高效液相色谱的基本参数讲义
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高效液相色谱法指导培训讲义
常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。
高效液相色谱法指导培训 讲义
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
高效液相色谱法指导培训 讲义
胶束色谱(micellar chromatography)
• 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
• 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
▪进样阀
高效液相色谱法指导培训 讲义
定量圈 1
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
高效液相色谱法指导培训 讲义
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
高效液相色谱法指导培训 讲义
胶束色谱(micellar chromatography)
• 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
• 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
▪进样阀
高效液相色谱法指导培训 讲义
定量圈 1
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
高效液相色谱(HPLC)基础知识
高效液相色谱（HPLC）基础知识我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：方法项目数量1985年版1990年版1995年版2000年版HPLC法鉴别9 34 150 检查12 40 160 含量测定7 60 117 387鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。
I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。
也称现代液相色谱。
二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压——压力可达150~300 Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速——流速为0.1~10.0 ml/min。
高效液相色谱的基本参数讲义
降低检测器噪声
通过优化检测器条件，如调整光 源强度、选择合适的滤光片等， 可以降低检测器噪声，从而提高 信噪比和灵敏度。
增加进样量
在保证色谱柱不过载的前提下， 适当增加进样量可以提高检测器 的响应值。
灵敏度与检测器选择关系
不同检测器灵敏度差异
不同类型的检测器对同一物质的灵敏度可能存在较大差 异，如紫外检测器对含有共轭体系的化合物具有较高的 灵敏度，而荧光检测器则对某些具有荧光特性的化合物 具有较高的灵敏度。
改变柱温
选择合适的色谱柱
柱温升高，分子运动加快，保留时间缩短 ；柱温降低，保留时间延长。但需注意柱 温过低可能导致色谱柱效能下降。
根据分析需求选择合适的色谱柱类型、粒径 和长度，以获得理想的保留时间。
保留时间预测模型
线性溶剂强度模型
假设溶质在固定相和流动相之间的分配系数与流动相组成 呈线性关系，通过实验数据拟合得到线性方程，可用于预 测不同流动相组成下的保留时间。
仪器组成与工作流程
01
仪器组成
高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、色谱柱、检 测器、数据记录与处理系统等部分组成。其中输液系统包 括储液器、泵、流动相梯度程序等；进样系统包括进样器 、定量环等；色谱柱是实现分离的核心部件；检测器用于 对分离后的组分进行检测；数据记录与处理系统则用于数 据的采集、处理和分析。
使用后，应及时清洗色谱 柱，避免残留物对色谱柱 造成损害。
ABCD
在使用前，应对色谱柱进行 充分的平衡和条件化，以确 保其分离效果和稳定性。
长期不使用的色谱柱应妥 善保存，并定期进行检查 和维护。
仪器操作规范与安全防护
01
操作人员应熟悉仪器的结构、原理和操作方法，并按照规范进行操作。
高效液相色谱法讲解
进样针
用于抽取和注射样品，需 保持清洁并避免交叉污染。
进样阀
切换进样状态，使样品进 入色谱柱或废液瓶。
色谱柱及填料选择
色谱柱类型
根据分离需求选择合适的色谱柱，如 反相色谱柱、正相色谱柱、离子交换 柱等。
填料粒径
填料类型
根据分离机制和样品性质选择合适的 填料，如C18、C8、氨基柱等。
影响色谱柱的分离效果和柱压，常用 填料粒径有3μm、5μm、10μm等。
检测系统
检测器
数据处理系统
将色谱柱分离后的组分转化为电信号进行 检测，常用的有紫外可见检测器、荧光检 测器、电化学检测器等。
采集、处理色谱数据，包括峰高、峰面积 、保留时间等，并输出结果。
检测池
光源
用于放置检测器，保持恒温并避免气泡产 生。
为检测器提供稳定的光源，确保检测结果的 准确性和稳定性。
03 高效液相色谱法实验操作
样品前处理与制备
样品提取
根据样品性质选择合适的 溶剂进行提取，确保目标 化合物能够充分溶解。
样品净化
采用固相萃取、液液萃 取等方法去除杂质，提 高目标化合物的纯度。
样品浓缩
通过蒸发、氮吹等方式将 样品浓缩至一定体积，便
于后续进样操作。
制备标准品
根据需要制备不同浓度 的标准品，用于后续定
量分析和质量控制。
质量控制
对实验过程进行质量控制，包括重 复性实验、加标回收实验等，以确
保实验结果的可靠性和准确性。
