高效液相色谱讲义
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高效液相色谱讲义
高效液相色谱法色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。
后来逐渐发展了柱色谱法，纸色谱法，气相色谱法，高效液相色谱法。
高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。
高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。
现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。
不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作。
经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。
而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9 107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器。
一、分离原理及分类。
二、HPLC与GC差别三、HPLC与经典LC区别四、高效液相色谱仪流程图。
五、HPLC 特点.一、液相色谱分离原理及分类和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相——固定相和流动相组成。
液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。
被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。
根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。
色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。
二、HPLC与GC差别✓相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测✓主要差别：分析对象的差别和流动相的差别✓液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。
液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。
高效液相色谱的基本参数讲义
4.0×10-11
0.4
6.4×10-11
Hdc²: 容积消耗指标
Hdc²qmin: 包括检测器在内的整个系统检测能力指标
qmin: 浓度型监测器的最小检测量
24
色谱流出曲线的描述
htA 2 0 ex (p tt2 g t)2t d t
1.11
0.250
6.3
5×10-10 1.3×10-10
15cm×2mm 1.1 15cm×2mm 8.7 20cm×1mm 1.0 20cm×1mm 9.0
1.18
0.040
1.10
0.054
1.84
0.010
1.10
0.016
1.0
4×10-10 1.6×10-1
1.6
2.6×10-10
0.3
17
色谱峰的有关参数
W½ =a + bt
18
几种描述分离状况参数的关系
Rstr(2)tr(1) (tr(2) 1)tr(1) (d1) N 1
W 1/2
tr(1)
W 1/2
5.54
两峰分离的必要条件： 1、两组分的保留值不同 2、样品组分应有一定的保留值 3、色谱柱应具有分离必须的柱效
空柱管体积（Vc ) * 总孔隙度（εT)
to=
流动相体积流速（F c)
= π/4 *d²c *L * εT/Fc
计算孔隙度
4
§2 选择性指标(´)和相对保留值()
´= t r(2) / tr(1) =(1+ k´(2)/(1+ k´(1)) = t r '(2) / tr' (1) = k´(2) / k´(1) ´作为选择性指标比 直观
高效液相色谱法指导培训讲义
常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。
高效液相色谱法指导培训 讲义
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
高效液相色谱法指导培训 讲义
胶束色谱(micellar chromatography)
• 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
• 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
▪进样阀
高效液相色谱法指导培训 讲义
定量圈 1
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
高效液相色谱法指导培训 讲义
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
高效液相色谱法指导培训 讲义
胶束色谱(micellar chromatography)
• 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
• 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
▪进样阀
高效液相色谱法指导培训 讲义
定量圈 1
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
高效液相色谱的基本参数讲义
降低检测器噪声
通过优化检测器条件，如调整光 源强度、选择合适的滤光片等， 可以降低检测器噪声，从而提高 信噪比和灵敏度。
增加进样量
在保证色谱柱不过载的前提下， 适当增加进样量可以提高检测器 的响应值。
