高效液相色谱的基本参数讲义共28页文档
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高效液相色谱的基本参数讲义
薄壳填料—0.42 多孔硅胶—0.84
7
渗透性(Kf)
渗透性定义为 ：Kf =uηLεT /Δp
ε Kf = K0 T =uηLεT /Δp
εT =Fc.to /Vc
Kf =
uηL
Δp
Fc
Vc
式中：K0为渗透性常数（cm2）,η 为流动相粘度（Pa·s/cm2）,△P为柱压降（Pa） Fc为冲洗剂流速（ml/s） , L为柱长（cm）,dc为柱内径（cm）
色谱基本参数
§1 保留值
(1) 保留时间 tr
保留时间tr和死时间t0示意图
1
(2) 保留体积
VR (ml) = tr(min) * Fc(ml/min) VR= Vm +KVs
K--平衡分配系数, Vs--固定相体积, Vm =流动相所占体积
溶质在固定相中的浓度(ns/Vs)
ns Vm
K=---------------------------------- = ---- * ----
10 min
10 min
70年代末期 10µm不规则微多孔填料 1000~2500 psi 25,000塔板数/米 3.9×300mm
从80年代到现在 1.5~5µm球形微多孔填料 1500~4000 psi 50,000~80,000塔板数/米 3.9×300mm
10 min
如果我们使用更小颗粒度的填料会发生什么情况？
4.0×10-11
0.4
6.4×10-11
Hdc²: 容积消耗指标
Hdc²qmin: 包括检测器在内的整个系统检测能力指标
qmin: 浓度型监测器的最小检测量
24
色谱流出曲线的描述
htA 2 0 ex (p tt2 g t)2t d t
7
渗透性(Kf)
渗透性定义为 ：Kf =uηLεT /Δp
ε Kf = K0 T =uηLεT /Δp
εT =Fc.to /Vc
Kf =
uηL
Δp
Fc
Vc
式中：K0为渗透性常数（cm2）,η 为流动相粘度（Pa·s/cm2）,△P为柱压降（Pa） Fc为冲洗剂流速（ml/s） , L为柱长（cm）,dc为柱内径（cm）
色谱基本参数
§1 保留值
(1) 保留时间 tr
保留时间tr和死时间t0示意图
1
(2) 保留体积
VR (ml) = tr(min) * Fc(ml/min) VR= Vm +KVs
K--平衡分配系数, Vs--固定相体积, Vm =流动相所占体积
溶质在固定相中的浓度(ns/Vs)
ns Vm
K=---------------------------------- = ---- * ----
10 min
10 min
70年代末期 10µm不规则微多孔填料 1000~2500 psi 25,000塔板数/米 3.9×300mm
从80年代到现在 1.5~5µm球形微多孔填料 1500~4000 psi 50,000~80,000塔板数/米 3.9×300mm
10 min
如果我们使用更小颗粒度的填料会发生什么情况？
4.0×10-11
0.4
6.4×10-11
Hdc²: 容积消耗指标
Hdc²qmin: 包括检测器在内的整个系统检测能力指标
qmin: 浓度型监测器的最小检测量
24
色谱流出曲线的描述
htA 2 0 ex (p tt2 g t)2t d t
高效液相色谱技术(HPLC)讲义
1407 高效液相色谱技术（HPLC ）高效液相色谱（HPLC ：High Performance Liquid Chromatography ）是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少的工具。
国际市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大的份额，增长速度最快。
高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。
适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。
其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。
目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。
7.1 基本原理固定相 流动相AB CCBA固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。
HPLC 是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。
通常，按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类：分配色谱：—— 分配系数亲和色谱：—— 亲和力吸附色谱：—— 吸附力离子交换色谱：—— 离子交换能力凝胶色谱（体积排阻色谱）：—— 分子大小而引起的体积排阻分配色谱又可分为：正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。
反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。