实验注意事项
01
02
03
04
仪器校准
定期对高效液相色谱仪进行校 准，确保仪器处于最佳工作状
态。
试剂与耗材选择
选择高质量的试剂和耗材，避 免对实验结果产生干扰。
高效液相色谱法教学【全】精选全文
P307~311
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
高效液相色谱讲座Ⅱ高效液相色谱基本参数和基础理论(下)
讲
座
高效液相 色谱讲 座
高效液相色谱 基本参 数和基础理论 （ 下）
张玉奎 李秀珍＊ 卢佩章
（ 中国科学院大连化学物理研究所）
２ ５ 分离效能总指标—分离度 Ｋ和 Ｒ － １ １ ．定义：任何色谱过程的目的是要分
对两相邻峰， ｔ２ １） ／
ｔ２ １（＝ ｔ ，故 有 ／ ２ ／ １
离某一混合物中诸组分。混合物中各组分要
表２６ 柱长不同 － 时峰 容量与分析时 间的关 系 Ｈ ０ 米，ｕ 毫米／ Ｋ ＝１ １ ＝１微 ⒚ ＝１ 秒，１ ． ９
则必须用长柱子进行分离分析。
２７ 最佳操作条件的选择 －
１ ．保留值随冲洗剂组成变化规律 保留值变化规律是解决最佳条件选择和
色谱定性的基础。在二元体系的液 相色谱
中，目前有四种类型的方程：
其中 Ｓ为柱系统选择性指标
＋１ （－９ ６ ２４－）
图２ 给出了不同柱长时峰容量与分析时间 －７ 的关系曲线，表２ 列出由式（－９４所计 －５ ２４－ 算的保留时间随 值的变化。从表中可看出， 当 ＝ 时，出３个峰仅需６ １ ０ 分钟，而当 ＝ 由 Ｎ 为一常数，Ｋ１ 于 由分析精度的要求所 决定，因此对于欲分离的混合物中任一 “ 物
因子，Ｃ 是强溶剂Ｂ的 Ｂ
浓度。ａｂｃ分 别为各
方程的常数。方程 （－ ２ ５－ ０ １是由Ｓ ｙ ｅ 应用 ｎ ｄｒ 顶替吸附模型导出的液 固色谱保留方程。方程
（－０２是近似的溶解 ２５－）
度参数理论导出的保留
值方程。方程（－０３ ２５－）
是Ｓ ｏｔ ｃｔ 和Ｋｕｅａ在多 ｅｒ 层吸附模型基础上导出
ｌｇ Ｂ ａ ｂ Ｂ ｏｋＡ＝ － ｏ ｌ ｇＣ
表２５ － 峰保留时间随 值的变 化
座
高效液相 色谱讲 座
高效液相色谱 基本参 数和基础理论 （ 下）
张玉奎 李秀珍＊ 卢佩章
（ 中国科学院大连化学物理研究所）
２ ５ 分离效能总指标—分离度 Ｋ和 Ｒ － １ １ ．定义：任何色谱过程的目的是要分
对两相邻峰， ｔ２ １） ／
ｔ２ １（＝ ｔ ，故 有 ／ ２ ／ １
离某一混合物中诸组分。混合物中各组分要
表２６ 柱长不同 － 时峰 容量与分析时 间的关 系 Ｈ ０ 米，ｕ 毫米／ Ｋ ＝１ １ ＝１微 ⒚ ＝１ 秒，１ ． ９
则必须用长柱子进行分离分析。
２７ 最佳操作条件的选择 －
１ ．保留值随冲洗剂组成变化规律 保留值变化规律是解决最佳条件选择和
色谱定性的基础。在二元体系的液 相色谱
中，目前有四种类型的方程：
其中 Ｓ为柱系统选择性指标
＋１ （－９ ６ ２４－）
图２ 给出了不同柱长时峰容量与分析时间 －７ 的关系曲线，表２ 列出由式（－９４所计 －５ ２４－ 算的保留时间随 值的变化。从表中可看出， 当 ＝ 时，出３个峰仅需６ １ ０ 分钟，而当 ＝ 由 Ｎ 为一常数，Ｋ１ 于 由分析精度的要求所 决定，因此对于欲分离的混合物中任一 “ 物
因子，Ｃ 是强溶剂Ｂ的 Ｂ
浓度。ａｂｃ分 别为各
方程的常数。方程 （－ ２ ５－ ０ １是由Ｓ ｙ ｅ 应用 ｎ ｄｒ 顶替吸附模型导出的液 固色谱保留方程。方程
（－０２是近似的溶解 ２５－）
度参数理论导出的保留
值方程。方程（－０３ ２５－）
是Ｓ ｏｔ ｃｔ 和Ｋｕｅａ在多 ｅｒ 层吸附模型基础上导出
ｌｇ Ｂ ａ ｂ Ｂ ｏｋＡ＝ － ｏ ｌ ｇＣ
表２５ － 峰保留时间随 值的变 化
高效液相色谱HPLC基本原理ppt课件
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3）示差折光检测器
原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样 品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束 （通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两 束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录， 该信号代表样品的浓度。
为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温 度变化敏感，且不适于梯度淋洗。
当采用粘度较大的试剂，如CC4，CH3OH, 丙酮，二氧杂环已烷、THF 等。 填充方法：
填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中， 然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要 求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。
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22
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23
3. 色谱柱
1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。 柱长多为15~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱 柱内径更大)； 2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为： 平衡密度法：
