第十二章讲义高效液相色谱
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主要由接管、检测器流通池体积及检测器响应时间 等因素所引起。因此，尽可能用短而内径细的接管， 减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应速度 等都是克服柱后展宽的途径
第二节 高效液相色谱仪
一、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐(滤棒，可滤去颗粒状物质) 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
高效液相色谱仪流程图
进样口
高压泵
流动相 废液 溶剂
色谱柱 检测器
一 高压输液系统
要求 输出压力高 平稳、脉冲小 流量稳定可调
耐腐蚀
恒流泵特点是在一定操作条
件下1，高输出压流泵量保持恒定而与色
谱柱引起阻力变化无关，如往复 式柱塞泵、注射式螺旋泵；
恒压泵是指能保持输出压力恒 定，但其流量则随色谱系统阻力 而变化，故保留时间的重视性差， 如气动泵。
②液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱。 等，作为分析时选择余地大；而气相色谱可选择余地小的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于 色谱分离条件的选择。
（4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。 但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂， 价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充 的。
气相色谱（GC）
高效液相色谱 （HPLC）
应用范围 占有机物的20% 占有机物的80%
分离效果
高
更高
选择性
流动相是气体，只 能选择固定相
流动相是液体，流 动相、固定相都可 选择。选择性广。
温度
高温
常温（分离效果好）
灵敏度(g/ml)
10-12
10-9
液相色谱与气相色谱的比较
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化 合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80 ％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主 要采用高效液相色谱法进行分离和分析。
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相柱 色谱装置
高效液相色谱仪
例：分离20种氨基酸
经典柱色 谱
柱长：170 cm 柱径：0.9 cm F：30 mL/h t分离: >20 h
HPL C
t分离：1 h
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相色谱法
固定相 固定相粒度（μm） 固定相粒度分布(RSD) 柱长（cm） 柱内径（cm） 柱 入 口 压 强 （ kg/cm2 ） 柱效(每米理论塔片数) 样品用量（g） 分析所需时间（h） 装置
第十二章高效液相色谱
概述
高效液相色谱法
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代 初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，
目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。
它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论， 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因 而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。
液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为： ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡
过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。 而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提 高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以 上的液体作流动相，增大分离的选择性。
往复式柱塞泵 注射式螺旋泵；
2 梯度洗脱装置
其是在生物学和医学等方面应
用极为广泛。如氨基酸、蛋白
质、核酸、烃、碳水化合物、 分
药品、多糖、高聚物、农药、
子 量
抗生素、胆固醇、金属有机物
等 分 析 ， 大 多 是 通 过 HPLC 来
完成的。
右图是各种HPLC方法的应
用范围及对象
极性增加 不溶于水 非极性
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向分配
正向分配 离子交换
离子对色谱 疏水分配作用 离子性物质分析
疏水作用色谱 手性色谱 亲和色谱
疏水分配作用 蛋白质分离与纯化 立体效应 手性异构体分离，药物纯化
生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
应用
由于HPLC分离分析的高灵
敏度、定量的准确性、适于非
挥发性和热不稳定组分的分析，
因此，在工业、科学研究，尤
凝胶渗透
尺寸排阻
凝胶过滤
第一节 液相色谱柱效
一 液相色谱速率理论
可忽略
H ( 1D M) 1C dD M(C sd2 f C m dp 2)u
C edp C m dp 2u
u D s D M
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅵ
涡流 流动 扩相 散传 项质
阻 力
分固
流
子定
动
扩相
相
散传
传
项质
质
阻
阻
力
力
项
修正的速率方程： HACu
高速 高效 高灵敏度
液相色谱的分类
类型
主要分离机理 主要分析对象或应用领域
吸附色谱 吸附能，氢键 异构体分离、族分离，制备
分配色谱 疏水分配作用 各种有机化合物的分离、分析与制备
凝胶色谱 溶质分子大小 高分子分离，分子量及其分布的测定
离子交换色谱
库仑力
无机离子、有机离子分析
离子排斥色谱 Donnan膜平衡 有机酸、氨基酸、醇、醛分析
目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对 生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如 蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高 聚物、染料及药物等物质的分离和分析。
高效液相色谱法特点
①适用范围广； ②分离性能好； ③分析速度快； ④流动相可选择性范围宽； ⑤灵敏度较高； ⑥色谱柱可反复使用； ⑦流出组分容易收集； ⑧安全。
一般规格 75~500 20~30% 10~100
2~5 0.01~1 10~100 1~10 1~20 非仪器化
wk.baidu.com
高效液相色谱法 （分析型） 特殊规格 3~20 <5% 10~30 0.1~0.5 20~300 104~105 10-7~10-2 0.05~0.5 仪器化
液相色谱与气相色谱的比较
提高柱效 途径
流动相流速对板高的影响
1) 小颗粒填料，填充均匀； 2) 选择较低的流动相流速； 3) 选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。
二 液相色谱中的柱外谱带展宽
柱外谱带展宽又称“柱外效应”，系指从进样点到 检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起的色 谱峰展宽，柱效下降。 可分为： 柱前展宽 主要由进样引起，减小进样器的死体积，用阀 门进样可减少柱前谱带展宽，提高柱效。 可分为： 柱后展宽
