参与碱基切除修复的AP内切酶1的克隆

第２６卷第６期２００８年１２月石河子大学学报（自然科学版）ＪｏｕｍａｌｏｆＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ）Ｖ０１．２６Ｎｏ．６Ｄｅｃ．２００８文章编号：ＩｉＸ／７．７３８３（２００８）０６－０７１３－０４参与碱基切除修复的ＡＰ内切酶１的克隆和蛋白质纯化顾永清１，一，ＫＡＭＩＹＡＫｅｎｊｉ２（１石河子大学医学院，新疆石河子８３２００２；２日本广岛大学原爆放射线医科学研究所，广岛７３４８５５３）摘要：碱基切除修复途径是去除氧化和甲基化碱基的最主要途径。

在碱基切除修复过程中，多个蛋白质，诸如ＤＮＡ糖基酶、ＡＰＥＩ内切酶、ＤＮＡ聚合酶ｂｅｔａ和ＤＮＡ连接酶在体内的精密调节下高度协调地作用，从而切除受损碱基，使ＤＮＡ恢复正常序列。

碱基切除修复对维持基因组的稳定及抑制肿瘤发生等生理过程有重要作用。

为了迸一步从分子水平阐明ＡＰＥＩ的作用机制，我们从ＨｅＬａ细胞的ｅＤＮＡ文库中克隆得到ＡＰＥＩ基因，使ＡＰＥＩ在大肠杆菌中得到表达，并用蛋白质纯化的快速液相层析法经过一系列层析柱纯化了重组ＡＰＥＩ蛋白质，ＡＰＥＩ的生物化学功能研究正在进行中。

关键词：碱基切除修复；ＡＰ内切酶ｌ；蛋白质纯化中图分类号：Ｒ７３８．１文献标识码：ＡＤＮＡ复制的保真性是维持物种相对稳定的主要因素，但由于ＤＮＡ不稳定的化学性质每天每个细胞会发生１０，０００个自发损伤…。

其中最常见的损伤是由体内氧代谢产生的氧自由基引起的碱基氧化。

此外，ＤＮＡ碱基还能被甲基化试剂及体内甲基化酶甲基化【２Ｊ２。

碱基切除修复就是漫长的进化过程中发展出来的切除受损碱基的修复机制［２＇３］。

碱基切除修复是涉及众多基因参与的复杂的生理生化过程，有很多病例表明参与碱基切除修复的基因突变能够引起癌的发生，从而暗示了碱基切除修复在人体内是一种肿瘤抑制机制【４，５】，但目前对碱基切除修复的反应机制尚不完全明了。

一般认为碱基切除修复首先由ＤＮＡ糖基酶切除受损的碱基，产生无嘌呤／嘧啶位点（ａｐｕｒｉｎｉｅ／ａｐｙｒｉｍｉ—ｄｉｎｉｃｓｉｔｅｓ，ＡＰｓｉｔｅｓ），ＡＰ位点能被ＡＰ内切酶切除，最后由ＤＮＡ聚合酶ｂｅｔａ以及ＤＮＡ连接酶完成修复过程【６－８］。

其中ＡＰ内切酶起着至关重要的作用。

人类细胞中数量最大最重要的ＡＰ内切酶是ＡＰＥＩ（棚．ｎｉｅ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ１）【９｜，到目前为止，关于人类ＡＰＥｌ的作用方式及作用机制所知甚少。

为了进一步从分子水平阐明ＡＰＥｌ的作用机制，我们从ＨｅＬａ细胞的ｅＤＮＡ文库中克隆得到了ＡＰＥＩ基因，使ＡＰＥｌ在大肠杆菌中得到表达，并用蛋白质纯化的高效液相法经过一系列层析柱纯化了重组ＡＰＥＩ蛋白质，ＡＰＥｌ的生物化学功能研究正在进行中。