即使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的 匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等； 非平衡密度法：
Deuterium lamp
Lens
Lens system Holmium filter Detector cell
Optical slit
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Diode Array
Grating 33
Time msec
LIGH T
PHOTODIOD E
Wavelength nm
第十二章讲义高效液相色谱
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相柱 色谱装置
高效液相色谱仪
例：分离20种氨基酸
经典柱色 谱
柱长：170 cm 柱径：0.9 cm F：30 mL/h t分离: >20 h
HPL C
t分离：1 h
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相色谱法
固定相 固定相粒度（μm） 固定相粒度分布(RSD) 柱长（cm） 柱内径（cm） 柱 入 口 压 强 （ kg/cm2 ） 柱效(每米理论塔片数) 样品用量（g） 分析所需时间（h） 装置
液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为： ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡
过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。 而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提 高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以 上的液体作流动相，增大分离的选择性。
其是在生物学和医学等方面应
用极为广泛。如氨基酸、蛋白
质、核酸、烃、碳水化合物、 分
药品、多糖、高聚物、农药、
子 量
抗生素、胆固醇、金属有机物
等 分 析 ， 大 多 是 通 过 HPLC 来
完成的。
右图是各种HPLC方法的应
用范围及对象
极性增加 不溶于水 非极性
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向分配
正向分配 离子交换
主要由接管、检测器流通池体积及检测器响应时间 等因素所引起。因此，尽可能用短而内径细的接管， 减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应速度 等都是克服柱后展宽的途径
第二节 高效液相色谱仪
一、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐(滤棒，可滤去颗粒状物质) 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
中国药典 高效液相色谱讲义
26
英国药典2000年版
? 附录ID 液相色谱法，简要叙述了仪器、方法、归一化法、效能及 与正文有关的内容。在方法项下，说明要用对照溶液测试，以决 定仪器的设置和获得适当响应的注样量，进行重复进样以验证重 复性，必要时，还要检测理论板数。
? 除另有规定外，测定被测物峰的峰面积。若被测物峰的对称因子 为0.8-1.2，也可测定峰高。在应用梯度洗脱时，则测定峰面积。 在归一化项下，说明在用归一化法测定时最好使用宽范围放大器 和自动积分仪。
仪器包括： 储液器 泵 进样器 色谱柱 检测器
3
色谱柱
? 反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充 剂为化学键合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常 用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶也 有使用。
? 正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶 等。
? 离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色 谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异 构体的分离通常使用手性填充剂。
? 紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与供 试品溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；
? 示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的 化合物均有响应；
? 蒸发光散检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品 的质量有关；
? 二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱，故可用于供 试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。
16
分离度(R)
