淋病奈瑟菌孔蛋白PorB的原核表_省略_及其在疫苗血清学检测中的初步应用_焦红梅

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淋病奈瑟菌孔蛋白B原核重组质粒的构建、表达与蛋白鉴定

淋病奈瑟菌孔蛋白B原核重组质粒的构建、表达与蛋白鉴定叶嗣颖;廖芳;宋启发;崔斌;熊萍【期刊名称】《华中科技大学学报（医学版）》【年(卷),期】2005(34)5【摘要】目的克隆和分析淋病奈瑟菌孔蛋白(porinⅠB,PⅠB)的基因序列并表达相应的蛋白质,为淋病奈瑟菌感染的检测和基因工程疫苗的研究与开发建立基础.方法PCR扩增出孔蛋白PⅠB DNA片段后构建出重组质粒pET-PⅠB,并经质粒酶切筛选、DNA测序和异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导大肠埃希菌DE3表达蛋白予以证实.结果所得PⅠB核苷酸序列与GenBank(AF090801)公布的序列相比较,同源性达99.28%,推导氨基酸序列同源性为98.14%.SDS-PAGE检测到40 kD大小的融合蛋白.结论淋病奈瑟菌孔蛋白PⅠB原核表达质粒构建正确.【总页数】4页(P529-531,535)【作者】叶嗣颖;廖芳;宋启发;崔斌;熊萍【作者单位】华中科技大学同济医学院基础医学院病原生物学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院基础医学院病原生物学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院基础医学院病原生物学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院基础医学院病原生物学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院基础医学院病原生物学系,武汉,430030【正文语种】中文【中图分类】R378.1【相关文献】1.淋病奈瑟菌临床菌株外膜蛋白PIA基因序列分析及原核表达系统的构建 [J], 孙爱华;宋春涵;吴森林;毛亚飞;周海鸥;严杰2.淋病奈瑟菌孔蛋白PorB的原核表达及其在疫苗血清学检测中的初步应用 [J], 焦红梅;杨慧;赵丹;李国才;陈红菊;严华;季明春3.淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB原核表达系统的构建及其序列分析 [J], 李小余;任斌;张慧;周洪昌;李华;郭跃4.淋病奈瑟菌孔蛋白PIA真核表达系统的构建及序列分析 [J], 贺超;廖芳;刘海鹏;刘丽江5.淋病奈瑟菌外膜蛋白PIA基因原核表达系统的构建及序列分析 [J], 李召东;潘亚平;沈琳;张永华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

淋病奈瑟菌膜蛋白抗原表位的研究

淋病奈瑟菌膜蛋白抗原表位的研究戴翔;廖芳;黄进;周俊立;张玲【期刊名称】《中国皮肤性病学杂志》【年(卷),期】2007(21)8【摘要】目的利用人工合成多肽制备针对淋球菌外膜蛋白PIB抗原表位的特异性多克隆抗体,以期用于淋球菌的检测,为进一步建立新型淋病快速诊断方法提供研究基础。

方法根据PIB抗原表位的氨基酸序列合成一段多肽(LD1),并将其与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联构成完全抗原LD1-KLH,免疫动物,收集抗血清,用ELISA和Western blot检测其特异性。

结果ELISA检测表明,LD1-KLH具有免疫原性,免疫动物能刺激机体产生较强的体液免疫反应,兔血清抗体和豚鼠血清抗体效价最高分别达到1:3200和1:25600;抗血清能与淋球菌临床株特异性结合,与葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌和真菌等其他微生物之间没有交叉反应;Westernblot结果显示,抗血清能识别淋球菌裂解物,产生特异性条带,相对分子质量(Mr)为37300。

结论人工合成多肽具有免疫原性,能诱导机体产生识别淋球菌抗原表位的特异性抗体。

【总页数】4页(P458-461)【关键词】淋病奈瑟菌;外膜蛋白;表位;多肽【作者】戴翔;廖芳;黄进;周俊立;张玲【作者单位】华中科技大学同济医学院病原生物学系【正文语种】中文【中图分类】R378.1【相关文献】1.淋病奈瑟球菌对头孢菌素类药物的敏感性及多抗原序列分型研究 [J], 蓝银苑;吴兴中;覃晓琳;黄进梅;薛耀华;曾维英;欧江丽;唐三梅;方铭恒2.淋病奈瑟菌NspA原核表达及其抗原性研究 [J], 李国才;解如山;蒋桂花;朱立天;焦红梅;潘兴元;陈红菊;严华;季明春3.遵义地区淋病奈瑟菌多抗原序列分型及耐药性分析 [J], 黄健;黄美容;於薇;黄娅娅;陈泽慧;陈安林;闵迅4.淋病奈瑟菌共同抗原表位在淋病快速检测中的临床应用价值 [J], 胡春华;李玲;陈雷;郑新华;李刚;刘道忠;裴娇;廖芳5."皮肤物理抗菌膜"专利技术在小鼠生殖道淋病奈瑟球菌感染中的预防作用 [J], 方先林;戴玉田;尹跃平;兰厚金;周六化因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

淋病奈瑟菌外膜蛋白PIA基因原核表达系统的构建及序列分析

［摘要］目的：分析比较５株临床分离的淋病奈瑟菌外膜蛋白ＰＩＡ基因核苷酸及氨基酸序列，构建ＰＩＡ基因的原核表达
系统。方法：采用高保真ＰＣＲ扩增５株淋病奈瑟菌全长ＰＩＡ基因序列，Ｔ—Ａ克隆后测序并与已发表的序列进行比较，
用Ｗｏｎｄｅｒｆｕｌ分子生物学软件分析基因和蛋白质序列的相似性。再构建ＰＩＡ原核表达系统，不同浓度ＩＰＴＧ诱导后，１０％
ａｍｐｌｉｆｉｅｄｕｓｉｎｇｈｉｇｈｆｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲＴｈｅｔａｒｇｅｔａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｆｔｅｒＴ—Ａｃｌｏｎｉｎｇ．Ｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄｄｅ— ｄｕｃｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅ５ｉｓｏｌａｔｅｓｏｆⅣ＿ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｏｓｅｏｆｓｔｒａｉｎｓｒｅｐｏｒｔｅｄｂｙＷｏｎｄｅｒｆｕｌｍｏｌｅｃｕ．１ａｒｂｉｏｌｏｇｙｓｏｆｔｗａｒｅ．ＴｈｅｎｔｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓｏｆｔｈｅｄｏｍｉｎａｎｔｇｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆＰＩＡｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｒｅ－ｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｕｓｉｎｇ１０％ＳＤＳ—ＰＡＧＥａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｏｓａｇｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａ１ｌｔｈｅ５ＰＩＡｉｓｏｌａｔｅｓｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏｓｅｒｏｖａｒｓＩＡ６．Ｈｏｍｏｌｏｇｙｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄｄｅｄｕｃｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｉｔｈｔｈｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄｓｅ—