１材料与方法１．１所用菌株与质粒构建ＡＰＥＩ克隆重组体的质粒为ＰＣＲ２．１－ＴＯＰＯ（１ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），转化菌株为Ｅ．ｃｏｌｉＴＯＰＯＩＯｓｔｒａｉｎ（ＴｏｐｏＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。

构建ＡＰＥＩ表达重组体的质粒为ｐＥＴ２０ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ），表达菌株为Ｅ．ｃｏ／／Ｂ１２１（ＤＥ３）（Ｐｒｏｍｅｇａ）菌株。

１．２蛋白质纯化系统快速液相蛋白质纯化系统（ＧＥＨｅａｌｔｈｅａｒｅ）、硝酸纤维素（矾ａｔ砌ｎＰ１１）、ＲｅｓｏｕｒｃｅＳ柱（Ａｍ脯ｈａｍＰｈａｒ－ｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）、Ｑ职柱（ＡｌＩ．ｅ隋ｈ舢ＰｈａｎｍｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）、Ｈｅｐａｒｉｎ（ＡｍｅｒＳｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００柱（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）ｏ１．３克隆所用引物正向弓ｌ物：５’．ＣＡＴＡ僦ＣＧＡＡＧ℃ＧＴＧＧＢＡＡＡＡＡ．ＧＧＧＡ；收稿日期：２００８－０９．１２作者简介：顾永清（１９７０－），女，剐教授，从事ＤＮＡ损伤修复、ＤＮＡ解螺旋酶及砷毒作用分子生物学机制研究；ｅ－ｍａｉｌ：ｙｑｇｕ９６＠ｙａｈｏｏ．唧ｎ。

７１４石河子大学学报（自然科学版）第２６卷反向弓Ｉ物：５’一Ｇ刁Ｘ、ｒｒＣＡＣＡＧｌＹ姗ＡＧ研ＡＴ＾Ｇ。

１．４质粒构建以ＨｅＩＪａ细胞的ｅＤＮＡ文库为模板，通过正向引物和反向引物ＰＣＲ扩增ＡＰＥＩ阅读框（ＯＲＦ），插入ＰＣＲ２．１－ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）克隆载体，转化ｐＥＴ２０ｂ（Ｎｏ－ｖａｇｅｎ）菌株产生重组克隆质粒ｐＡＰＥｌ。

ｐＡＰＥＩ经Ｅｃ—ｏＲＩ和ＮｄｅＩ酶切插入Ｅｃ０Ｉｕ和ＮｄｅＩ酶切的表达载体ｐＥＴ２０ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ），产生重组表达质粒ｐＥＴＡＰＥｌ。

１．５重组蛋白质ＡＰＥｌ在大肠杆菌中的过量表达和纯化重组质粒ｐＥＴＡＰＥｌ转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｐｒｏｍｅｇａ）菌株，于１０Ｌ含有２５０／唔／ｍＬ的ＬＢ培养液中培养，当细菌培养物生长到分光光度计（Ｕ．２８００，ＨｉｔｃｈＨｉ【ｇｈ—ＴｅｅｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎ）波长为６００ｎｍｏｌ／Ｌ，吸光度值为０．６时加人Ｉｍ（２００／ｍａｏｌ／Ｌ）。

继续培养９０ｍｉｎ，于４℃，８０００ｒ／ｍｉｎ，收获细胞，并悬溶于ＢｕｆＩ５０ｍｍｏｌ／ＬｈｅｐｅｓＮａＯＨ（ｐＨ７．５），ｌｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，０．Ｉｍｍｏｌ／ＬＩＹｌＴ，１０％ｓｕｃｒｏｓｅ，于液氮中冷冻。