用的最多，约占60～70％。
固定相（柱填料）：固定相又分为两类，一类是使用最多的微粒硅胶，另一类是使用较少的高分子微球。
后者的优点是强度大、化学惰性，使用pH范围大，pH=1～14，缺点是柱效较小，常用于离子交换色谱和凝胶色谱。
最常使用的全孔微粒硅胶（3～10μm）是化学键合相硅胶，这种固定相要占所有柱填料的80％。
它是通过化学反应把某种适当的化学官能团（例如各种有机硅烷），键合到硅胶表面上，取代了羟基（－OH）而成。
高效液相色谱法指导培训讲义
常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。
高效液相色谱法指导培训 讲义
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
高效液相色谱法指导培训 讲义
胶束色谱(micellar chromatography)
• 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
• 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
▪进样阀
高效液相色谱法指导培训 讲义
定量圈 1
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
高效液相色谱法指导培训 讲义
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
高效液相色谱法指导培训 讲义
胶束色谱(micellar chromatography)
• 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
• 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
▪进样阀
高效液相色谱法指导培训 讲义
定量圈 1
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
高效液相色谱法知识讲解
♪ 当泵头安装有冲洗附件而不开启10％异丙醇，会使密封垫及活塞 杆的寿命减短(二元泵SL除外)，泵头如果发出“吱吱”声不影响使 用和泵的精度 如果有必要，可以改变压缩因子（compressibility） 来达到更好的效果。
第30页/共49页
下列建议将会延长溶剂过滤器的使用寿命并维持泵的运行。 ➢ 使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液 建议每天更换。 ➢ 避免溶剂瓶暴露在直射阳光下（尤其对于水、THF等）用氩气置换流动相
第9页/共49页
第二节 基本原理
液相色谱根据分离机理的不同可分为：
液固吸附色谱 液液分配色谱 离子交换色谱 离子对色谱法 分子排阻色谱(或凝胶渗透色谱)
第10页/共49页
（一）液-固吸附色谱
流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物质吸附作用 的不同来分离物质。
Load
Inject
六通阀定量环
通废液口
定量环
进柱
第18页/共49页
仪器：自动进样器
样品盘
机械手
自动进样100样品盘/机器手/自动洗针
第19页/共49页
色谱柱：柱温箱、色谱柱外挂架 柱温箱
第29页/共49页
♪ 当泵头安装有柱塞清洗附件时，由于该附件中也有密封垫，这
样就会增加活塞杆运动时的阻力。所以开泵前一定要用10％异丙醇， 并将其流速调至约2－3滴/分钟使溶液流过冲洗装置。(对于二元泵 SL，如果不使用盐溶液可以不开)10％异丙醇有助于降低水的表面 张力，并有抑菌作用。不要用其它溶剂代替。
外挂架
第20页/共49页
仪器：检测器-紫外
ＤＡＤ检测器 流路
UV/Vis双灯，全波长检测
第30页/共49页
下列建议将会延长溶剂过滤器的使用寿命并维持泵的运行。 ➢ 使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液 建议每天更换。 ➢ 避免溶剂瓶暴露在直射阳光下（尤其对于水、THF等）用氩气置换流动相
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第二节 基本原理
液相色谱根据分离机理的不同可分为：
液固吸附色谱 液液分配色谱 离子交换色谱 离子对色谱法 分子排阻色谱(或凝胶渗透色谱)
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（一）液-固吸附色谱
流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物质吸附作用 的不同来分离物质。
Load
Inject
六通阀定量环
通废液口
定量环
进柱
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仪器：自动进样器
样品盘
机械手
自动进样100样品盘/机器手/自动洗针
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色谱柱：柱温箱、色谱柱外挂架 柱温箱
第29页/共49页
♪ 当泵头安装有柱塞清洗附件时，由于该附件中也有密封垫，这