淋病奈瑟菌孔蛋白PorB的原核表达及其在疫苗血清学检测中的初步应用

淋病奈瑟菌孔蛋白PorB的原核表达及其在疫苗血清学检测中的初步应用焦红梅;杨慧;赵丹;李国才;陈红菊;严华;季明春【摘要】目的克隆并表达淋病奈瑟菌孔蛋白PorB,以重组蛋白为抗原,间接ELISA 检测免疫血清的抗体水平.方法利用PCR从淋病奈瑟菌WHO株基因组中扩增出PorB的基因,克隆入原核表达载体pET-30a中,构建出重组表达质粒pE'T30a-PorB,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.表达的蛋白进行SDS-PAGE分析,Western blot检测其反应原性.以纯化的重组蛋白rPorB作为检测抗原建立间接ELISA方法,用于检测淋病疫苗pVAX1-PorB免疫小鼠后的血清抗体水平.结果 PCR扩增得到淋病奈瑟菌孔蛋白PorB基因,表达的重组蛋白rPorB相对分子质量约40 kD,经Ni-NTA亲和层析纯化后的rPorB在SDS-PAGE中显示单一条带,Western blot证明纯化后的rPorB可与淋病奈瑟菌免疫血清特异性结合,具有良好的免疫反应性.间接ELISA结果表明,淋病疫苗pVAX1-PorB免疫小鼠血清PorB特异性抗体滴度为1∶200.结论成功构建了重组原核表达质粒pET30a-PorB,PorB在大肠杆菌中获得表达.以纯化的rPorB为检测抗原,间接ELISA可以用于淋病疫苗免疫效果的评价.该研究为淋病奈瑟菌感染诊断、疫苗的研究奠定了基础.【期刊名称】《实用临床医药杂志》【年(卷),期】2016(020)015【总页数】4页(P1-4)【关键词】淋病奈瑟菌;孔蛋白PorB;原核表达;免疫检测【作者】焦红梅;杨慧;赵丹;李国才;陈红菊;严华;季明春【作者单位】扬州大学医学院病原生物学与免疫学教研室,江苏扬州,225001;扬州大学医学院病原生物学与免疫学教研室,江苏扬州,225001;扬州大学医学院病原生物学与免疫学教研室,江苏扬州,225001;扬州大学医学院病原生物学与免疫学教研室,江苏扬州,225001;扬州大学医学院病原生物学与免疫学教研室,江苏扬州,225001;扬州大学医学院病原生物学与免疫学教研室,江苏扬州,225001;扬州大学医学院病原生物学与免疫学教研室,江苏扬州,225001【正文语种】中文【中图分类】R759.2论著淋病是一种由淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)引起的泌尿生殖系统黏膜的急性或慢性化脓性炎症,是世界范围内发病率较高的性传播疾病(STD)之一。

PCR-RLB技术同时检测淋病奈瑟菌 Opa和16S rRNA基因的研究

・２７４・中国皮肤性病学杂志２００７年５月第２ｌ卷第５期ＣｈｉｎＪＤｅｒｍＶｅｎｅｒｅｏｌ，Ｍａｙ．２００７，Ｖ０１．２１，Ｎｏ．５ＰＣＲ—ＲＬＢ技术同时检测淋病奈瑟菌Ｏｐａ和１６ＳｒＲＮＡ基因的研究向华国１，熊礼宽２，涂植光１［摘要］目的建立和评价一个新的多重ＰＣＲ－反向线点杂交技术（ＲＬＢ）检测淋病奈瑟茵（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ，ＮＧ）的方法。