灵敏度与检测器选择关系
不同检测器灵敏度差异
不同类型的检测器对同一物质的灵敏度可能存在较大差 异，如紫外检测器对含有共轭体系的化合物具有较高的 灵敏度，而荧光检测器则对某些具有荧光特性的化合物 具有较高的灵敏度。
改变柱温
选择合适的色谱柱
柱温升高，分子运动加快，保留时间缩短 ；柱温降低，保留时间延长。但需注意柱 温过低可能导致色谱柱效能下降。
根据分析需求选择合适的色谱柱类型、粒径 和长度，以获得理想的保留时间。
保留时间预测模型
线性溶剂强度模型
假设溶质在固定相和流动相之间的分配系数与流动相组成 呈线性关系，通过实验数据拟合得到线性方程，可用于预 测不同流动相组成下的保留时间。
仪器组成与工作流程
01
仪器组成
高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、色谱柱、检 测器、数据记录与处理系统等部分组成。其中输液系统包 括储液器、泵、流动相梯度程序等；进样系统包括进样器 、定量环等；色谱柱是实现分离的核心部件；检测器用于 对分离后的组分进行检测；数据记录与处理系统则用于数 据的采集、处理和分析。
使用后，应及时清洗色谱 柱，避免残留物对色谱柱 造成损害。
ABCD
在使用前，应对色谱柱进行 充分的平衡和条件化，以确 保其分离效果和稳定性。
长期不使用的色谱柱应妥 善保存，并定期进行检查 和维护。
仪器操作规范与安全防护
01
操作人员应熟悉仪器的结构、原理和操作方法，并按照规范进行操作。
高效液相色谱法 讲课文档
CH2CH3
resin-O-CH2-COOresin-O-(CH2)3-SO3-
Buffer: PBS + NaCl
Tris-HCl + NaCl
Gradient: Yes
现在十八页，ห้องสมุดไป่ตู้共六十页。
Ion Exchange Chrom
现在十九页，总共六十页。
Affinity Chromatography
基 质
配基
目标产物
填料：
基质--- 纤维素、凝集素、交联 琼脂糖或葡萄糖、聚丙烯酰胺 、多孔玻璃…
配基--- 抗体、凝集素、酶、抑 制剂、抗生素、配位体…
现在二十页，总共六十页。
Affinity Chromatography
柱的选择：根据被分离目标产物的特点选择合适的 色谱柱，重要是配基。 影响因素：配基容易被杂质污染，柱子的寿命短， 样品须前处理。主要用于纯化较为昂贵的蛋白，抗 体等。
Free ligand concentration
Buffer: 含有可以与基质上的 配基结合物的溶液 Gradient: Yes
现在二十一页，总共六十页。
UV absorbance
Hydrophobic interaction Chromatography
nonpolar
--
protein surface
+++
nonpolar
O
H3C-C-N-C-
O-
NH
填料：
基质：有机聚合物（交联琼脂 糖、乙烯聚合物、TSK-PW） 和大孔硅胶键合相
H3C-C-N-C-OO NH
配基： 苯基、戊基、丁基、羟 丙基、乙基、聚乙二醇、苄基 等
resin-O-CH2-COOresin-O-(CH2)3-SO3-
Buffer: PBS + NaCl
Tris-HCl + NaCl
Gradient: Yes
现在十八页，ห้องสมุดไป่ตู้共六十页。
Ion Exchange Chrom
现在十九页，总共六十页。
Affinity Chromatography
基 质
配基
目标产物
填料：
基质--- 纤维素、凝集素、交联 琼脂糖或葡萄糖、聚丙烯酰胺 、多孔玻璃…
配基--- 抗体、凝集素、酶、抑 制剂、抗生素、配位体…
现在二十页，总共六十页。
Affinity Chromatography
柱的选择：根据被分离目标产物的特点选择合适的 色谱柱，重要是配基。 影响因素：配基容易被杂质污染，柱子的寿命短， 样品须前处理。主要用于纯化较为昂贵的蛋白，抗 体等。
Free ligand concentration
Buffer: 含有可以与基质上的 配基结合物的溶液 Gradient: Yes
现在二十一页，总共六十页。
UV absorbance
Hydrophobic interaction Chromatography
nonpolar
--
protein surface
+++
nonpolar
O
H3C-C-N-C-
O-
NH
填料：
基质：有机聚合物（交联琼脂 糖、乙烯聚合物、TSK-PW） 和大孔硅胶键合相
H3C-C-N-C-OO NH
配基： 苯基、戊基、丁基、羟 丙基、乙基、聚乙二醇、苄基 等
第十二章讲义高效液相色谱
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相柱 色谱装置
高效液相色谱仪
例：分离20种氨基酸
经典柱色 谱
柱长：170 cm 柱径：0.9 cm F：30 mL/h t分离: >20 h
HPL C
t分离：1 h
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相色谱法
固定相 固定相粒度（μm） 固定相粒度分布(RSD) 柱长（cm） 柱内径（cm） 柱 入 口 压 强 （ kg/cm2 ） 柱效(每米理论塔片数) 样品用量（g） 分析所需时间（h） 装置
液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为： ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡
过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。 而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提 高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以 上的液体作流动相，增大分离的选择性。