? 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的 分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通 过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测 定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其 他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适 当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的 分离度，对色谱系统进行评价与控制。
英国药典2000年版
? 附录ID 液相色谱法，简要叙述了仪器、方法、归一化法、效能及 与正文有关的内容。在方法项下，说明要用对照溶液测试，以决 定仪器的设置和获得适当响应的注样量，进行重复进样以验证重 复性，必要时，还要检测理论板数。
? 除另有规定外，测定被测物峰的峰面积。若被测物峰的对称因子 为0.8-1.2，也可测定峰高。在应用梯度洗脱时，则测定峰面积。 在归一化项下，说明在用归一化法测定时最好使用宽范围放大器 和自动积分仪。
仪器包括： 储液器 泵 进样器 色谱柱 检测器
3
色谱柱
? 反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充 剂为化学键合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常 用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶也 有使用。
? 正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶 等。
? 离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色 谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异 构体的分离通常使用手性填充剂。
? 紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与供 试品溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；
? 示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的 化合物均有响应；
? 蒸发光散检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品 的质量有关；
? 二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱，故可用于供 试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。
16
分离度(R)
? 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的 分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通 过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测 定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其 他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适 当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的 分离度，对色谱系统进行评价与控制。
高效液相色谱基本概念和术语
高压液相色谱H PLC培训教程(一)I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(m obile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(statio naryphase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chroma togra phy)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法(High perfor mance Liquid Chroma togra phy，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(H igh Pressu re Liquid Chroma togra phy，HPLC)。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High SpeedLiquid Chroma togra phy，HSLP)。
也称现代液相色谱。
二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压-压力可达150~300Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75Kg/cm2以上。
高速-流速为0.1~10.0 ml/min。
高效-可达5000塔板每米。
在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
高效液相色谱的基本参数讲义
10 min
10 min
70年代末期 10µm不规则微多孔填料 1000~2500 psi 25,000塔板数/米 3.9×300mm
从80年代到现在 1.5~5µm球形微多孔填料 1500~4000 psi 50,000~80,000塔板数/米 3.9×300mm
10 min
如果我们使用更小颗粒度的填料会发生什么情况？