将１５９冷冻细胞于冰水融化，再于５ｍＬＢｕｆＩ（含有ｌＯＯｍｍｏｌ／Ｌ亚精胺，４ｍｇ／ｍＬ溶菌酶）裂解。

裂解液冰浴３０ｒａｉｎ，３７℃水浴２ｍｉｎ，再冰浴３０ｍｉｎ，８５，嘁离心３０ｍｉｎ，２次，得到细胞裂解液（ｆｒａｃｔｉｏｎＩ）。

细胞裂解液于５５％硫酸铵盐析，溶解蛋白质再用８０％硫酸铵沉淀，沉淀蛋白质用ＢｕｆＡ５０ｍｍｏｌ／ＬｈｅｐｅｓＮａＯＨ（ｐＨ７．５），Ｉｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，０．１ｍｍｏｌ／ＬⅣ兀＇，１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ悬溶并于ＢｕｆＡ透析（ｆｒａｃｔｉｏｎ１Ｉ）。

将ｆｒａｃｔｉｏｎＩＩ加到２０．ｍＬ的磷酸纤维素柱，用含有１００～７５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ的ＢｕｆＡ洗脱ＡＰＥＩ蛋白质，收集含有ＡＰＥｌ的洗脱峰并于ＢｕｆＡ（１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ）透析（ｆｒａｃｔｉｏｎ１１Ｉ）。

透析液上样于ＲｅｓｏｕｒｃｅＳ柱，用含有１００～２５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的ＢｕｆＡ洗脱ＡＰＥＩ蛋白质，收集含有ＡＰＥｌ的洗脱峰（ｆｒａｃｔｉｏｎⅣ）。

洗脱蛋白质上样于ＱＨＰ柱，用含有１００～１０００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ的ＢｕｆＡ洗脱，收集含有ＡＰＥＩ的流出液（ｆｒａｃｔｉｏｎＶ）Ｉ－＿样于Ｈｅｐ－ａｒｉｎ柱，用含有１００～７００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ的ＢｕｆＡ洗脱ＡＰＥｌ蛋白质，收集含有ＡＰＥｌ的洗脱峰（ｆｒａｃｔｉｏｎＶＩ）。

上样于Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００柱，用ＢｕｆｆｅｒＡ（２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＱ）洗脱，收集ＡＰＥｌ洗脱液（ｆｒａｃｔｉｏｎＶｌＩ）。

２结果２．１ＡＰＥｌ蛋白质在大肠杆菌的表达含有ＡＰＥｌ蛋白质的重组质粒ｐＥＴＡＰＥｌ经ＤＮＡ测序证明序列正确，转化大肠杆菌，由ＩＰＴＧ诱导后在大肠杆菌提取液中可见一诱导表达蛋白质，ＳＤＳ．ＰＡＧＥ后分别由考马斯亮蓝染色和银染色证明蛋白质分子量约为３６ｋＤａ（图１），与ＡＰＥＩ（３５．６ｋＤａ）大小一致，表明ＡＰＥｌ在大肠杆菌中成功表达。

ａ：考马斯亮蓝染色ｂ：银染；Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；１：ＷＩＧ诱导前；２：ＩＦＩＶ，诱导后图１ＡＰ白蛋白质在大肠杆菌中表达的ＳＤＡ－ＰＡＧＥ分析２．２重组ＡＰＥｌ蛋白质的纯化含有ＡＰＥｌ蛋白质的大肠杆菌热裂解法裂菌，经５５％硫酸铵沉淀杂蛋白质，再由８０％硫酸铵沉淀ＡＰＥｌ重组蛋白质，透析除去多余盐分后上样于磷酸纤维素柱，经含有１００～７５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的ＢｕｆｆｅｒＡ洗脱后，在大约３３０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ处洗脱出ＡＰＥＩ蛋白质洗脱液（图２），收集洗脱峰ｆｒａｃｔｉｏｎ４３—４８，经１００ｍｍｏｌ／ＬｂｕｆｆｅｒＡ透析后，再上样于ＲｅｓｏｕｒｃｅＳ柱，经含有１００—２５０ｎｍ砸Ｌ／Ｌ的ＢｕｆｆｅｒＡ洗脱后，ＡＰＥｌ蛋白质于２１０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ处洗脱出来（图３）。