其是在生物学和医学等方面应
用极为广泛。如氨基酸、蛋白
质、核酸、烃、碳水化合物、 分
药品、多糖、高聚物、农药、
子 量
抗生素、胆固醇、金属有机物
等 分 析 ， 大 多 是 通 过 HPLC 来
完成的。
右图是各种HPLC方法的应
用范围及对象
极性增加 不溶于水 非极性
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向分配
正向分配 离子交换
主要由接管、检测器流通池体积及检测器响应时间 等因素所引起。因此，尽可能用短而内径细的接管， 减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应速度 等都是克服柱后展宽的途径
第二节 高效液相色谱仪
一、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐(滤棒，可滤去颗粒状物质) 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
第十四章高效液相色谱法讲课文档
3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔 型和全多孔型固定相两类。
2299
第二十九页，共57页。
流动相
由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并 参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的 分离度。对流动相溶剂的要求是：
1.化学惰性，不与固定相和被分离组分发生化学反应，保证 柱的稳定性和分离的重现性。
检测能力还可以提高一个数量级以上；
⑤分析时间快，HPLC-MS使用的液相色谱柱为窄径柱，缩短了分析 时间，提高了分离效果； ⑥自动化程度高，HPLC-MS具有高度的自动化。
2266
第二十六页，共57页。
附属系统
• 脱气
• 梯度淋洗
• 预饱和柱和预柱 • 恒温 • 自动进样 • 馏分收集 • 数据处理
1.氟塑料池体,2.工作电极,3.氟塑料或聚酯 垫片,4.接参比电极，至废液，5.接色谱柱 。
2244
第二十四页，共57页。
蒸发光散射检测器
(Evaporation Light Scattering Detector, ELSD)
1.色谱柱出口; 2.液压释放口; 3.氮气入口; 4.雾化器; 5.加热漂移管; 6.样品液滴; 7.激光光源; 8.排气口; 9.光电检测器; 10.放大器;
1122
第十二页，共57页。
高效液相色谱柱
1.色谱柱类型
按内径大小可大致分为常规分析柱、制备或半制备柱 、小内径或微径柱、毛细管柱四种类型。
2.保护柱
一般在分析柱前装上较短的保护柱，不仅可除去
溶剂中的颗粒杂质和污染物，而且可除去样品中含有 与固定相不可逆结合的组分，以保护较昂贵的分析柱 ，延长使用寿命。
16
2299
第二十九页，共57页。
流动相
由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并 参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的 分离度。对流动相溶剂的要求是：
1.化学惰性，不与固定相和被分离组分发生化学反应，保证 柱的稳定性和分离的重现性。
检测能力还可以提高一个数量级以上；
⑤分析时间快，HPLC-MS使用的液相色谱柱为窄径柱，缩短了分析 时间，提高了分离效果； ⑥自动化程度高，HPLC-MS具有高度的自动化。
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第二十六页，共57页。
附属系统
• 脱气
• 梯度淋洗
• 预饱和柱和预柱 • 恒温 • 自动进样 • 馏分收集 • 数据处理
1.氟塑料池体,2.工作电极,3.氟塑料或聚酯 垫片,4.接参比电极，至废液，5.接色谱柱 。
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第二十四页，共57页。
蒸发光散射检测器
(Evaporation Light Scattering Detector, ELSD)
1.色谱柱出口; 2.液压释放口; 3.氮气入口; 4.雾化器; 5.加热漂移管; 6.样品液滴; 7.激光光源; 8.排气口; 9.光电检测器; 10.放大器;
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第十二页，共57页。
高效液相色谱柱
1.色谱柱类型
按内径大小可大致分为常规分析柱、制备或半制备柱 、小内径或微径柱、毛细管柱四种类型。
2.保护柱
一般在分析柱前装上较短的保护柱，不仅可除去
溶剂中的颗粒杂质和污染物，而且可除去样品中含有 与固定相不可逆结合的组分，以保护较昂贵的分析柱 ，延长使用寿命。
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中国药典 高效液相色谱讲义
26
英国药典2000年版
? 附录ID 液相色谱法，简要叙述了仪器、方法、归一化法、效能及 与正文有关的内容。在方法项下，说明要用对照溶液测试，以决 定仪器的设置和获得适当响应的注样量，进行重复进样以验证重 复性，必要时，还要检测理论板数。
? 除另有规定外，测定被测物峰的峰面积。若被测物峰的对称因子 为0.8-1.2，也可测定峰高。在应用梯度洗脱时，则测定峰面积。 在归一化项下，说明在用归一化法测定时最好使用宽范围放大器 和自动积分仪。
仪器包括： 储液器 泵 进样器 色谱柱 检测器
3
色谱柱
? 反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充 剂为化学键合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常 用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶也 有使用。