方法选择ＮＧＯｐａ基因和１６ＳｒＲＮＡ基因分别设计两对ＰＣＲ引物，生物素标记下游引物。

构建二重ＰＣＲ扩增ＮＧＤＮＡ，然后与固定在尼龙膜上的特异性寡核苷核探针杂交。

并对１１７例经荧光定量ＰＣＲ（ＦＱ—ＰＣＲ）检测的标本进行检测。

结果多重ＰＣＲ两对引物均可扩增３株ＮＧ标准菌株ＤＮＡ，其中Ｏｐａ和１６ＳｒＲＮＡＰＣＲ产物的片段长度分别为８９ｂｐ和４１４ｂｐ。

４３份ＦＱ－ＰＣＲＮＧ阳性标本中３１份１６ＳｒＲＮＡＰＣＲ－ＲＬＢ阳性，而ＯｐａＰＣＲ—ＲＬＢ均检测为阳性，３１份二者均为阳性。

７４份ｒＱ—ＰＣＲＮＧ阴性标本中６４例ＯｐａＰＣＲ－ＲＬＢ阴性，７３例１６ＳｒＲＮＡＰＣＲ—ＲＬＢ阴性，６４份二者同时为阴性。

结论多重ＰＣＲ—ＲＬＢ检测ＮＧ是一种简便、快速及有效的方法，为无症状人群ＮＧ感染的初筛和准确诊断提供了一种可靠的方法。

［关键词］聚合酶链反应；核酸杂交；淋病奈瑟氏茵；寡核苷核探针［中图分类号］Ｒ３７８．１［文献标识码］Ａ［文章编号］１００１—７０８９（２００７）０５—０２７４—０３ＴｈｅＳｔｕｄｙｏｎＰＣＲ－ｒｅｖｅｒｓｅＬｉｎｅＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＡｓｓａｙｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎＯｐａａｎｄ１６ＳｒＲＮＡＧｅｎｅｏｆＮｅｉｓｓｅｒｉａＧｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＸＩＡＮＧＨｕａ－ｇｕｏ，ＸＩＯＮＧＬｉ—ｋｕａｎ，ＴＵＺｈｉ—ｇｕａｎｇ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＣｈｏｎｇｑｉｎｇＵｎｉｖｅｍｉ桫ｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０００１６，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓｔｕｄｙａｎｄｅｖａｌｕａｔｅａｎｅｗｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ—ｂａｓｅｄｒｅｖｅｒｓｅｌｉｎｅｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｓｓａｙ（ｍＰＣＲ—ＲＬＢ）ｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅＤＮＡｆｒｏｍＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｗｉｔｈｔｈｅｔｗｏｓｅｔｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓｄｉｒｅｃｔｅｄｔｏｔｈｅＯｐａａｎｄ１６ＳｒＲＮＡｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈｂｉｏｔｉｎ．ＴｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｔｓｓｐｅｃｉｆｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｏｂｅｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈａｍｉｄｏｇｅｎｉｎａＮｙｌｏｎｍｅｍｂｒａｎｅ．ＴｈｅｍＰＣＲ—ＲＬＢｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔ１１７ｓｐｅｃｉｍｅｎｓｔｈａｔｈａｄｔｅｓｔｅｄｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｆｙＰＣＲ（ＦＱ・ＰＣＲ）．ＲｅｓｕｌｔｓＡｌｌ３ｓｐｅｃｉｅｓｏｆＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙｍＰＣＲ—ＲＬＢ，ａｎｄｔｈｅｌｅｎｇｔｈｏｆＯｐａａｎｄ１６ＳｒＲＮＡＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｗａｓ８９ｂｐａｎｄ４１４ｂｐ．４３ａｎｄ３１ｏｆ４３ｒＱ—ＰＣＲｐｏｓｉｔｉｖｅｓｐｅｃｉ－ｍｅｎｓｗｅｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅｂｙＯｐａａｎｄ１６ＳｒＲＮＡＰＣＲ—ＲＬＢ．３１ｏｆｔｈｅｍｗｅｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅｂｙｂｏｔｈＯｐａａｎｄ１６ＳｒＲＮＡＰＣＲ．ＲＬＢ．６４ａｎｄ７３ｏｆ７４ＦＱ—ＰＣＲ—ｎｅｇａｔｉｖｅｓｐｅｃｉｍｅｎｓｗｅｒｅｎｅｇａｔｉｖｅｂｙＯｐａａｎｄ１６ＳｒＲＮＡＰＣＲ－ＲＬＢ。

淋病奈瑟菌的分子生物学检验

一、淋病奈瑟菌的基因组结构特征
淋病奈瑟菌FA1090菌株是最早被完成测序研究的淋病奈瑟菌菌株之一，它的染色体DNA长度为2.15Mbp，其中G+C含量为52.68%。编码区的 DNA长度占总长度的78%。共含有2069个基因，包括2002个具有编码功能的基因和67个编码结构性 RNAs基。Chung GT等人在2008年报道了淋病奈瑟菌新菌株NCCP11945的基因组结构。他们发现 NCCP11945染色体的DNA长度为2.23Mbp，据估计可以编码2622个开放性阅读框。同时，NCP11945 含有一个能编码12个ORFs的质粒，其DNA长度为 4153bp。据他们估计，整个基因组的编码基因的密度约为87%。全基因组平均G+C含量为52.4%。这与FA1090菌株相类似。
4．链替代扩增技术
SDA是一种基于酶促反应的新的DNA体外等温扩增技术。目前使用较多的是Becton Dikinson公司生产的Probe Tec ET，可以同时对CT和NG进行检测，Probe Tec ET特异性扩增 NG染色体PivNg基因，然后用荧光标记的探针检测其相应的DNA靶序列，2小时可以完成96份标本检测。与培养法相比具有很高的敏感性和特异性。
1．克服了淋球菌培养时间长等缺点，提高了临床样本检测的阳性率和准确性。
2．通过分子生物学技术可以进行淋球菌感染的分子流行病学调查。
3．可以准确、快速评价药物治疗的效果。 4．有利于淋病的鉴别诊断。
谢谢！
二、淋病奈瑟菌的分子生物学检验内容
（一）淋病奈瑟菌核酸的检测
1．聚合酶链反应
PCR是分子生物学中最常用检测基因的技术手段，也是淋病奈瑟菌基因诊断中最基本的方法。 PCR引物的设计应选择与其相应的靶基因，多采用：①隐蔽质粒cppB基因(cppBH01/3、1/2及 cppBN3/4)；②16s rRNA基因(SL67/59、NGPl/2)； ③porA假基因；④编码外膜蛋白基因（omp基因）；⑤opa基因等；⑥胞嘧啶DNA甲基转移酶基因(Roche Cobas Amplicor)。不同靶基因设计引物对PCR的敏感性和特异性有一定的影响。

我国脑膜炎奈瑟菌孔蛋白PorA、PorB的多态性分析

我国脑膜炎奈瑟菌孔蛋白PorA、PorB的多态性分析胡源;何利华;徐丽;顾一心;姜海;郭凤华;李马超;陆美娟;陈霞;邹清华;孟凡亮;邵祝军;张建中;闫笑梅;李波清;赵飞;肖迪;任军;郑明寰;樊春祥【期刊名称】《中华微生物学和免疫学杂志》【年(卷),期】2007(027)003【摘要】目的以蛋白质组学研究为基础,分析2003-2005年我国流脑暴发流行期间C群脑膜炎奈瑟菌菌株特征,建立以致病性相关蛋白多态性为目标的新分型方法.方法利用双向电泳和MALDI-TOF质谱鉴定分析2003-2005年流脑流行期内分离的66株C群脑膜炎奈瑟菌菌株及2株参考菌株的蛋白表达,重点分析与致病性相关的蛋白多态性特征.结果根据孔蛋白PorA、PorB在双向电泳中的多态性,建立了12个特征菌型.安徽菌株的PorA和PorB蛋白电泳谱型显示出了高度的一致性,而其他地区的菌株则显示出高度的多态性.结论 PorA和PorB蛋白2-DE电泳谱型可以作为一种新的菌株分型方法,可能在菌型变迁检测和流脑暴发预警中具有重要应用前景.【总页数】4页(P218-221)【作者】胡源;何利华;徐丽;顾一心;姜海;郭凤华;李马超;陆美娟;陈霞;邹清华;孟凡亮;邵祝军;张建中;闫笑梅;李波清;赵飞;肖迪;任军;郑明寰;樊春祥【作者单位】102206,北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室;102206,北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室;102206,北京,中国疾病预防控制中心呼吸道传染病室;102206,北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室;102206,北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室;102206,北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室;102206,北京,中国疾病预防控制中心呼吸道传染病室;安徽省疾病预防控制中心;安徽省疾病预防控制中心;102206,北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室;102206,北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室;102206,北京,中国疾病预防控制中心呼吸道传染病室;102206,北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室;102206,北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室;102206,北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室;102206,北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室;102206,北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室;安徽省疾病预防控制中心;102206,北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室;102206,北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室【正文语种】中文【中图分类】R5【相关文献】1.重组脑膜炎球菌PorB蛋白对猪伪狂犬弱毒疫苗的免疫增强效力2.抗淋病LTB-PorB核酸疫苗与蛋白疫苗联合应用增强免疫应答的研究3.淋病奈瑟菌孔蛋白PorB的原核表达及其在疫苗血清学检测中的初步应用4.淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB的克隆表达与鉴定5.淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因的克隆及序列分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