W½ = a '+ b'vR
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检测器死体积对不对称度的影响
A、检测系统死体积11ul; B、检测系统死体积2ul
16
柱效能总指标
色谱过程中，柱效能是色谱柱分离能力的度量。 主要由操作参数和动力学因素决定。一般可通过 测定色谱柱的塔片数、分离度等评价。
注意到两峰相邻时近似地有 半峰宽相等， 因此
颗粒度越小柱效越高
• 颗粒度控制着分离的 质量
更小的颗粒度：
• 使最高柱效点向更高 线速度方向移动
• 有更宽的线速度范围
降低颗粒度不但可以 增加柱效，同时也增 加分离速度
如果填料的颗粒继续演变……
更小的颗粒度……
被仪器及色谱柱 的耐压的所限制
Flow rate (ml/min)
Linear velocity(u,mm/sec)
溶质在流动相中的浓度(nm/Vm)
nm Vs
ns, nm 溶质在固定相和流动相中的量
2
(3) 调整保留时间
tr´= tr - to
V = VR - Vm
(4) 容量因子 (k’)
固定相中容质的量(ns)
k´=------------------------
流动相中容质的量(nm)
K = k´(Vm/ Vs)
高效液相色谱1-PPT文档资料
A 涡流扩散项 毛细管气相色谱中 A=0
B 纵向扩散项 液相色谱中远小于气相色谱 通常流速下B ≈ 0
C 传质阻力项 C = Cm(动态流动相) + Csm(静态..) + Cs(固定相)
对键合相，Cs=0
所以 对液相色谱
H=A + B/u + Cmu + Csmu + Csu
对键合相液相色谱 H=A + Cmu + Csmu
通用型检测器
示差折光 电导检测器等
第十八页，共71页。
第十九页，共71页。
第二十页，共71页。
1.5.5 附属系统
包括
脱气
梯度淋洗 柱恒温 自动进样 馏分收集
数据处理 等
第二十一页，共71页。
2. 基本理论，分离的控制
❖ 与GC一样，样品组分在固定相与流动相之间的 吸附与分配平衡的差异产生分离，这是一个负熵 过程。而同时存在的熵增过程--区带自发扩散使 组分混合。
第三十二页，共71页。
❖ 处于同一组的溶剂，分离中有相似的选择 性；而处于不同组的溶剂，其选择性差别 较大
❖ 正相色谱中，固定相是极性的，所以增加 极性参数P’，洗脱能力增加
❖ 反相色谱中，固定相是非极性的，所以增 加极性参数P’，洗脱能力降低
第三十三页，共71页。
(4) 保留值与流动相组成
液固色谱中，k’对温度的变化不如气相色谱敏感，通常不 考虑。因此，在流动相线速确定后，影响分离效果合分离 时间的主要因素就是流动相组成。通过统计热力学的方法 可以导出在二元流动相体系中组分容量因子k’与强溶剂的
❖ 柱管常用不锈钢金属管 ❖ 一般色谱柱长5～30cm，内径为2～5mm，
凝胶色谱柱内径3～12mm，制备柱内径较 大，可达25mm以上。 ❖ 一般在分离前有一个预柱，预柱内填充 物和分离柱尽可能完全一样
高效液相色谱
各种强极性的有机酸、有机碱的分离分析是液相色谱法中的重要课题。利
用吸附或分配色谱法一般需要强极性的洗脱液，并容易发生严重的拖尾现象。
利用离子交换色谱法需要选择合适的pH条件，此外以高分子材料为基体的树
脂性填料一般不能耐受高压，传质性能也较差。若利用离子对色谱法，则分
离效能高、分析速度快、操作简便。
X水相+ + Y水相-
相对分子质量介于上述两个极限之间的化合物，将按分子量降低的次序被洗脱 。通常将A＜Ve＜B这一范围称为分级范围。当化合物的分子大小不同而又在此 分级范围内时，它们就可得到分离。
特点
（1）样品峰全部在溶剂的保留时间前出现； （2）样品在柱内停留时间短，故柱内峰扩展比其它分离方法小得多，所得峰 通常都较窄，有利于进行检测； （3）固定相和流动相的选择简便； （4）样品分子量范围宽。分子量在100至8×105的任何类型化合物，只要在 流动相中是可溶的，都可用排阻色谱进行分离； （5）不能分离大小相似，分子量接近的分子，例如异构体。只能分离分子量 差别在10％以上的分子； （6）不能分离分子量变化连续的化合物，例如高聚物，但可测定其分子量的 分布情况，这正是我们所需要知道的。
W1/ 2
（3）峰底宽法计算Ｎ
N (tR )2 ( tR )2 16( tR )2
Wb / 4
Wb
（4）理论塔板高度Ｈ H L N
（5）有效塔板数（Neff）有效塔板高度（Heff）
Neff
5.54( tR' )2 W1/ 2
Neff
16(
t
' R
)2
Wb
L Heff Neff
三、HPLC的分类及其分离原理
103
V0
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空柱管体积（Vc ) * 总孔隙度（εT)
to=
流动相体积流速（F c)
= π/4 *d²c *L * εT/Fc
计算孔隙度
4
§2 选择性指标( )和相对保留值()
´= t r(2) / tr(1) =(1+ k´(2)/(1+ k´(1)) = t r '(2) / tr' (1) = k´(2) / k´(1) ´作为选择性指标比 直观
溶质在流动相中的浓度(nm/Vm)
nm Vs
ns, nm 溶质在固定相和流动相中的量
2
(3) 调整保留时间
tr´= tr - to
V = VR - Vm
(4) 容量因子 (k’)
固定相中容质的量(ns)
k´=------------------------
流动相中容质的量(nm)
K = k´(Vm/ Vs)
色谱柱接连流出分离良好的色谱峰，所能够分离 的最大组分数。
为了使总分离效能指标能直接与所分析组分的 多少相关联，可以采用峰容量（P）来评价色谱柱。 色谱条件一定时，在指定的时间内，能够在色谱柱 中流出的满足分离度要求的等高色谱峰的个数。
20
21
快速色谱
