酶技术具有
特异性— Ag、Ab反应
敏感性— 酶的高效催化作用
间接法用得最多
优点：
•制备一种荧光标记二抗（抗抗体）可用 于多种Ab检测 •灵敏度高
3.补体法： 第一步：荧光素标记抗补体； 第二步：已知Ag固定＋待测标本 （Ab？）＋补体——洗涤，＋荧 光标记的抗补体——洗涤，荧光 显微镜镜检
特点：
• 灵敏度高，制备一种荧光抗补体用于多
种检测
• 干扰因素多，补体不稳定，易失活，
1-3h 包被量：100ul
封闭：用0.1~5% 牛血清白蛋白缓冲 液浸泡 0.5小时
2.抗原抗体反应的条件
（1）微碱性有利于抗原抗体结合，故用 pH 7.4 PBS(phosphate buffer saline)洗涤
（2）去污剂有利于AgAb形成，洗液中加 0.05% Tween-20
（3）Ag、Ab反应时间、温度： 一般 37℃、30~40min
洗涤(wash)：PH7.2-7.4 PBS
酶结合物
：酶标抗体或酶标抗原
终止液：2M H2SO4
OPD： • HRP催化后其有色产物为黄色，H2SO4终 止后变为橙色（棕色）。 TMB： • HRP催化后其有色产物为蓝色， H2SO4终 止后变为黄色
二.方法类型和操作步骤
（一）双抗体夹心法
双抗体夹心法步骤： 包被已知Ab 洗涤 加待测 标本（测Ag？） 洗涤 加 酶标Ab 洗涤 加底物 加终止液 观察结果
4.底物来源方便并易保存 5.反应后有色产物能快速测定 6.酶分子量不能太大，太大不易进入 组织细胞内，影响组化染色定位
（二）常用的酶
辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶
葡萄糖氧化酶等
辣根过氧化物酶（Horseradish
peroxidase, HRP)
•一种铁卟啉蛋白质，分子量4.4万， 能进入细胞内 •酶活性强，酶结合物可长期保存
免疫标记技术
用可以微量检测的标记物（示踪 物质）标记抗原或抗体，作为试剂， 与相应抗体或抗原结合反应后，测定 抗原抗体复合物中的标记物，从而推 断所测抗体或抗原有无及量的多少。
免疫标记技术 = 免疫技术+ 标记技术
酶
抗原抗体反应
特异性
示踪物标记
灵敏性
荧光素
同位素
免疫标记技术的主要特点： 高特异性、高灵敏性
(酶免疫测定法)
固相载体
聚苯乙烯
Ag 或 Ab 吸 附 到 固 相 载体上的过程 , 称为 包被
实验中所需酶标抗体的制备方法 同荧光抗体制备： 纯化后的抗体+酶 透析去除游 离酶 测定酶标抗体工作浓度
试验中有关术语及试剂：
包被(coat)：将Ag或Ab吸附在固相
载体上的过程，又称固相化或吸附。包被后， 不能被洗脱。包被缓冲液：PH9.6 CB
酶结合物对照 加酶步加入
底物 对照
空白对照
加底物步加入
只加终止液
无色
无色
（以间接法为例，每孔均已包被Ag）
血清 100ul 酶标二抗100ul 待测 待测 标本 血清 + 阳性 阳性 对照 血清 + 阴性 阴性 对照 血清 + 酶结合 物对照 PBS100ul + 底物 对照 PBS100ul PBS100ul 空白 对照 PBS100ul PBS100ul 底物100ul 终止液100ul + + + +
(二）荧光素
能产生荧光的物质，可作为染料。
常用荧光素：
1.异硫氰酸荧光黄(FITC) 可发出黄绿色荧光
2.四乙基罗丹明（RB200)
发出橘红色荧光
3.藻红蛋白（PE）
发出橙色荧光
（三）荧光显微镜
1.结构：主要组成
A.白炽光源（超高压汞灯）：发射紫外光或兰 紫光； B.两组滤光板:激发滤板（选择合适的激发光 谱）；抑制滤板（抑制紫外光或兰紫光进入视 野，只允许荧光通过。 C.显微镜：普通的光学显微镜。
后到达样品，适用于观察对光可透的 标本） • 落射式（光源从上面到达样品，经 标本反射进入物镜。适用于观察透明 度不好的标本及各种活性组织等）
2.使用注意事项：
•染色后立即检查（荧光易猝灭）
•准备好后开启白炽光源，不能随时启灭。 打开后15分钟才能关闭 •每次使用2小时
•保持室内通风