淋病奈瑟菌表面蛋白A克隆、表达和免疫原性鉴定

淋病奈瑟菌表面蛋白A克隆、表达和免疫原性鉴定目的克隆并构建淋病奈瑟菌表面蛋白A（nspA）基因原核表达系统，并对重组产物rNspA进行免疫原性鉴定。

方法采用PCR扩增nspA基因，构建nspA 基因原核表达系统。

SDS-PAGE检测目的重组蛋白rNspA表达情况，Ni-NTA亲和层析法提纯rNspA，免疫双扩散试验及Western Blot鉴定rNspA的免疫原性。

结果克隆的nspA基因与GenBank中相关序列相似性为100%，rNspA表达量为细菌总蛋白的40.1%，提纯的rNspA在SDS-PAGE后显示为单一的蛋白条带。

rNspA抗血清免疫双扩散效价为1∶4，rNspA抗血清能有效识别rNspA。

结论所构建的nspA基因原核表达系统能高效表达rNspA，表达的产物有良好的免疫原性，为淋病奈瑟菌免疫疫苗的研制奠定基础。

[Abstract] Objective To clone nspA gene of N.gonorrhoeae and then construct its prokaryotic expression system, and to identify the immunogenicity of its product. Methods nspA gene was amplified by PCR and its prokaryotic expression system was then constructed. SDS-PAGE was used to measure the expression of target recombinant protein rNspA, Ni-NTA affinity chromatography was applied to extract rNspA. Double immunodiffusion and Western Blot assay were applied to indentify immunogenicity of rNspA. Results Sequence similarity of the cloned nspA gene was 100% compared to the corresponding sequence in GenBank. The expression output of rNspA was approximately 40.1% of the total bacterial proteins. The extracted rNspA showed a single protein band in gel after SDS-PAGE. The immunodiffusion titer of rabbit antiserum against rNspA was 1∶4. The rNspA antiserum was able to recognize rNspA. Conclusion The constructed prokaryotic expression system enable express rNspA with high efficiency, and can be used as a candidate antigen for developing genetic engineering vaccine.[Key words] Neisseria gonorrhoeae; NspA Gene; Clone/recombinant expression; Immunogenicity/identification淋病奈瑟菌感染引起的淋病发病率目前居于我国各类性传播疾病首位[1]。

淋病奈瑟菌临床菌株外膜蛋白PIA基因序列分析及原核表达系统的构建

【文章编号】１０００—４７１８Ｃ２００７）１１—２２６２—０３淋病奈瑟菌临床菌株外膜蛋白ＰＩＡ基因序列分析及原核表达系统的构建孙爱华１，宋春涵２，吴森林１，毛亚飞３，周海鸥１，严杰”（１浙江医学高等专科学校，浙江杭州３１００５３；２金华职业技术学院医学院．浙江金华３２１０２７；３浙江大学医学院微生物和寄生虫学教研室，浙江杭州３１００３１）［摘要】目的：分析本地区淋病奈瑟苗临床菌株外膜蛋白ＰＩＡ基因核苷酸及氨基酸序列，构建ＰＩＡ基因的原榜表达系统。

方法：采用高保真ＰＣＲ扩增９株淋病奈瑟菌全长ＰＩＡ基因序列，Ｔ—Ａ克隆测序后与ＧｅｎＢａｎｋ公布的序列进行同源性比较。

构建ＰＩＡ原核表达系统。

采用不同浓度ＩＰＴＧ诱导重组目的蛋白ｒＰＩＡ表达，１０％ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和Ｂｉｏ—Ｂａｄ凝胶图像分析系统检测ｒＰＩＡ表达情况。

采用Ｎｉ—ＮＴＡ亲和层析法提纯ｒＰＩＡ，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ检测提纯效果。

结果：与报道的ＰＩＡ基因序列（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ：Ｌ１９９６２）比较，９株淋病奈瑟菌核苷酸和氨基酸序列相似性分别高达９９．６％一１００％和９９．１％一１００％．均属于ＩＡ６血清型。

ｒＰＩＡ表达量可占细菌总蛋白量的５０．１％，提纯后仅显示单一的目的蛋白条带。

结论：ＩＡ６为本地区淋病奈瑟菌优势血清型，该基因序列相当保守。

所构建的ＰＩＡ基因原核表达系统能高效表达ｒＰＩＡ，为今后研制淋病奈瑟菌血清学检测试剂盒及疫苗研制奠定了基础。

［关键词］奈瑟球菌．淋病；基因，ＰＩＡ；序列分析；原核表达【中圈分类号】Ｒ３６３【文献标识码］＾ＳｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＰＩＡｇｅｎｅｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＳＵＮＡｉ—ｈｕａｌ，ＳＯＮＧＣｈｕｎ—ｈａｎ２，ＷＵＳｅｎ—ｌｉｎｌ，ＭＡ０Ｙａ—ｆ；ｉ３，ＺＨＯＵＨａｉ—ｏｎｌ，ＹＡＮＪｉｅ’（。

淋球菌孔蛋白免疫功能的研究进展

是补体替代途径产生的Ｃｂ的降解产物．积于淋３沉
球菌表面，蛋白和Ｈ因子（３孔Ｃｂ灭活促进因子）结合可促进Ｉ因子（３Ｃｂ灭活因子）解Ｃｂ使更多水３。的ｉ３Ｃｂ沉积于淋球菌表面．这样孔蛋白、３、ｉｂ菌Ｃ毛共同与Ｃ３结合，Ｒ大大提高了淋球菌的黏附力。
以往认为不透明蛋白（ｐ）淋球菌入侵中起Ｏａ在主要作用。现发现孔蛋白能从细菌外膜易位至宿主细胞膜，人们推测这与淋球菌入侵有关。ｖｎＰｔｎａｕｔｅ等闭表达ＰＡ的Ｏａ突变株在低磷酸盐的条件下用１ｐ不依赖Ｏａ入侵常氏上皮细胞．ｐ并用基因敲除的方法证实ＰＡ介导的入侵过程中无淋球菌外膜蛋白１１（ｍｐ的参与。由此提出了淋球菌孔蛋白介导的１Ｒ）１入侵的新途径：低磷酸盐依赖入侵途径（ｗ— １ｏｐｏｐａｅｄｐｎｅｔｎａｉｎＬＤ）Ｋｉｅｅｎ等ｈｓｈｔ— ｅｅｄｎｉｖｓ，ＰＩ。ｔｌｗｉｏｈ
２２与入侵．
等位基因（ｏＩｐｒＩｑ的一种。ｐＡ和ｏＢＢ￣Ｂ）
孔蛋白的天然结构为三聚体的Ｂ桶状结构（ — ａｒ１，ｐｂｒ）其多肽链ｌ跨越淋球菌细胞膜脂质ｅ６次
双层，在膜外形成８个膜外襻（ｏ）ｌｐ的长度和１ｐ。术学院学报ＪＵＮＬＯＵＹＮＯＡＮＬＴＣＮＣＬＣＬＥＥＯＲＡＦＹＥＡＧＶＣ￣ＯＡＥＨＩＡＯＬＧ