? 正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶 等。
? 离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色 谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异 构体的分离通常使用手性填充剂。
? 紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与供 试品溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；
? 示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的 化合物均有响应；
? 蒸发光散检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品 的质量有关；
? 二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱，故可用于供 试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。
16
分离度(R)
? 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的 分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通 过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测 定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其 他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适 当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的 分离度，对色谱系统进行评价与控制。
英国药典2000年版
? 附录ID 液相色谱法，简要叙述了仪器、方法、归一化法、效能及 与正文有关的内容。在方法项下，说明要用对照溶液测试，以决 定仪器的设置和获得适当响应的注样量，进行重复进样以验证重 复性，必要时，还要检测理论板数。
? 除另有规定外，测定被测物峰的峰面积。若被测物峰的对称因子 为0.8-1.2，也可测定峰高。在应用梯度洗脱时，则测定峰面积。 在归一化项下，说明在用归一化法测定时最好使用宽范围放大器 和自动积分仪。
仪器包括： 储液器 泵 进样器 色谱柱 检测器
3
色谱柱
? 反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充 剂为化学键合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常 用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶也 有使用。
? 正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶 等。
? 离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色 谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异 构体的分离通常使用手性填充剂。
? 紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与供 试品溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；
? 示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的 化合物均有响应；
? 蒸发光散检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品 的质量有关；
? 二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱，故可用于供 试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。
16
分离度(R)
? 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的 分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通 过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测 定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其 他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适 当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的 分离度，对色谱系统进行评价与控制。
高效液相色谱讲义共74页文档
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
高效液相色谱讲义
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
高效液相色谱讲义
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
[讲义]高效液相色谱!