样就会增加活塞杆运动时的阻力。所以开泵前一定要用10％异丙醇， 并将其流速调至约2－3滴/分钟使溶液流过冲洗装置。(对于二元泵 SL，如果不使用盐溶液可以不开)10％异丙醇有助于降低水的表面 张力，并有抑菌作用。不要用其它溶剂代替。
外挂架
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仪器：检测器-紫外
ＤＡＤ检测器 流路
UV/Vis双灯，全波长检测
高效液相色谱的基本参数讲义
降低检测器噪声
通过优化检测器条件，如调整光 源强度、选择合适的滤光片等， 可以降低检测器噪声，从而提高 信噪比和灵敏度。
增加进样量
在保证色谱柱不过载的前提下， 适当增加进样量可以提高检测器 的响应值。
灵敏度与检测器选择关系
不同检测器灵敏度差异
不同类型的检测器对同一物质的灵敏度可能存在较大差 异，如紫外检测器对含有共轭体系的化合物具有较高的 灵敏度，而荧光检测器则对某些具有荧光特性的化合物 具有较高的灵敏度。
改变柱温
选择合适的色谱柱
柱温升高，分子运动加快，保留时间缩短 ；柱温降低，保留时间延长。但需注意柱 温过低可能导致色谱柱效能下降。
根据分析需求选择合适的色谱柱类型、粒径 和长度，以获得理想的保留时间。
保留时间预测模型
线性溶剂强度模型
假设溶质在固定相和流动相之间的分配系数与流动相组成 呈线性关系，通过实验数据拟合得到线性方程，可用于预 测不同流动相组成下的保留时间。
仪器组成与工作流程
01
仪器组成
高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、色谱柱、检 测器、数据记录与处理系统等部分组成。其中输液系统包 括储液器、泵、流动相梯度程序等；进样系统包括进样器 、定量环等；色谱柱是实现分离的核心部件；检测器用于 对分离后的组分进行检测；数据记录与处理系统则用于数 据的采集、处理和分析。
使用后，应及时清洗色谱 柱，避免残留物对色谱柱 造成损害。
ABCD
在使用前，应对色谱柱进行 充分的平衡和条件化，以确 保其分离效果和稳定性。
长期不使用的色谱柱应妥 善保存，并定期进行检查 和维护。
仪器操作规范与安全防护
01
操作人员应熟悉仪器的结构、原理和操作方法，并按照规范进行操作。
高效液相色谱讲座Ⅱ高效液相色谱基本参数和基础理论(下)
讲
座
高效液相 色谱讲 座
高效液相色谱 基本参 数和基础理论 （ 下）
张玉奎 李秀珍＊ 卢佩章
（ 中国科学院大连化学物理研究所）
２ ５ 分离效能总指标—分离度 Ｋ和 Ｒ － １ １ ．定义：任何色谱过程的目的是要分
对两相邻峰， ｔ２ １） ／
ｔ２ １（＝ ｔ ，故 有 ／ ２ ／ １
离某一混合物中诸组分。混合物中各组分要
表２６ 柱长不同 － 时峰 容量与分析时 间的关 系 Ｈ ０ 米，ｕ 毫米／ Ｋ ＝１ １ ＝１微 ⒚ ＝１ 秒，１ ． ９
则必须用长柱子进行分离分析。
２７ 最佳操作条件的选择 －
１ ．保留值随冲洗剂组成变化规律 保留值变化规律是解决最佳条件选择和
色谱定性的基础。在二元体系的液 相色谱
中，目前有四种类型的方程：
其中 Ｓ为柱系统选择性指标
＋１ （－９ ６ ２４－）
图２ 给出了不同柱长时峰容量与分析时间 －７ 的关系曲线，表２ 列出由式（－９４所计 －５ ２４－ 算的保留时间随 值的变化。从表中可看出， 当 ＝ 时，出３个峰仅需６ １ ０ 分钟，而当 ＝ 由 Ｎ 为一常数，Ｋ１ 于 由分析精度的要求所 决定，因此对于欲分离的混合物中任一 “ 物
因子，Ｃ 是强溶剂Ｂ的 Ｂ
浓度。ａｂｃ分 别为各
方程的常数。方程 （－ ２ ５－ ０ １是由Ｓ ｙ ｅ 应用 ｎ ｄｒ 顶替吸附模型导出的液 固色谱保留方程。方程
（－０２是近似的溶解 ２５－）
度参数理论导出的保留
值方程。方程（－０３ ２５－）
是Ｓ ｏｔ ｃｔ 和Ｋｕｅａ在多 ｅｒ 层吸附模型基础上导出
ｌｇ Ｂ ａ ｂ Ｂ ｏｋＡ＝ － ｏ ｌ ｇＣ
表２５ － 峰保留时间随 值的变 化
座
高效液相 色谱讲 座
高效液相色谱 基本参 数和基础理论 （ 下）
张玉奎 李秀珍＊ 卢佩章
（ 中国科学院大连化学物理研究所）
２ ５ 分离效能总指标—分离度 Ｋ和 Ｒ － １ １ ．定义：任何色谱过程的目的是要分
对两相邻峰， ｔ２ １） ／
ｔ２ １（＝ ｔ ，故 有 ／ ２ ／ １
离某一混合物中诸组分。混合物中各组分要
表２６ 柱长不同 － 时峰 容量与分析时 间的关 系 Ｈ ０ 米，ｕ 毫米／ Ｋ ＝１ １ ＝１微 ⒚ ＝１ 秒，１ ． ９
则必须用长柱子进行分离分析。
２７ 最佳操作条件的选择 －
１ ．保留值随冲洗剂组成变化规律 保留值变化规律是解决最佳条件选择和
色谱定性的基础。在二元体系的液 相色谱
中，目前有四种类型的方程：
其中 Ｓ为柱系统选择性指标
＋１ （－９ ６ ２４－）
图２ 给出了不同柱长时峰容量与分析时间 －７ 的关系曲线，表２ 列出由式（－９４所计 －５ ２４－ 算的保留时间随 值的变化。从表中可看出， 当 ＝ 时，出３个峰仅需６ １ ０ 分钟，而当 ＝ 由 Ｎ 为一常数，Ｋ１ 于 由分析精度的要求所 决定，因此对于欲分离的混合物中任一 “ 物
因子，Ｃ 是强溶剂Ｂ的 Ｂ
浓度。ａｂｃ分 别为各
方程的常数。方程 （－ ２ ５－ ０ １是由Ｓ ｙ ｅ 应用 ｎ ｄｒ 顶替吸附模型导出的液 固色谱保留方程。方程