抗非洲猪瘟病毒NP419L蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用

畜牧兽医学报 2023,54(6):2509-2520A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.06.029开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):抗非洲猪瘟病毒N P 419L 蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用王映,朱家宏,赵加凯,纪品品,陈旭,张路,刘宝元,孙亚妮*,赵钦*(西北农林科技大学动物医学院,农业农村部国家动物疫病数据中心杨凌观测实验点,杨凌712100)摘要:非洲猪瘟(A f r i c a n s w i n e f e v e r ,A S F )是猪的一种高度传染性疾病,严重威胁全球养猪业的发展㊂本研究旨在筛选抗非洲猪瘟病毒(A S F v i r u s ,A S F V )N P 419L 蛋白的纳米抗体并对其在A S F 抗体检测中的应用进行初步评价㊂大肠杆菌表达和N i -N T A 亲和层析纯化等技术表达纯化重组N P 419L 蛋白;将纯化的重组蛋白免疫双峰驼,5次免疫采集外周血淋巴细胞提取总R N A ,经反转录㊁巢式P C R ㊁酶切㊁连接和电转化等构建抗N P 419L 蛋白的噬菌体展示文库;利用噬菌体展示筛淘技术,经三轮筛淘获得抗N P 419L 蛋白的纳米抗体;构建纳米抗体与辣根过氧化物酶(H R P )融合蛋白的真核表达载体,转染H E K 293T 细胞,E L I S A 和间接免疫荧光(I F A )等鉴定融合蛋白的分泌表达及其与N P 419L 蛋白的结合;竞争E L I S A 初步评价获得的纳米抗体与H R P 融合蛋白在A S F 抗体检测中的应用㊂结果显示,成功制备了纯度较高的预期大小为48k u 的重组N P 419L 蛋白;构建获得了阳性率为89.5%,库容量为6ˑ108的噬菌体展示文库;筛淘获得了6株抗N P 419L 蛋白的纳米抗体;分泌表达了该6株纳米抗体与H R P 的融合蛋白,E L I S A 检测发现该6株融合蛋白可特异性结合重组N P 419L 蛋白,I F A 检测发现1株融合蛋白与真核表达的N P 419L 蛋白结合,该融合蛋白可作为探针应用于A S F 抗体的检测㊂本研究成功筛选出6株抗A S F V N P 419L 蛋白的特异性纳米抗体,并对其进行了结合蛋白特性的鉴定和抗体检测初步应用的评价,为后续A S F 诊断技术的研发和N P 419L 蛋白功能研究奠定了基础㊂关键词:非洲猪瘟病毒;N P 419L 蛋白;纳米抗体中图分类号:S 852.659.1 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)06-2509-12收稿日期:2022-11-04基金项目:国家自然科学基金面上项目(32273041);中央级公益性科研院所基本科研业务费院级统筹项目作者简介:王映(1996-),女,山东烟台人,硕士生,主要从事动物疫病诊断和防治技术研究,E -m a i l :1076396765@q q.c o m *通信作者:孙亚妮,主要从事重大动物疫病病原感染和致病机制研究,E -m a i l :s u n ya n i @n w s u a f .e d u .c n ;赵钦,主要从事动物重大疫病㊁分子病毒与细胞免疫生物学研究,E -m a i l :qi n z h a o _2004@n w s u a f .e d u .c n S c r e e n i n g a n d I d e n t i f i c a t i o n o f N a n o b o d i e s a ga i n s t N P 419L P r o t e i n o f A f r i c a n S w i n e F e v e r V i r u s a n d I t s P r e l i m i n a r y A p p l i c a t i o n o f A n t ib o d y De t e c t i o n WA N G Y i n g ,Z HU J i a h o n g ,Z H A O J i a k a i ,J I P i n p i n ,C H E N X u ,Z H A N G L u ,L I U B a o yu a n ,S U N Y a n i *,Z H A O Q i n*(Y a n g l i n g O b s e r v i n g a n d E x p e r i m e n t a l S t a t i o n o f N a t i o n a l D a t a C e n t e r o f An i m a l H e a l t h ,C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y ,Y a n g l i n g 712100,C h i n a )A b s t r a c t :A f r i c a n s w i n e f e v e r (A S F )i s a h i g h l y i n f e c t i o u s d i s e a s e o f p i g s ,w h i c h s e r i o u s l y t h r e a t -e n s t h e d e v e l o p m e n t o f t h e g l o b a l p i g i n d u s t r y .T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y i s t o s c r e e n s p e c i f i c n a n o b o d i e s a g a i n s t t h e N P 419L p r o t e i n o f A S F v i r u s (A S F V )a n d e v a l u a t e i t s a p pl i c a t i o n o f a n t i -A S F V a n t i b o d y d e t e c t i o n .W e p r e p a r e d t h e r e c o m b i n a n t N P 419L p r o t e i n b y E .c o l i e x pr e s s i o n s y s t e m a n d N i -N T A a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y pu r i f i c a t i o n .T h e p u r i f i e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n w a s u s e d t o i mm u n i z e t h e B a c t r i a n c a m e l s .A f t e r t h e f i f t h i mm u n i z a t i o n ,p e r i p h e r a l b l o o d l y m ph o -畜牧兽医学报54卷c y t e s w e r e c o l l e c t e d a n d t o t a l R N A w a s e x t r a c t e d.A p h a g e d i s p l a y l i b r a r y a g a i n s t N P419L p r o-t e i n w a s c o n s t r