![[讲义]高效液相色谱!](https://img.taocdn.com/s3/m/e3da237631b765ce050814de.png)
6、60年代GC-MS联用分析已不能满足分析测试的要求。 7、70年代HPLC崛起，气相色谱和高效液相色谱，逐步成 为各行各业必不可少的分析工具，广泛应用于各个生产领 域。
8、1975年，美国Dow化学公司的H.Small等人首先提出 的离子色谱的概念，在分离柱后加一个抑制柱，同年商品 化的离子色谱仪问世。 9、1979年，美国依阿华州立大学J.S.Fritz等人提出的非 抑制型离子色谱仪。
结论：
四种色谱的分离机制各不相同，分别形成吸附平衡、 分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡 K分别为吸附系数，狭义分配系数，选择性系数和 渗透系数
除了凝胶色谱法中的K仅与待测分子大小尺寸、凝胶 孔径大小有关外，其他三种K值都受组分的性质、流 动相的性质、固定相的性质以及柱温的影响
按固定相的固定方式分：
第一节 高效液相色谱的特点
高效液相色谱法作为色谱分析法的一个分支，是在20世纪60年
代末期，在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上，发展起来的新型 的分离分析技术。液相色谱包括传统的柱色谱、薄层色谱和纸色谱。
20世纪50年代后气相色谱法在色谱理论研究和实验技术上迅速崛
起，而液相色谱技术仍停留在经典操作方式，其操作繁琐，分析时间 很长，因而未受到重视。
径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质 凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。
（一）吸附色谱法
要求： 固定相→吸附剂（硅胶或AL2O3） 具表面活性吸附中心 分离机制：见图示
各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心，利用吸附 剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离 吸附→解吸→再吸附→再解吸→无数次洗脱→分开
20世纪60年代以后，随气相色谱法对高沸点有机物分析局限性的
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2、无机基质 ①多孔硅胶
②可控孔径玻璃
3、高效亲合色谱兼具亲合色谱和高效液相色谱 的特点 ①可以提高效率，还可以改善回收产物纯度和 浓度
②检测灵敏度得以大幅度提高 ③具有更高的选择性 ④配基结合的牢固性也可以延长填料的寿命并 提高产物的质量，这对生物工程的分离、纯化 工作是非常有利。
三、亲合色谱影响因素 1、平衡和平衡缓冲溶液 选择平衡缓冲溶液所具有的PH值，离子强度， 温度和化学组成都应使配体与蛋白质之间能发 生比较强的相互作用。
四、体积排租色谱法的流动相
在体积排租色谱法中，流动相的性质对保留值 和分离选择性无影响。 ① 溶解样品的良溶剂 ② 低黏度溶剂 ③ 柱填料不能在溶剂作用下收缩或溶胀
④ 控制流动相的PH值和离子强度 ⑤ 凝胶渗透色谱——示差折光检测器 流动相的折射率必须尽可能与样品的折射率 有较大的差别。 凝胶过滤色谱——紫外吸收检测器 使用在检测波长无紫外吸收的溶剂作流动相。
亲合色谱作为液相色谱的一个重要分支，对于生 物大分子的分离具有特殊的意义。原则上讲，如 果在固相载体上连接一种具有生物特异性的配基， 就可以建立一种亲合色谱方法，用于分离与配基 相对应的物质。
1、有机高分子类：多孔的硬质凝胶——交联聚 苯乙烯，交联聚甲基丙烯酸酯，亲水性高聚性 等树脂。 优点 ①具有均匀的粒度、较大的孔径、良好的刚性， 广泛的PH值的适应性 ②对于生物大分子样品都有较好的相溶性。 ③填料容易合成
lgK' = lg Kz + Zlg
1 D0
3 结论
二、离子交换色谱的固定相 1、高分子类型填料
① 优点 a填料的使用寿命长 b具有较高的色谱容量 c 很少有非特异性吸附，对于保持样品生物活性 有利。