（－０２是近似的溶解 ２５－）
度参数理论导出的保留
值方程。方程（－０３ ２５－）
是Ｓ ｏｔ ｃｔ 和Ｋｕｅａ在多 ｅｒ 层吸附模型基础上导出
ｌｇ Ｂ ａ ｂ Ｂ ｏｋＡ＝ － ｏ ｌ ｇＣ
表２５ － 峰保留时间随 值的变 化
高效液相色谱HPLC简介PPT学习教案
2～50
5～15 10-6～10-2 0.05～1.0
0.001～0.3 0.1～10 1～20
第2页/共25页
２.2 HPLC的特点（二）
项目 进样方式
流动相 分离原理
检测器
应用范围
高效液相色谱法
气相色谱法
样品制成溶液
样品需气化或裂解
溶液
惰性气体
吸附、分配、筛析、亲和等
吸附和分配
UVD、PDAD、RID等 TCD、FID、ECD等
◆恒压泵--------压力恒 定，但 流量不 恒定；
第6页/共25页
3.3 阻尼器介绍
阻尼器----消除、减轻往复式柱塞泵输出的压力脉动。
第7页/共25页
检测器简介（一）
紫外吸收检测器（UVD）
◆
原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率 的变化来测定样品浓度的检测器。它具有波长固定，波 长可变和光二极管阵列三种类型。
第23页/共25页
谢谢大家！
第24页/共25页
感谢您的观看！
第25页/共25页
特点：选择性检测器、对流量和温度敏感性低、灵敏度较 高（10-9g）。
折光指数检测器（RID）
◆
原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试 样浓度的检测器。
特点：通用性检测器，温变化要保持在±0.001℃、灵敏度 低（10-6g）。
第8页/共25页
检测器简介（二）
◆ 电导检测器（ECD）
原理：监测溶液的电导率变化的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组 成变化有明显响应、灵敏度低（10-3g）。适用于离子 型化合物。
第15页/共25页
色谱柱简介（三）
高效液相色谱法 讲课文档
CH2CH3
resin-O-CH2-COOresin-O-(CH2)3-SO3-
Buffer: PBS + NaCl
Tris-HCl + NaCl
Gradient: Yes
现在十八页，ห้องสมุดไป่ตู้共六十页。
Ion Exchange Chrom
现在十九页，总共六十页。
Affinity Chromatography
基 质
配基
目标产物
填料：
基质--- 纤维素、凝集素、交联 琼脂糖或葡萄糖、聚丙烯酰胺 、多孔玻璃…
配基--- 抗体、凝集素、酶、抑 制剂、抗生素、配位体…
现在二十页，总共六十页。
Affinity Chromatography
柱的选择：根据被分离目标产物的特点选择合适的 色谱柱，重要是配基。 影响因素：配基容易被杂质污染，柱子的寿命短， 样品须前处理。主要用于纯化较为昂贵的蛋白，抗 体等。
Free ligand concentration
Buffer: 含有可以与基质上的 配基结合物的溶液 Gradient: Yes
现在二十一页，总共六十页。
UV absorbance
Hydrophobic interaction Chromatography
nonpolar
--
protein surface
+++
nonpolar
O
H3C-C-N-C-
O-
NH
填料：
基质：有机聚合物（交联琼脂 糖、乙烯聚合物、TSK-PW） 和大孔硅胶键合相
H3C-C-N-C-OO NH
配基： 苯基、戊基、丁基、羟 丙基、乙基、聚乙二醇、苄基 等
resin-O-CH2-COOresin-O-(CH2)3-SO3-
Buffer: PBS + NaCl
Tris-HCl + NaCl
Gradient: Yes
现在十八页，ห้องสมุดไป่ตู้共六十页。
Ion Exchange Chrom
现在十九页，总共六十页。
Affinity Chromatography
基 质
配基
目标产物
填料：
基质--- 纤维素、凝集素、交联 琼脂糖或葡萄糖、聚丙烯酰胺 、多孔玻璃…
配基--- 抗体、凝集素、酶、抑 制剂、抗生素、配位体…
现在二十页，总共六十页。
Affinity Chromatography
柱的选择：根据被分离目标产物的特点选择合适的 色谱柱，重要是配基。 影响因素：配基容易被杂质污染，柱子的寿命短， 样品须前处理。主要用于纯化较为昂贵的蛋白，抗 体等。
Free ligand concentration
Buffer: 含有可以与基质上的 配基结合物的溶液 Gradient: Yes
现在二十一页，总共六十页。
UV absorbance
Hydrophobic interaction Chromatography
nonpolar
--
protein surface
+++
nonpolar
O
H3C-C-N-C-
O-
NH
填料：
基质：有机聚合物（交联琼脂 糖、乙烯聚合物、TSK-PW） 和大孔硅胶键合相
H3C-C-N-C-OO NH
配基： 苯基、戊基、丁基、羟 丙基、乙基、聚乙二醇、苄基 等
第十二章讲义高效液相色谱
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相柱 色谱装置
