8基因工程菌发酵

2、培养方式

（1）补料分批培养
将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续
地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。
（2）连续培养
将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后，开动进料和出
料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。
（3）透析培养
利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中
的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。
（4）固定化培养
酿酒酵母的高密度培养及人免疫干扰素的表达



人α2α型干扰素（IFN-α2α）是国外已大量生产 和广泛应用的抗病毒及抗肿瘤多肽药物。 它是由165个氨基酸组成的单链多肽，相对分子质量 为19219U。 它对不同人体肿瘤有抗增生作用，抑制病毒核酸密 码的转录和分解病毒的RNA核酸，是一种具有调节免 疫力，治疗乙型、丙型肝炎、白血病、卡波氏肉瘤 等疗效的多功能细胞因子。
乙型肝炎疫苗 组织血纤维蛋 Activase 白溶酶激活 剂——TPA 抗T-细胞单克 Orthoclone OKT-3 隆抗体
低于30 170
Ortho
低于15
一、基因工程菌培养的特点

是外源蛋白在宿主细胞内的异源表达，不同于微生物的天然次级代谢药 物，因此在调控合成方式上，应该主要受限于质粒或噬菌体的内在性 质； 是蛋白质产物，不同于种类多样的次级代谢产物； 合成途径简单，没有复杂的多酶系统； 产物的积累主要在胞内，分泌型也主要积累在细胞周质中； 产物在胞内积累通常是以包涵体的形式； 分离纯化相对于次级代谢产物而言要简单、一致； 产物分离纯化后可能没有活性，需要进一步的复性。
环境 保护
Leabharlann Baidu
美国批准生产的主要生物技术治疗药物
通称 人胰岛素 人生长激素 α-干扰素 商品名 Humulin Protropin Humareope Intron A Referon A 生产公司 Eli Lilly Genentech Novo Eli Lilly Schering-Plougn Hoffman La Roche Merck Genentech 用途 治疗糖尿病 治疗儿童生长 发育不良 治疗毛细胞 白血病 防治乙肝 治疗心脏病突 发症 治疗肾移植抗 异 1988年销售额 （105美元） 115 150 78～80

基因工程药物是转基因产品，具有潜在的危险，因 此对产生菌的管理要求严格，应该避免各种可能的 扩散污染，必须在合格的GMP生产车间进行。 基因工程药物的GMP是对生产全过程的质量管 理，涉及人员、厂房、设备，原材料采购入库、检 验、发料、加工、制品及半成品检验、分包装，成 品检定，产品销售、运输，用户意见及使用反应处 理等在内的全过程的质量管理。
三、宿主-载体系统
宿主的选择主要考虑产物的活性表达和宿主 的安全性。如果用于食品要考虑宿主菌是否 列入FDA表中，列入的认为是安全的菌。 一般的原则是根据所用的载体体系及各种受 体细胞的基因型进行选择，要使重组体的转 化或转染效率高、能稳定传代、受体细胞基 因型与载体所含的选择标记需匹配。

1、原核细胞

宿主：
酵母工程菌为DOC4（Cir0，pHC11-IFNαAl），由重组质粒pHC11-
IFNαAl（由人-αA干扰素基因表达分泌单元插入高稳定载体 pHC11构成）转化Saccharomyces carlsbergensis DOC4（Cir0， MATa，ade1，leu2-04）得到，在磷酸甘油激酶（PGK）启动子下 表达IFN-α2α。
五、基因工程产物的分离纯化

一般不应超过4～5个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩 与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。 色谱分离技术最常用，分为离子交换色谱、疏水色谱、反相 色谱、亲和色谱、凝胶色谱、高压液相色谱等。 在纯化过程中，需特别注意3种可能存在的非蛋白类杂质— —DNA、热原质和病毒。 常用保存方法：低温，高浓度，冻干。
二、基因工程药物制造的一般流程
（1）获得目的基因； （2）组建重组质粒； 上游阶段 （3）构建基因工程菌； （4）培养工程菌； （5）产物分离纯化； （6）除菌过滤； 下游阶段 （7）半成品检定； （8）包装


1、上游阶段：首先获得目的基因，然后用限制性内切酶和 连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并转大肠杆菌 或其它宿主菌（细胞），以便大量复制目的基因。选择基 因表达系统主要考虑的是保证表达功能，其次要考虑的是 表达量的多少和分离纯化的难易。其中的（1）、（2）、 （3）步骤属于上游阶段，在实验室完成。 2、下游阶段：将实验室成果产业化、商品化，它主要包括 工程菌大规模发酵最佳参数大的确立，新型生物反应器的 研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控 制，高纯度纯品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪 表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。上述（4）、 （5）、（6）、（7）、（8）等属于下游阶段。
（1）大肠杆菌：目前采用最多的原核表达体系。 （2）枯草芽孢杆菌 （3）链霉菌
2、真核细胞
（1）酵母：酿酒酵母应用广泛。 （2）丝状真菌 （3）哺乳动物细胞 （4）植物细胞
四、基因工程菌发酵
1、培养过程
通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如 温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分拆 表达产物的合成、积累对受体细胞的影响； 通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以 及顺序。
第八章 基因工程菌培养

基因工程菌生产的主要产品有二类：
非蛋白质，通过代谢工程细胞来获得，这些细胞
插入编码酶的DNA，产生新的途径或增强某一途 径，从而得到新的化合物或增加产量。
蛋白质，现代基因工程重点
一些正在开发或已开始生产的DNA重组技术产品
食品 及饲 料添 加剂 农业 化工 及能 源原 料 氨基酸 食品加工酶 单细胞蛋白 植物品种改良（包括增加产量，提高蛋白质含量，改进抗逆性能，具有固氮能力等） 生物杀虫剂 用生物物质生产甲烷、甲醇、乙醇、丙酮-丁醇、多元醇、有机酸等 用于化学品或生物物质（如纤维素）转化所需要的酶 用生物催化方法生产环氧烷烃、聚羟基丁酸酯（PHB）等 用藻类生产碳水化合物、蛋白质等物质 生产黄原胶等粘性物质（以提高油井的采油量） 高效生物降解或解毒菌种

培养条件：
当基础料中腺嘌呤含量为20μg/mL，在发酵进行至12h时再加入
20μg/mL 腺嘌呤时，IFN- α2α生物活性及比活分别达到了7.3 ×106 IU/mL和6.77×107 IU/mL。 发酵过程中后期补入适量葡萄糖，且维持低糖水平，有利于表达。 维持总碳源含量不变，使培养基中葡萄糖与蔗糖的比例为1:0.1， 结果IFN-α2α生物活性及比活比对照增加了一倍以上。 在发酵进行至12h时，加入2 g/L谷氨酸时，IFN- α2α生物活性 及比活分别比对照提高了1.76倍及1.94倍，而添加0.25～1.0 g/L 赖氨酸也能显著提高表达水平。 培养基初始pH对产物表达有较大影响，初始pH为6.5时，对表达最 有利。