荧光素可以标记（染色）抗原， 也可以标记抗体 • 标记抗原 • 标记抗体 用得少 用得多
思考题：
1.免疫标记技术的原理 2.免疫荧光技术中最常用的荧光素 是什么？ 3.免疫荧光显微染色的各种方法及 优缺点
免疫酶技术
Immunoenzyme technique
概述：
70年代初在免疫荧光技术基础上建立。
较IF、RIA(radioimmunoassay)更优 越 ,
具有敏感、安全、稳定、易观察结果等优点
2.存在非特异荧光干扰（产生原因：自发、 抗体不纯、交叉反应、技术问题） 3.定性测定、判断结果不客观
4.制备的片子难以长期保存（荧光猝灭）
三.时间分辨荧光免疫测定
（液相检测）
原理：
用铕(Eu)等具有较长荧光寿命的稀 土金属作荧光标记物来标记Ab或Ag ，从而检 测待测标本中相应Ag或Ab的新技术。 其特点是：利用时间分辨荧光仪延缓检测时间， 排除非特异性干扰荧光。 灵敏度可达0.2 ~1 ng/ml。
（四）竞 争 法
步骤： • 待测管：已知Ab包被＋待测标本 （Ag？）—— 洗涤，＋酶标 Ag——洗涤，＋底物——显色
先加
先加
（五）应用亲和素和生物
素的ELISA
亲和素(avidin)：糖蛋白，一分子 由四个亚基组成，每一亚基可以与一 分子生物素结合 生物素(biotin)：维生素H，可与蛋 白质、糖类、酶类等结合，与亲和素 特异结合后极稳定
•最适pH为5.5左右
选用时注意酶纯度和活性
纯度：RZ表示，反映酶含量与蛋白含 量之比，最好要RZ值为3.0左右 活性：每1mg酶中所具有的活性单位， 应大于250u/mg
HRP的底物：
反应体系中作为供氢体
HRP
邻苯二胺(OPD),四甲基联苯胺（TMB）
DH2+H2O2
D+2H2O 有色产物
供氢体 受氢体
生物素
生物素
亲和素
生物素
生物素
亲和素— 生物素在ELISA中使用：
三.ELISA结果的判定
（一）肉眼判定
与阳性、阴性对照颜色比较：
结果判定
1.若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性； 2.若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判 定为阳性； 3.若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照 孔之间则判定为弱阳性。
2.注意保持抗原完整性
3.不同材料固定方法不同（无水已醇、 丙醇、聚甲醛等）
（三）荧光抗体染色法
1.直接法 待测标本固定（Ag？） 洗涤， AgAb
• 快、直接、干扰因素少
• 用于检测抗原
+ Ab
• 每检测一种抗原需标记相应的荧光抗 体,较麻烦
2.间接法
分两步： 第一步：荧光素标记抗抗体（如荧光 标记的羊抗人IgG）； 第二步：已知Ag固定＋待测标本 （Ab？）——洗涤，＋荧光标记的 抗抗体——洗涤，荧光显微镜镜检
• 该法主要用于测抗体
• 酶标记一种抗抗体可以用于多种抗 体的检测
包被抗体
加标本 （抗原）
加抗体
加酶标抗 抗体
间接法测抗原
（三）双位点一步法
• 步骤：包被抗体A＋待测标本 ＋酶标抗体B ——洗涤，＋底物——终止液，观察结果
（检测Ag，Ag至少含A、B两个抗原表位）
该法是一次性加入标本和酶标抗体，试 验程序简单，提高了检测的特异性 用于检测Ag , 且Ag是具有至少2种抗原表 位的多价抗原 反应系统中固相Ab与酶标Ab的量相对于 待测Ag是过量的，因此复合物的形成量 与待测Ag含量成正比（在方法可检测范 围内）
该法少用
4.双标记法
用两种荧光素（FITC、罗丹明） 分别标记针对同一Ag上不同抗原表位 的抗体，对同一标本染色，当Ag有两 种相应抗原表位存在时，可同时见到 黄绿和橙红两种荧光。
（四）免疫荧光显微技术优缺点
优点：
1.特异性、敏感性高Ab
缺点：
1.需要荧光显微镜
一般免疫荧光显微技术均标记抗体
二.免疫荧光显微技术
（一）荧光抗体的制备 （二）片子的制作 （三）荧光抗体染色方法
（一）荧光抗体的制备：
纯化的一定量抗体 加一定量 FITC(搅拌使结合） 去除游离荧