高效液相色谱仪
例：分离20种氨基酸
经典柱色 谱
柱长：170 cm 柱径：0.9 cm F：30 mL/h t分离: >20 h
HPL C
t分离：1 h
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相色谱法
固定相 固定相粒度（μm） 固定相粒度分布(RSD) 柱长（cm） 柱内径（cm） 柱 入 口 压 强 （ kg/cm2 ） 柱效(每米理论塔片数) 样品用量（g） 分析所需时间（h） 装置
液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为： ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡
过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。 而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提 高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以 上的液体作流动相，增大分离的选择性。
其是在生物学和医学等方面应
用极为广泛。如氨基酸、蛋白
质、核酸、烃、碳水化合物、 分
药品、多糖、高聚物、农药、
子 量
抗生素、胆固醇、金属有机物
等 分 析 ， 大 多 是 通 过 HPLC 来
完成的。
右图是各种HPLC方法的应
用范围及对象
极性增加 不溶于水 非极性
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向分配
正向分配 离子交换
主要由接管、检测器流通池体积及检测器响应时间 等因素所引起。因此，尽可能用短而内径细的接管， 减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应速度 等都是克服柱后展宽的途径
第二节 高效液相色谱仪
一、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐(滤棒，可滤去颗粒状物质) 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
中国药典 高效液相色谱讲义
26
英国药典2000年版
? 附录ID 液相色谱法，简要叙述了仪器、方法、归一化法、效能及 与正文有关的内容。在方法项下，说明要用对照溶液测试，以决 定仪器的设置和获得适当响应的注样量，进行重复进样以验证重 复性，必要时，还要检测理论板数。
? 除另有规定外，测定被测物峰的峰面积。若被测物峰的对称因子 为0.8-1.2，也可测定峰高。在应用梯度洗脱时，则测定峰面积。 在归一化项下，说明在用归一化法测定时最好使用宽范围放大器 和自动积分仪。
仪器包括： 储液器 泵 进样器 色谱柱 检测器
3
色谱柱
? 反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充 剂为化学键合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常 用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶也 有使用。
? 正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶 等。
? 离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色 谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异 构体的分离通常使用手性填充剂。
? 紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与供 试品溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；
? 示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的 化合物均有响应；
? 蒸发光散检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品 的质量有关；
? 二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱，故可用于供 试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。
16
分离度(R)
? 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的 分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通 过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测 定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其 他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适 当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的 分离度，对色谱系统进行评价与控制。