u c t e d b y n e s t e d P C R,e n z y m e d i g e s t i o n,l i g a t i o n a n d e l e c t r o p o r a t i o n.N a n o b o d i e s a g a i n s t N P419L w e r e o b t a i n e d t h r o u g h t h r e e r o u n d s o f s c r e e n i n g u s i n g p h a g e d i s p l a y s c r e e n i n g t e c h n o l o g y.T h e e u k a r y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r s o f n a n o b o d i e s f u s e d w i t h h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e (H R P)p r o t e i n s w e r e c o n s t r u c t e d a n d t r a n s f e c t e d i n t o H E K293T c e l l s.T h e s e c r e t o r y e x p r e s s i o n o f t h e f u s i o n p r o t e i n a n d i t s b i n d i n g t o N P419L p r o t e i n w e r e i d e n t i f i e d b y E L I S A a n d i n d i r e c t i m-m u n o f l u o r e s c e n c e(I F A),a n d p r e l i m i n a r y e v a l u a t i o n o f t h e o b t a i n e d n a n o b o d y f u s e d w i t h H R P p r o t e i n s i n A S F d e t e c t i o n u s i n g c o m p e t i t i v e E L I S A.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e N P419L r e c o m-b i n a n t p r o t e i n w i t h t h e e x p e c t e d s i z e o f48k u w a s s u c c e s s f u l l y p r e p a r e d w i t h h i g h p u r i t y;a p h a g e d i s p l a y l i b r a r y w i t h a p o s i t i v e r a t e o f89.5%a n d a l i b r a r y c a p a c i t y o f6ˑ108w a s c o n s t r u c t e d;s i x s t r a i n s o f a n t i-N P419L p r o t e i n n a n o b o d i e s w e r e o b t a i n e d b y s c r e e n i n g;t h e f u s i o n p r o t e i n s o f t h e s e s i x n a n o b o d i e s w i t h H R P w e r e s e c r e t i v e l y e x p r e s s e d,t h e r e s u l t s o f E L I S A s h o w e d t h a t t h e s i x f u s i o n p r o t e i n s s p e c i f i c a l l y b i n d t o t h e r e c o m b i n a n t N P419L p r o t e i n,o n e f u s i o n p r o t e i n w a s f o u n d t o b i n d t o N P419L p r o t e i n e x p r e s s e d w i t h e u k a r y o t i c s y s t e m b y I F A,a n d t h i s f u s i o n p r o-t e i n c a n b e u s e d a s a p r o b e f o r t h e d e t e c t i o n o f A S F V a n t i b o d i e s.I n t h e s t u d y,s i x n a n o b o d i e s a-g a i n s t A S F V N P419L p r o t e i n w e r e s u c c e s s f u l l y s c r e e n e d.T h e p r e l i m i n a r y c h a r a c t e r i z a t i o n o f i t s b i n d i n g p r o t e i n a n d i t s a p p l i c a t i o n o f a n t i b o d y d e t e c t i o n w e r e a l s o c a r r i e d o u t,w h i c h p r o v i d e d t h e b a s i s f o r t h e s u b s e q u e n t d e v e l o p m e n t o f A S F d i a g n o s t i c t e c h n o l o g y a n d t h e f u n c t i o n a l s t u d y o f N P419L p r o t e i n.K e y w o r d s:A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s;N P419L p r o t e i n;n a n o b o d y*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r s:S U N Y a n i,E-m a i l:s u n y a n i@n w s u a f.e d u.c n;Z H A O Q i n,E-m a i l: q i n z h a o_2004@n w s u a f.e d u.c n非洲猪瘟(A f r i c a n s w i n e f e v e r,A S F)是由非洲猪瘟病毒(A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s,A S F V)感染家猪和野猪引起的一种急性㊁出血性㊁高度接触性传染病,被世界动物卫生组织(WO A H)列为必须报告的动物疫病[1]㊂家猪感染A S F V强毒株可引起严重的出血性疾病,致死率高达100%[2]㊂2018年, A S F传入我国并迅速扩散[3],给我国的养猪业造成了巨大的经济损失㊂由于A S F V基因类型多,免疫逃避机制复杂多样,目前还没有开发出针对该病毒的疫苗和有效的防治药物,只能依靠隔离和扑杀等严格的生物安全防控方式来控制疫情[4]㊂A S F V属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属,是一种大型双链D N A病毒,病毒基因组为170~ 