第二节 高效液相色谱仪
一、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐(滤棒，可滤去颗粒状物质) 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
高效液相色谱仪流程图
进样口
高压泵
流动相 废液 溶剂
色谱柱 检测器
一 高压输液系统
要求 输出压力高 平稳、脉冲小 流量稳定可调
耐腐蚀
恒流泵特点是在一定操作条
件下1，高输出压流泵量保持恒定而与色
谱柱引起阻力变化无关，如往复 式柱塞泵、注射式螺旋泵；
恒压泵是指能保持输出压力恒 定，但其流量则随色谱系统阻力 而变化，故保留时间的重视性差， 如气动泵。
②液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱。 等，作为分析时选择余地大；而气相色谱可选择余地小的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于 色谱分离条件的选择。
（4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。 但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂， 价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充 的。
气相色谱（GC）
高效液相色谱 （HPLC）
应用范围 占有机物的20% 占有机物的80%
分离效果
高
更高
选择性
流动相是气体，只 能选择固定相
流动相是液体，流 动相、固定相都可 选择。选择性广。
温度
高温
常温（分离效果好）
灵敏度(g/ml)
10-12
10-9
液相色谱与气相色谱的比较
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化 合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80 ％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主 要采用高效液相色谱法进行分离和分析。
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相柱 色谱装置
高效液相色谱仪
例：分离20种氨基酸
经典柱色 谱
柱长：170 cm 柱径：0.9 cm F：30 mL/h t分离: >20 h
HPL C
t分离：1 h
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相色谱法
固定相 固定相粒度（μm） 固定相粒度分布(RSD) 柱长（cm） 柱内径（cm） 柱 入 口 压 强 （ kg/cm2 ） 柱效(每米理论塔片数) 样品用量（g） 分析所需时间（h） 装置
第十二章高效液相色谱
概述
高效液相色谱法
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代 初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，
目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。
它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论， 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因 而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。
液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为： ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡
过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。 而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提 高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以 上的液体作流动相，增大分离的选择性。
往复式柱塞泵 注射式螺旋泵；
2 梯度洗脱装置
其是在生物学和医学等方面应
用极为广泛。如氨基酸、蛋白
质、核酸、烃、碳水化合物、 分
药品、多糖、高聚物、农药、
子 量
抗生素、胆固醇、金属有机物
等 分 析 ， 大 多 是 通 过 HPLC 来
完成的。
右图是各种HPLC方法的应
用范围及对象
极性增加 不溶于水 非极性
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向分配
正向分配 离子交换
离子对色谱 疏水分配作用 离子性物质分析
疏水作用色谱 手性色谱 亲和色谱
疏水分配作用 蛋白质分离与纯化 立体效应 手性异构体分离，药物纯化
生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
应用
由于HPLC分离分析的高灵
敏度、定量的准确性、适于非
挥发性和热不稳定组分的分析，
因此，在工业、科学研究，尤
凝胶渗透
尺寸排阻
凝胶过滤
第一节 液相色谱柱效
一 液相色谱速率理论
可忽略
H ( 1D M) 1C dD M(C sd2 f C m dp 2)u
C edp C m dp 2u
u D s D M
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅵ
涡流 流动 扩相 散传 项质
阻 力
分固
流
子定
动
扩相
相
散传
传
项质
质
阻
阻
力
力
项
修正的速率方程： HACu
高速 高效 高灵敏度
液相色谱的分类
类型
主要分离机理 主要分析对象或应用领域
吸附色谱 吸附能，氢键 异构体分离、族分离，制备
分配色谱 疏水分配作用 各种有机化合物的分离、分析与制备
凝胶色谱 溶质分子大小 高分子分离，分子量及其分布的测定
离子交换色谱
库仑力
无机离子、有机离子分析
离子排斥色谱 Donnan膜平衡 有机酸、氨基酸、醇、醛分析
目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对 生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如 蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高 聚物、染料及药物等物质的分离和分析。
高效液相色谱法特点
①适用范围广； ②分离性能好； ③分析速度快； ④流动相可选择性范围宽； ⑤灵敏度较高； ⑥色谱柱可反复使用； ⑦流出组分容易收集； ⑧安全。
一般规格 75~500 20~30% 10~100
2~5 0.01~1 10~100 1~10 1~20 非仪器化
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高效液相色谱法 （分析型） 特殊规格 3~20 <5% 10~30 0.1~0.5 20~300 104~105 10-7~10-2 0.05~0.5 仪器化
液相色谱与气相色谱的比较
提高柱效 途径
流动相流速对板高的影响
1) 小颗粒填料，填充均匀； 2) 选择较低的流动相流速； 3) 选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。
二 液相色谱中的柱外谱带展宽
柱外谱带展宽又称“柱外效应”，系指从进样点到 检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起的色 谱峰展宽，柱效下降。 可分为： 柱前展宽 主要由进样引起，减小进样器的死体积，用阀 门进样可减少柱前谱带展宽，提高柱效。 可分为： 柱后展宽