英国药典2000年版
? 附录ID 液相色谱法，简要叙述了仪器、方法、归一化法、效能及 与正文有关的内容。在方法项下，说明要用对照溶液测试，以决 定仪器的设置和获得适当响应的注样量，进行重复进样以验证重 复性，必要时，还要检测理论板数。
? 除另有规定外，测定被测物峰的峰面积。若被测物峰的对称因子 为0.8-1.2，也可测定峰高。在应用梯度洗脱时，则测定峰面积。 在归一化项下，说明在用归一化法测定时最好使用宽范围放大器 和自动积分仪。
仪器包括： 储液器 泵 进样器 色谱柱 检测器
3
色谱柱
? 反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充 剂为化学键合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常 用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶也 有使用。
? 正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶 等。
? 离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色 谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异 构体的分离通常使用手性填充剂。
? 紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与供 试品溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；
? 示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的 化合物均有响应；
? 蒸发光散检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品 的质量有关；
? 二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱，故可用于供 试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。
16
分离度(R)
? 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的 分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通 过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测 定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其 他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适 当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的 分离度，对色谱系统进行评价与控制。
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16
色谱峰的有关参数
W½ =a + bt
17
几种描述分离状况参数的关系
Rstr(2)tr(1) (tr(2) 1)tr(1) (d1) N 1
W 1/2
tr(1)
W 1/2
5.54
两峰分离的必要条件： 1、两组分的保留值不同 2、样品组分应有一定的保留值 3、色谱柱应具有分离必须的柱效
18
色谱柱峰容量
H/u 越小， 分析时间越短
21
冲洗剂消耗量指标
给定分析任务，所需流动相体积：
Fc为冲洗剂流量，dc为柱内径。
u=L/t0 d2H
t=t0(1+k’)
22
不同尺寸的色谱柱溶剂消耗指标
柱尺寸 线速度
β΄
d
2 c
H
d
2 c
H
q m in
d
2 c
VR= Vm +KVs = Vm + k´(Vm/ Vs) Vs = Vm + k´Vm = Vm (1+ k´)
tr = to (1+ k´)
k´= t r / to - 1
k´与固定相,流动相性质及柱温有关;与流速,柱尺寸无关. 2
(5) 死体积(Vm) 和死时间(to)
1) 采用比流动相溶剂少一个-CH2-基团的同系物（己烷—戊烷 ） 2）甲醇/水------甲醇 3） 正相--------四氯乙烯，反相---苯甲酸或硝酸 4） 计算法
(2) 保留体积
VR (ml) = tr(min) * Fc(ml/min) VR= Vm +KVs
K--平衡分配系数, Vs--固定相体积, Vm =流动相所占体积
溶质在固定相中的浓度(ns/Vs)
ns Vm
K=---------------------------------- = ---- * ----
色谱柱接连流出分离良好的色谱峰，所能够分离 的最大组分数。