② 结构 以交联共聚的苯乙烯-二乙烯苯为基质，同时 也出现了许多其他交联高聚物基质的固定相。 ③ 类型
1、
qxyP + L
PL
不足之处：忽略了在填料表面上形成复合物时 溶质被流动相中小分子饱和并不断进行计量置 换反应的重要因素。
2、
P0 + ZD0
P0：流动相中溶质的浓度 Pb：填料表面上被吸附的溶质浓度 D0：流动相中洗脱剂的浓度 Db：填料表面上洗脱剂的浓度
Pb + ZDb
Z：是蛋白质在吸附过程中从填料表面上被置换的 洗脱剂的数目。
（四）离子对色谱法 （五）分子排阻色谱法
二、色谱流出曲线和保留值
（一）色谱流出曲线及相关术语
（二）保留值
三、分离度
第三节 定性和定量分析
一、定性分析
（一）利用已知物对照法定性 1、利用保留特性 2、利用不同柱比较
（二）色谱法和其他方法结合定性
1、利用化学反应定性 2、利用二极管陈列检测器 3、收集峰的流出物
V0 死体积，相当于凝胶的粒间体积
二、体积排阻色谱法的特点
三、体积排阻色谱法的固定相
（一）固定相的分类 1、按固定相基质分类
2、按固定相机械强度分类
（二）凝胶固定相的特性参数
1、渗透极限 2、分离范围
3、固流相比
在SEC中常将柱中凝胶孔体积中的溶剂称为 固定相，而将柱中凝胶颗粒间空隙体积中称为 流动相，而凝胶孔体积与凝胶颗粒间空隙体积 的比值称作固流相比。 4、柱效
（二）液-液分配色谱
流动相和固定相都是液体的色谱法即为液-液 色谱，是利用样品组分在两种不相溶的液相间 的分配来进行分离。一种液相为流动相，另一 种是涂渍于载体上的固定相。
流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法称为正相 分配色谱法 流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相 分配色谱法
（三）离子交换色谱
使用离子交换剂使物质分离表
样品 强酸型(磺酸型) 稀NH4OH洗脱 通过液 酸性、中性化合物 解离型、两性化合物 稀NaOH洗脱 强碱型(季铵型) 强碱型 稀HCl洗脱 通过液 通过液 酸性化合物 中性化合物 解离型物质 两性化合物 (盐、生物碱)
一、离子交换色谱的分离机理
最好是高浓度、小体积、在一般范围内可以得 到好的分离效果。蛋白质的样品体积为柱体积 的1%---3%比较合适。
6、蛋白质在变性条件下的分离
① 变性溶剂如6mol/L盐酸胍、8mol/L脲、0.1% 十二烷基硫酸钠(SDS)等有助于精确地确定蛋白 质的分子量。
② 在变性溶剂中，柱的分离范围因此而移到 低分子量范围内。
一、亲合色谱分离机理
亲合色谱是基于样品中各种物质与固定在载体 的配基之间的亲合作用的差别而实现分离的。
亲合色谱的过程是待分离物质与配基间的亲合 复合物形成及其解离的过程。
载体
X 待分离物质
L 配基
通过选择适当的流动相将结合在配基固定相的 组分洗脱下来：
a) 如果亲合复合物的亲合力不强
b) 当配基与被分离组分的亲合力较强
2、蛋白质的浓度和温度效应 ①对亲合力一般或较高的蛋白质，其互补酶的浓 度对亲合容量的影响不明显，柱顶端结合的大分 子与最初加入的大分子浓度无关。 ②温度效应在亲合色谱中非常重要，因为亲合 填料吸附作用的强度随温度升高而降低。
4、HPLC-MS
二、定量分析 （一）峰面积或峰高的测量方法 1、手测峰高 2、峰高乘半峰宽 3、剪纸称重 4、积分仪测定
5、微处理机测定
（二）定量方法
1、峰面积归一法 2、外标法
3、内标法
4、内加法（或追加法）
第四节 高效液相色谱的分离模式
一、基本原理 二、分类 1、吸附色谱 2、分配色谱 3、离子交换色谱
b) 洗脱液离子强度低增加到0.3-0.5mol/L c) 常用磷酸盐和硫酸盐进行离子强度的调节 d) 用氯化钠作离子剂，疏水作用最小 e) PH值不能太低，因为H+会腐蚀不锈钢柱
4、流速 蛋白质分离时，流速对分离度的影响是一个很 重要的因素，一般在低流速下蛋白质分离是比 较理想。
5、样品容量
进样体积和样品的浓度将明显地影响蛋白质的 分离度。 样品的浓度范围一般在0.01%----0.5%.