tr(last) = H /u * Nmin (1+k‘last )
▪ 颗粒度越小柱效越高
• 颗粒度控制着分离的 质量
▪ 更小的颗粒度：
• 使最高柱效点向更高 线速度方向移动
• 有更宽的线速度范围
▪ 降低颗粒度不但可以 增加柱效，同时也增 加分离速度
如果填料的颗粒继续演变……
更小的颗粒度……
被n)
Linear velocity(u,mm/sec)
ID=1.0 mm
0.05
0.09
0.14
0.19 0.24
0.28
0.33
ID=2.1mm
0.21
0.41
0.62
0.83 1.04
1.24
1.45
ID=4.6mm
1.00
2.00
3.00
3.99 4.98
5.98
6.98
柱外效应对柱效的影响
A:21 μl(20.5) B:11 μl(11.0) C: 2 μl(1.7)
Vc--空柱体积
8
Kf =dp²/1000
K0为渗透性常数（厘米2） η 为流动相黏度（泊或达因.秒/厘米2） ΔP 为柱压降（大气压 X 106 或达因/厘米2）
9
理论板高与线速的关系
Van Deemter
H =A +B /u +Cu
A:涡流扩散项，B:纵向扩散项， C: 传质扩散项
10
HPLC填料颗粒尺寸的演变 70年代早期 40µm薄壳非多孔基质上涂布 100~500 psi 1000塔板数/米 1m长色谱柱
17
色谱峰的有关参数
W½ =a + bt
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几种描述分离状况参数的关系
Rstr(2)tr(1) (tr(2) 1)tr(1) (d1) N 1
W 1/2
tr(1)
W 1/2
5.54
两峰分离的必要条件： 1、两组分的保留值不同 2、样品组分应有一定的保留值 3、色谱柱应具有分离必须的柱效
19
色谱柱峰容量
VR= Vm +KVs = Vm + k´(Vm/ Vs) Vs = Vm + k´Vm = Vm (1+ k´)
tr = to (1+ k´)
k´= t r / to - 1
k´与固定相,流动相性质及柱温有关;与流速,柱尺寸无关. 3
(5) 死体积(Vm) 和死时间(to)
1) 采用比流动相溶剂少一个-CH2-基团的同系物（己烷—戊烷 ） 2）甲醇/水------甲醇 3） 正相--------四氯乙烯，反相---苯甲酸或硝酸 4） 计算法
van Deemter曲线及方程式
A 项 + B 项 + C项
HETP PLATES
最低HETP =>最优化的塔板数
H
C项
（传质）
A项
（颗粒度和柱床填装的优良程度）
B项
（轴向扩散）
线速度 U （mm/sec）
三项加在一起最终得到的 “van Deemter曲线”
van Deemter曲线的提示
van Deemter 曲线的挑战
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70年代末期 10µm不规则微多孔填料 1000~2500 psi 25,000塔板数/米 3.9×300mm
从80年代到现在 1.5~5µm球形微多孔填料 1500~4000 psi 50,000~80,000塔板数/米 3.9×300mm
10 min
如果我们使用更小颗粒度的填料会发生什么情况？
W½ = a '+ b'vR
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检测器死体积对不对称度的影响
A、检测系统死体积11ul; B、检测系统死体积2ul
16
柱效能总指标
色谱过程中，柱效能是色谱柱分离能力的度量。 主要由操作参数和动力学因素决定。一般可通过 测定色谱柱的塔片数、分离度等评价。
注意到两峰相邻时近似地有 半峰宽相等， 因此
色谱基本参数
§1 保留值
(1) 保留时间 tr
保留时间tr和死时间t0示意图
1
(2) 保留体积
VR (ml) = tr(min) * Fc(ml/min) VR= Vm +KVs
K--平衡分配系数, Vs--固定相体积, Vm =流动相所占体积
溶质在固定相中的浓度(ns/Vs)
ns Vm
K=---------------------------------- = ---- * ----
H/u 越小， 分析时间越短
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冲洗剂消耗量指标
给定分析任务，所需流动相体积：
Fc为冲洗剂流量，dc为柱内径。
u=L/t0 d2H
t=t0(1+k’)
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不同尺寸的色谱柱溶剂消耗指标
与柱温固定相种类流动相组成有关
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§3 -1 流动相线速（u)
流动相线速u: 通常指平均线速度
u = L / t。
ε u =Fc /A * T
A:柱截面积 L 和 u 一定时， t。一定
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§3 -2 柱总孔隙率(εT )
柱总孔隙率：柱横截面上流动相所占的分数，主要取决 于柱填料类型。
εT =Fc to / Vc
薄壳填料—0.42 多孔硅胶—0.84
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渗透性(Kf)
渗透性定义为 ：Kf =uηLεT /Δp
ε Kf = K0 T =uηLεT /Δp
εT =Fc.to /Vc
Kf =
uηL
Δp
Fc
Vc
式中：K0为渗透性常数（cm2）,η为流动相粘度（Pa·s/cm2）,△P为柱压降（Pa） Fc为冲洗剂流速（ml/s） , L为柱长（cm）,dc为柱内径（cm）