为了使总分离效能指标能直接与所分析组分的 多少相关联，可以采用峰容量（P）来评价色谱柱。 色谱条件一定时，在指定的时间内，能够在色谱柱 中流出的满足分离度要求的等高色谱峰的个数。
19
20
快速色谱
tr(last) = H /u * Nmin (1+k‘last )
ID=1.0 mm
0.05
0.09
0.14
0.19 0.24
0.28
0.33
ID=2.1mm
0.21
0.41
0.62
0.83 1.04
1.24
1.45
ID=4.6mm
1.00
2.00
3.00
3.99 4.98
5.98
6.98
柱外效应对柱效的影响
A:21 μl(20.5) B:11 μl(11.0) C: 2 μl(1.7)
Vc--空柱体积
7
Kf =dp²/1000
K0为渗透性常数（厘米2） η 为流动相黏度（泊或达因.秒/厘米2） ΔP 为柱压降（大气压 X 106 或达因/厘米2）
8
理论板高与线速的关系
Van Deemter
H =A +B /u +Cu
A:涡流扩散项，B:纵向扩散项， C: 传质扩散项
9
HPLC填料颗粒尺寸的演变 70年代早期 40µm薄壳非多孔基质上涂布 100~500 psi 1000塔板数/米 1m长色谱柱
薄壳填料—0.42 多孔硅胶—0.84
6
渗透性(Kf)
渗透性定义为 ：Kf =uηLεT /Δp
ε Kf = K0 T =uηLεT /Δp
εT =Fc.to /Vc
Kf =
uηL
Δp
Fc
Vc
式中：K0为渗透性常数（cm2）,η为流动相粘度（Pa·s/cm2）,△P为柱压降（Pa） Fc为冲洗剂流速（ml/s） , L为柱长（cm）,dc为柱内径（cm）
van Deemter曲线及方程式
A 项 + B 项 + C项
HETP PLATES
最低HETP =>最优化的塔板数
H
C项
（传质）
A项
（颗粒度和柱床填装的优良程度）
B项
（轴向扩散）
线速度 U （mm/sec）
三项加在一起最终得到的 “van Deemter曲线”
van Deemter曲线的提示
van Deemter 曲线的挑战
10 min
10 min
70年代末期 10µm不规则微多孔填料 1000~2500 psi 25,000塔板数/米 3.9×300mm
从80年代到现在 1.5~5µm球形微多孔填料 1500~4000 psi 50,000~80,000塔板数/米 3.9×300mm
10 min
如果我们使用更小颗粒度的填料会发生什么情况？
与柱温固定相种类流动相组成有关
4
§3 -1 流动相线速（u)
流动相线速u: 通常指平均线速度
u = L / t。
ε u =Fc /A * T
A:柱截面积 L 和 u 一定时， t。一定
5
§3 -2 柱总孔隙率(εT )
柱总孔隙率：柱横截面上流动相所占的分数，主要取决 于柱填料类型。
εT =Fc to / Vc
空柱管体积（Vc ) * 总孔隙度（εT)
to=
流动相体积流速（F c)
= π/4 *d²c *L * εT/Fc
计算孔隙度
3
§2 选择性指标( )和相对保留值()
´= t r(2) / tr(1) =(1+ k´(2)/(1+ k´(1)) = t r '(2) / tr' (1) = k´(2) / k´(1) ´作为选择性指标比 直观
▪ 颗粒度越小柱效越高
• 颗粒度控制着分离的 质量
▪ 更小的颗粒度：
• 使最高柱效点向更高 线速度方向移动
• 有更宽的线速度范围
▪ 降低颗粒度不但可以 增加柱效，同时也增 加分离速度
如果填料的颗粒继续演变……
更小的颗粒度……
被仪器及色谱柱 的耐压的所限制
Flow rate (ml/min)
Linear velocity(u,mm/sec)
W½ = a '+ b'vR
14
检测器死体积对不对称度的影响
A、检测系统死体积11ul; B、检测系统死体积2ul
15
柱效能总指标
色谱过程中，柱效能是色谱柱分离能力的度量。 主要由操作参数和动力学因素决定。一般可通过 测定色谱柱的塔片数、分离度等评价。
注意到两峰相邻时近似地有 半峰宽相等， 因此
溶质在流动相中的浓度(nm/Vm)
nm Vs
ns, nm 溶质在固定相和流动相中的量
1
(3) 调整保留时间
tr´= tr - to
V = VR - Vm
(4) 容量因子 (k’)
固定相中容质的量(ns)
k´=------------------------
流动相中容质的量(nm)
K = k´(Vm/ Vs)
色谱峰的有关参数
W½ =a + bt
17
几种描述分离状况参数的关系
Rstr(2)tr(1) (tr(2) 1)tr(1) (d1) N 1
W 1/2
tr(1)
W 1/2
5.54
两峰分离的必要条件： 1、两组分的保留值不同 2、样品组分应有一定的保留值 3、色谱柱应具有分离必须的柱效
18
色谱柱峰容量
H/u 越小， 分析时间越短
21
冲洗剂消耗量指标
给定分析任务，所需流动相体积：
Fc为冲洗剂流量，dc为柱内径。
u=L/t0 d2H
t=t0(1+k’)
22
不同尺寸的色谱柱溶剂消耗指标
柱尺寸 线速度
β΄
d
2 c
H
d
2 c
H
q m in
d
2 c
VR= Vm +KVs = Vm + k´(Vm/ Vs) Vs = Vm + k´Vm = Vm (1+ k´)
tr = to (1+ k´)