190k b,可编码150多种蛋白质,包括多种结构蛋白及参与D N A复制和修复的各种酶等[5-6]㊂迄今为止,仅有60多种病毒蛋白的生物学功能被报道,严重阻碍该病疫苗和防治药物的研发㊂A S F V主要感染猪巨噬细胞,这些细胞具有氧化性并对病毒基因组造成持续损害[7]㊂在众多参与病毒复制和修复的酶中,有一类酶可修复宿主因子对A S F V基因组的损伤[8],统称为碱基切除修复系统(b a s e-e x c i s i o n r e p a i r,B E R),包括A P核酸内切酶(A S F V A P)[9-10]㊁D N A修复聚合酶(A S F V P o l X)[11]和D N A连接酶(A S F V L I G)[12]㊂其中,A S F V L I G (N P419L)是修复系统中唯一的D N A连接酶,它在A S F V的D N A修复过程中催化D N A加入反应,将D N A链上的缺口连接起来,并在病毒基因组的诱变中起重要作用[13]㊂有研究认为抑制其活性可能会破坏A S F V的D N A修复过程并损害基因组稳定性[13],因此深入研究N P419L蛋白的功能有助于了解A S F V复制的机制㊂此外,目前多数使用p30㊁p72㊁p54和p p62等A S F V的结构蛋白作为靶抗原检测A S F的抗体[14-15],而N P419L蛋白能否做为抗体检测的靶抗原仍未见相关报道㊂因此,为了能够深入研究N P419L蛋白的生物学功能和免疫学特性,需要制备抗该蛋白的抗体㊂骆驼科动物体内存在一种特殊的抗体,天然缺失轻链和重链第一恒定区,被称为重链抗体(h e a v y c h a i n a n t i b o d i e s,H c A b s)[16]㊂与传统抗体不同, H c A b仅通过重链可变区(v a r i a b l e d o m a i n s o f01526期王映等:抗非洲猪瘟病毒N P419L蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用h e a v y c h a i n o f H c A b,V HH)识别抗原㊂V HH分子量仅有15k u左右,是目前已知最小完整的功能抗原结合片段,被称为纳米抗体(n a n o b o d y, N b)[17]㊂与传统抗体相比,纳米抗体具有分子量小㊁稳定性高㊁免疫原性低㊁特异性强等优点,在病毒性疾病的诊断和治疗方面有广阔的开发前景[18]㊂目前纳米抗体已被广泛的应用于人和动物重大疫病创新型诊断试剂和防治药物的研发中,例如新型冠状病毒肺炎[19]㊁中东呼吸综合征[20]㊁口蹄疫[21]和高致病性禽流感[22-23]等㊂抗A S F V的p30和p54等蛋白的纳米抗体也已有应用于A S F抗体检测中的报道,并表现出了较高的敏感性和特异性[24-25]㊂此外,该两个蛋白纳米抗体的制备也为A S F V感染和复制机制的研究提供了有效的材料支撑㊂为了能够筛选制备抗A S F V N P419L蛋白的纳米抗体,本研究利用原核表达系统表达纯化了该蛋白,免疫双峰驼并采集外周血淋巴细胞,通过噬菌体展示技术筛选获得了6株抗N P419L蛋白的纳米抗体,构建并表达了纳米抗体与辣根过氧化物酶(h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e,H R P)融合蛋白,并对其进行了初步的鉴定和抗体检测应用的评价㊂本研究为后续A S F V N P419L蛋白功能的深入研究以及基于纳米抗体的A S F诊断技术的研发提供了一种新的策略㊂1材料与方法1.1材料1.1.1质粒㊁菌株和细胞原核表达载体p E T-28a(+)㊁噬菌体展示载体p M E C S和真核表达载体p C A G E N等商品化载体均为本实验室购买并保存;真核表达载体p C M V-N1-H R P以商品化p E G F P-N1载体为骨架进行基因改造[26],该载体引入了分泌信号肽㊁HA㊁H R P和H i s标签;大肠杆菌感受态细胞T r a n s5α和B L21(D E3)购自北京全式金生物技术公司;E.c o l i T G1感受态细胞购自B e y o t i m e公司;辅助噬菌体M13K O7购自N E B公司;H E K293 T细胞为本实验室保存㊂1.1.2主要试剂T4D N A连接酶和限制性核酸内切酶B a m HⅠ㊁X h oⅠ㊁P s tⅠ㊁N o tⅠ等购自N E B公司;R N A提取试剂盒(R N e a s y P l u s M i n i K i t)购自Q I A G E N公司,R T-P C R反转录试剂盒(T r a n s S c r i p t R e v e r s e T r a n s c r i p t a s e)㊁鼠抗H A抗体㊁鼠抗H i s抗体㊁鼠抗F L A G抗体㊁H R P 标记的羊抗鼠I g G和羊抗兔I g G均购自北京全式金生物技术公司;兔抗骆驼多克隆抗体由实验室制备保存[27];转染试剂P E I购自P o l y s c i e n c e s公司;无机试剂均为国产分析纯产品;临床34份阳性和47份阴性A S F抗体猪血清为实验室收集并保存,上述血清均通过非洲猪瘟病毒E L I S A抗体检测试剂盒(北京金诺百泰生物技术有限公司)鉴定㊂1.2方法1.2.1 A S F V N P419L蛋白的原核表达与纯化A S F V编码N P419L蛋白的基因序列(G e nB a n k: N C_001659.2)由G E N E W I Z公司合成,连接至p U C56载体㊂由G E N E W I Z公司合成扩增该基因的引物(表1)㊂以合成的N P419L基因为模板,A S-F V-N P419L-F和A S F V-N P419L-R为引物,PC R 扩增目的基因片段㊂限制性内切酶B a m HⅠ和X h oⅠ酶切P C R产物和p E T-28a(+)表达载体, T4连接酶将目的基因连入载体中㊂测序鉴定正确后得到重组表达质粒p E T-28a-N P419L㊂阳性重组质粒转化至B L21(D E3)感受态细胞,表达重组蛋白㊂阳性菌液培养至O D600n m值为0.6~0.8,加入终浓度为1mm o l㊃L-1的I P T G, 37ħ诱导表达8h后收集菌体㊂以180W功率超声3s,暂停3s,超声40m i n裂解菌体后分别收集上清和沉淀,参考N i-N T A使用说明书纯化目的蛋白㊂S D S-P A G E和W e s t e r n b l o t分析目的蛋白的表达㊁纯化和抗原性㊂1.2.2动物免疫及血清效价测定 1m L纯化的重组N P419L蛋白(2m g㊃m L-1)与等体积佐剂乳化,颈部皮下多点免疫4周龄雌性双峰驼,共免疫5次㊂每两周免疫一次,第一次采用完全弗氏佐剂进行乳化,后四次采用不完全弗氏佐剂㊂第五次免疫一周后采集免疫骆驼的颈静脉血,分离血清和外周血淋巴细胞㊂参考刘红亮等描述的方法[28], E L I S A检测骆驼血清中抗N P419L蛋白的抗体效价㊂1.2.3噬菌体展示文库的构建参考R N A提取试剂盒说明书提取外周血淋巴细胞总R N A㊂以提取的R N A为模板,O l i g o(d T)20为反转录引物,参考T r a n s S c r i p t Ⅱ反转录试剂盒的说明书,合成c D N A㊂以c D N A为模板,参考刘红亮等描述的方法[28],巢式P C R扩增V HH基因片段㊂第一轮P C R以C A L L001㊁C A L L002为引物(表1),P C R产物经12g㊃L-1的琼脂糖凝胶电泳分离鉴定,回收大小约700b p的条带;以第一轮P C R回收产物为模1152畜牧兽医学报54卷表1 目的基因扩增引物T a b l e 1 P r i m e r s f o r a m p l i f i c a t i o n o f t a r g e t ge n e 引物名称P r i m e