种类
强酸性
阳离子交换树脂 弱酸性 强碱性 阴离子交换树脂 弱碱性
-SO3H
COOH
-PO3 H
N (CH3)2X C2H4OH
N (CH3)3X
NR2
NHR
NH2
离子交换层析适用性
• 能在水溶液或含水极性溶剂中产生游
离离子基团的酸、碱及两性成分。可用于
氨基酸、肽类、生物碱、有机酸、酚类等
水溶性成分的分离。
④ 对流动相PH值的控制，通常采用缓冲溶液 来实现。
2、流动相的离子强度
四、离子交换色谱的影响因素
1、填料孔径的影响 2、柱长的影响 3、流速的影响 4、PH值的影响
无论在强的还是弱的阴离子交换柱上，蛋白质 均显示不同PH值影响结果，因此决定了它的保 留选择性、分离度和回收率等因素。
5、离子强度的影响
示例：用高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)测定重组 人肿瘤坏死因子(rh-TNF)衍生物的相对分子量
rh-TNF属基因工程药物，其相对分子量的测定 是该药质量控制的主要指标之一。
仪器与色谱条件：岛津LC-10A HPLC 色谱柱：Beckman Ultraspherogel SEC 3000 (30cm×7.5cm) 流动相 0.1mmol/L KH2PO4 :0.1mmol/L Na2SO4(1 : 1) + 0.05% NaN3
（一）凝胶渗透色谱的流动相
凝胶渗透色谱常采用甲苯，四氢呋喃和氯仿等 有机溶剂作流动相。 在用于高聚物分子量测定的凝胶渗透色谱中， 四氢呋喃是最常用的流动相，它对样品有良好 的溶解性能和低的黏度，并可使小孔径聚苯乙 烯凝胶溶胀，因此被优先推荐使用。
（二）凝胶过滤色谱的流动相
在凝胶过滤色谱中，使用以水作基体具有不同 PH值的多种缓冲溶液作流动相。
五、体积排租色谱的影响因素 1、填料
① 化学键合的硅胶 ② 亲水树脂凝胶
2、柱长 体积排租色谱的分离度与柱长的平方根成正比。
3、洗脱液
① 以硅胶为基质的填料，PH值范围在2.0-8.0。 ② 键合硅胶如TSK系列凝胶柱在分离蛋白质时 保留时间主要取决于填料表面上的硅醇基与离 子的反应。
a) 洗脱液离子强度低时
4、分子排阻色谱
5、亲和色谱
三、HPLC在生物大分子中的应用
在生物大分子中的HPLC中，体积排阻色谱，离 子交换、反相液相和亲和色谱是最常用的分离 模式。
第五节 液-固色谱法 液-固色谱法通常称为吸附色谱 1、载体：硅胶
2、吸附剂吸附试样的能力 3、原理
第六节 键合相色谱法
一、正相色谱法 1、在正相色谱法中共价结合到载体上的基团 都是极性基团。 2、分离机制属于分配色谱
c) 非常紧密地结合在固定相配基上的物质洗脱
配基与待分离物质的亲合作用的强弱可以用亲合 复合物的结合常数来表示。这一常数不宜太低， 也不宜太高。太低专一性太差，太高则洗脱困难。
R=
[L] K
R：结合在亲合色谱固定相上的生物分子的活力 K：复合物的离解常数 L：固定化配基的浓度
二、亲合色谱的固定相
（三）凝胶色谱柱的制备及谱图的特点 ①物理因素——影响凝胶色谱柱的性能 ② 扩大分离范围——使用两根以上的串联色谱 柱。 ③更换流动相
谱图的特点：在凝胶渗透色谱中，对不同分子量 聚合物色谱峰的谱带展宽不同于其它液相色谱。
① 在低效排租色谱法，样品分子大小随V的增加 而急剧减小，而柱效却随样品分子量的增加而增 大因此在色谱图上，不同分子量组分的谱带宽度 保持不变。 ② 在高效排租色谱法，峰宽却是个变量。
Mono Beads TSK-gel DEAE-5PW SP-5PW
CM-5PW
2、无机基质型
三、离子交换色谱的流动相 1、流动相的PH值
① 离子交换容量受流动相的PH值影响