k´= t r / to - 1
k´与固定相,流动相性质及柱温有关;与流速,柱尺寸无关. 2
(5) 死体积(Vm) 和死时间(to)
1) 采用比流动相溶剂少一个-CH2-基团的同系物（己烷—戊烷 ） 2）甲醇/水------甲醇 3） 正相--------四氯乙烯，反相---苯甲酸或硝酸 4） 计算法
(2) 保留体积
VR (ml) = tr(min) * Fc(ml/min) VR= Vm +KVs
K--平衡分配系数, Vs--固定相体积, Vm =流动相所占体积
溶质在固定相中的浓度(ns/Vs)
ns Vm
K=---------------------------------- = ---- * ----
色谱柱接连流出分离良好的色谱峰，所能够分离 的最大组分数。
为了使总分离效能指标能直接与所分析组分的 多少相关联，可以采用峰容量（P）来评价色谱柱。 色谱条件一定时，在指定的时间内，能够在色谱柱 中流出的满足分离度要求的等高色谱峰的个数。
19
20
快速色谱
tr(last) = H /u * Nmin (1+k‘last )
ID=1.0 mm
0.05
0.09
0.14
0.19 0.24
0.28
0.33
ID=2.1mm
0.21
0.41
0.62
0.83 1.04
1.24
1.45
ID=4.6mm
1.00
2.00
3.00
3.99 4.98
5.98
6.98
柱外效应对柱效的影响
A:21 μl(20.5) B:11 μl(11.0) C: 2 μl(1.7)
Vc--空柱体积
7
Kf =dp²/1000
K0为渗透性常数（厘米2） η 为流动相黏度（泊或达因.秒/厘米2） ΔP 为柱压降（大气压 X 106 或达因/厘米2）
8
理论板高与线速的关系
Van Deemter
H =A +B /u +Cu
A:涡流扩散项，B:纵向扩散项， C: 传质扩散项
9
HPLC填料颗粒尺寸的演变 70年代早期 40µm薄壳非多孔基质上涂布 100~500 psi 1000塔板数/米 1m长色谱柱
薄壳填料—0.42 多孔硅胶—0.84
6
渗透性(Kf)
渗透性定义为 ：Kf =uηLεT /Δp
ε Kf = K0 T =uηLεT /Δp
εT =Fc.to /Vc
Kf =
uηL
Δp
Fc
Vc
式中：K0为渗透性常数（cm2）,η为流动相粘度（Pa·s/cm2）,△P为柱压降（Pa） Fc为冲洗剂流速（ml/s） , L为柱长（cm）,dc为柱内径（cm）
van Deemter曲线及方程式
A 项 + B 项 + C项
HETP PLATES
最低HETP =>最优化的塔板数
H
C项
（传质）
A项
（颗粒度和柱床填装的优良程度）
B项
（轴向扩散）
线速度 U （mm/sec）
三项加在一起最终得到的 “van Deemter曲线”
van Deemter曲线的提示
van Deemter 曲线的挑战
10 min
10 min
70年代末期 10µm不规则微多孔填料 1000~2500 psi 25,000塔板数/米 3.9×300mm
从80年代到现在 1.5~5µm球形微多孔填料 1500~4000 psi 50,000~80,000塔板数/米 3.9×300mm
10 min
如果我们使用更小颗粒度的填料会发生什么情况？
与柱温固定相种类流动相组成有关
4
§3 -1 流动相线速（u)
流动相线速u: 通常指平均线速度
u = L / t。
ε u =Fc /A * T
A:柱截面积 L 和 u 一定时， t。一定
5
§3 -2 柱总孔隙率(εT )
柱总孔隙率：柱横截面上流动相所占的分数，主要取决 于柱填料类型。
εT =Fc to / Vc
空柱管体积（Vc ) * 总孔隙度（εT)
to=
流动相体积流速（F c)
= π/4 *d²c *L * εT/Fc
计算孔隙度
3
§2 选择性指标( )和相对保留值()
´= t r(2) / tr(1) =(1+ k´(2)/(1+ k´(1)) = t r '(2) / tr' (1) = k´(2) / k´(1) ´作为选择性指标比 直观
▪ 颗粒度越小柱效越高
• 颗粒度控制着分离的 质量
▪ 更小的颗粒度：
• 使最高柱效点向更高 线速度方向移动
• 有更宽的线速度范围
▪ 降低颗粒度不但可以 增加柱效，同时也增 加分离速度
如果填料的颗粒继续演变……
更小的颗粒度……
被仪器及色谱柱 的耐压的所限制
Flow rate (ml/min)
Linear velocity(u,mm/sec)
W½ = a '+ b'vR
14
检测器死体积对不对称度的影响
A、检测系统死体积11ul; B、检测系统死体积2ul
15
柱效能总指标
色谱过程中，柱效能是色谱柱分离能力的度量。 主要由操作参数和动力学因素决定。一般可通过 测定色谱柱的塔片数、分离度等评价。
注意到两峰相邻时近似地有 半峰宽相等， 因此
溶质在流动相中的浓度(nm/Vm)
nm Vs
ns, nm 溶质在固定相和流动相中的量
1
(3) 调整保留时间
tr´= tr - to
V = VR - Vm
(4) 容量因子 (k’)
固定相中容质的量(ns)
k´=------------------------
流动相中容质的量(nm)
K = k´(Vm/ Vs)