图２ＡＰ日蛋白质经磷酸纤维素柱层析后的ＳＤ§ＰＡＧＥ分析第６期顾永清，等：参与碱基切除修复的ＡＰ内切酶１的克隆和蛋白质纯化７１５Ｍ：ｍａｒｋｅｒ；ｌｏａｄ上样液；３６～５４：蛋白质洗脱液；箭头：ＡＰＥＩ蛋白质；大括号：杂蛋白质；２～６：１９０—２［ＩｉｎｍＯ．／ＬＮａＧ的洗脱液；７—１６：２［Ｉ）一２２Ｙｍｌｎｄ／ＬＮａＧ的若ｔ脱液；１７—２０：２２５～２３５ｎｆｆｉｍＵＬＮａＯ的洗脱液图３ｇｌ：，Ｅｌ蛋白质经Ｆｔ药ａｘｓｅＳ柱层析后的ＳＤ＆ＰＡＧＥ分析收集洗脱峰ｆｒａｃｔｉｏｎ４３～４６，再上样于Ｑ．肿柱，回收流出液上样于Ｈｅｐａｒｉｎ柱，ＡＰＥｌ蛋白质于４７８ｍｍｏＶＬＮａＣＩ处洗脱（图４），收集洗脱峰ｆｒａｃ．ｔｉｏｎ３１，３２，上样于Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００，ＡＰＥＩ蛋白质在大约１５．１ｍＬ处洗脱出来，收集洗脱峰ｆｒａｃｔｉｏｎｌ５，即为纯３讨论Ｆｒ：蛋白质洗脱液：箭头；ＡＰＥｌ蛋白质；１—４：１９２—３４０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的洗脱液；５～１４：３４０—４６（ｈｎｍｏｌ／ＬＮａＣＩ的洗脱液；１５—１９：４６０～５ＩＤ隆瑚ｄ／ＬＮａＯ的洗脱液圈４＃Ｊ：Ｅ１蛋白质经ＨＥ阳一ｎ柱层析后的ＳＤＳ－ＰＡ（芏分析化的ＡＰＥＩ蛋白质（图５）。

纯化的ＡＰＥｌ蛋白质浓度以ＢＳＡ做标准蛋白质，Ｂｉｏ．Ｒａｄ蛋白质定量法测得浓度为３．２ｔｃ，／ｍＬ。

各阶段的纯化组分ＳＤＳ．ＰＡＧＥ见图５。

ａ＇－考马斯亮蓝染色ｂ：银染箭头：ＡＰＥｌ蛋白质；星号：降解的ＡＰＥＩ蛋白质；Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；ｌ：∥１１Ｇ诱导前；２：ＩＰＩＧ滂导后；３～８：ｆｒａｃｔｉｏｎｌｌ．Ｖｌｌ，蛋白质的上样量为２ｐ．ｇ圈５Ｐｄ：＇Ｅ１蛋白质各个纯化过程所得样品的ＳＤ§ＰＡＧＥ分析碱基切除修复途径是除去氧化和甲基化碱基的最主要途径。

在碱基切除修复过程中，多个蛋白质，如ＤＮＡ糖基酶、ＡＰＥＩ内切酶、ＤＮＡ聚合酶ｂｅａ和ＤＮＡ连接酶在体内的精密调节下高度协调作用，从而切除受损碱基，使ＤＮＡ恢复正常序列［６－８］。

因此，碱基切除修复对维持基因组稳定至关重要。

参与碱基切除修复的蛋白质的功能丧失可导致肿瘤发生，暗示了碱基切除修复可能是人体内的肿瘤抑制机制［１０’１２１。

流行病学的研究也支持这一推测。

遗传性非息肉结肠癌主要是由于参与切除修复ＤＮＡ的基因突变，这提供了一个直接证据说明ＤＮＡ碱基切除修复的功能下降会导致肿瘤发生【４，５Ｊ。

由于碱基切除修复在维持基因组稳定，抑制肿瘤发生等很多生理活动中都有重要作用，因此对碱基切除修复机制的研究具有重要的医学意义。