r n a m e引物序列(5'ң3')P r i m e r s e qu e n c e 酶切位点R e s t r i c t i o n s i t e sA S F V -N P 419L -FC G C G G A T C C A T G C T A A A T C A A T T T CB a m H ⅠA S F V -N P 419L -RC C G C T C G A G A A T G A T T T C T A A A A C AX h o Ⅰp C A G E N -N P 419L -F C C G A A T T C A T G C T A A A T C A A T T T C C T G G CE c o R I pC A G E N -N P 419L -R C G G C G G C C G C C T A A G C G T A G T C T G G G A C G T C G TA T G G G T A A A T G A T T T C T A A A A C AN o t IC A L L 001G T C C T G G C T G C T C T T C T A C A A G GC A L L 002G G T A C G T G C T G T T G A A C T G T T C C V HH -F C A G G T G C A G C T G C A G G A G T C T G G G G G A G RP s t ⅠV HH -RC T A G T G C G G C C G C T G A G G A G A C G G T G A C C T G G G TN o t Ⅰ下划线为酶切位点T h e u n d e r l i n e i s t h e r e s t r i c t i o n s i t e板,VHH -F ㊁V HH -R 为上下游引物(表1)进行第二轮P C R ,P C R 产物经15g ㊃L -1的琼脂糖凝胶电泳分离鉴定,回收大小约为400b p 的条带㊂限制性内切酶P s t Ⅰ和N o t Ⅰ对第二轮P C R 产物和p M E C S 噬菌体展示载体进行双酶切,T 4D N A 连接酶将目的基因连入载体㊂连接产物电转化至大肠杆菌T G 1感受态细胞,涂布于含葡萄糖且氨苄抗性的L B (L B /A m p-G L U )固体平板,37ħ培养6~8h ,收集菌苔,即为构建的抗N P 419L 的噬菌体展示文库㊂取20μL 培养物进行10倍比稀释,取10-3至10-6稀释度的样品涂布于L B /A m p-G L U 固体平板,37ħ培养8h ,计数平板上的菌落㊂次日,随机挑取48个单克隆加入1m L L B /A m p-G L U 液体培养基,37ħ振荡培养4~6h ,引物V HH -F 和V HH -R 进行P C R 鉴定,测定文库的阳性率,计算构建的纳米抗体库的库容㊂阳性克隆送至西安擎科生物技术有限公司,测序获得序列后分析文库的多样性㊂1.2.4 A S F V -N P 419L 特异性纳米抗体的淘选构建的噬菌体文库接种于含葡萄糖且氨苄抗性的Y T (2ˑY T /A m p-G L U )液体培养基,培养至O D 600n m 值为0.6~0.8,加入M 13K O 7辅助噬菌体,静置离心,加入氨苄和卡那霉素双抗性Y T (2ˑY T /A m p-K a n )液体培养基㊂过夜培养后收集上清,加入预冷的P E G /N a C l ,离心收集沉淀并用P B S 重悬,再次离心后收集上清即为救援的重组噬菌体㊂重组噬菌体进行10的倍比稀释后浸染对数生长期的T G 1,涂布于L B /A m p -G L U 固体平板,计算重组噬菌体滴度㊂原核表达纯化的重组N P 419L 蛋白包被E L I S A 板,加入救援的重组噬菌体,37ħ孵育2h ,加入新鲜配制的三乙胺溶液(0.1m o l ㊃L -1)洗脱结合的噬菌体,加入等体积的T r i s -H C l (1m o l ㊃L -1,pH=7.4)中和,即为第一轮洗脱液㊂参考上述救援噬菌体滴度的测定方法,测定第一轮洗脱液中的噬菌体滴度㊂将洗脱液浸染对数生长期的T G 1,进行第二轮的救援和筛淘㊂参考上述方法,对构建的噬菌体文库共进行三轮的救援和筛淘㊂第三轮淘选后测定滴度的平板上随机挑取96个单克隆,接种于L B /A m p-G L U 培养基,37ħ培养至对数生长期,加入终浓度为1mm o l ㊃L -1的I P T G 诱导表达㊂离心收集菌体沉淀,冻融3次,上清即为包含纳米抗体的粗提物㊂E L I S A 鉴定特异结合N P 419L 蛋白的粗提物㊂原核表达纯化的重组N P 419L 蛋白包被E L I S A 板,2.5%脱脂奶粉封闭;加入上述制备的粗提物,37ħ孵育1h ;加入抗H A 单抗,37ħ孵育1h ;加入H R P 标记的羊抗鼠I gG 抗体,37ħ孵育1h ,加入T M B 室温显色15m i n,用3m o l ㊃L-1H 2S O 4终止反应后,读取O D 450n m值㊂以包被的血清4型禽腺病毒(f o w l a d e n o v i r u s,F A d V )的H e x o n 蛋白为阴性对照㊂以N P 419L 蛋白为包被抗原的O D 450n m 值大于阴性对照的3倍以上,初步鉴定为特异性结合靶蛋白的粗提物㊂阳性粗提物对应的单克隆菌液送至西安擎科生物技术有限公司测序,获得的序列用M e g A l i gn 软件比对,纳米抗体高变区(C D R 3区)的氨基酸序列相似性大于95%的定义为同一株纳米抗体㊂1.2.5 纳米抗体与H R P 融合蛋白的表达以21526期王映等:抗非洲猪瘟病毒N P419L蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用上述获得的包含编码阳性纳米抗体基因序列的单克隆菌液为模板,VHH-F和V HH-R为引物扩增基因序列,P s tⅠ和N o tⅠ将P C R产物和p C MV-N1-H R P载体进行双酶切,酶切产物用T4D N A连接至载体,转化至T r a n s5α感受态细胞,测序鉴定㊂阳性质粒利用P E I转染试剂转染至H E K293T细胞,培养48h,收取细胞上清即为表达制备的抗N P419L纳米抗体与H R P融合蛋白㊂间接免疫荧光试验(i n d i r e c t i mm u n o f l u o r e s-c e n c e a s s a y,I F A)鉴定融合蛋白在H E K293T细胞内的表达㊂4%多聚甲醛溶液固定转染细胞,1% B S A溶液封闭;依次孵育抗H i s单抗和F I T C标记的羊抗鼠I g G;D A P I染细胞核后,倒置荧光显微镜观察㊂E L I S A鉴定融合蛋白被分泌表达至细胞上清并具有H R P的反应活性㊂将收集的上清直接包被E L I S A板,2.5%脱脂奶粉封闭1h,直接加入TM B 显色液避光显色,加入3m o l㊃L-1H2S O4终止反应,读取O D450n m值㊂与阴性对照相比,鉴定上清中是否含有纳米抗体与H R P融合蛋白㊂1.2.6融合蛋白与原核表达N P419L蛋白结合的鉴定 E L I S A鉴定表达制备的纳米抗体与H R P 融合蛋白与原核表达的重组N P419L蛋白的结合㊂重组N P419L蛋白包被E L I S A酶标板,相同载体和系统表达制备的A S F V-p30和F A d V-H e x o n蛋白为无关蛋白对照,2.5%脱脂奶粉封闭;分别加入收集的上清(包含抗N P419L纳米抗体与H R P融合蛋白),室温孵育后加入T M B显色液,避光显色15 m i n后加入3m o l㊃L-1H2S O4终止反应,读取O D450n m值㊂E L I S A测定上清中不同纳米抗体与H R P融合蛋白与N P419L蛋白的结合效价㊂收集的转染细胞上清进行10的倍比(1ʒ10㊁1ʒ102㊁1ʒ103㊁1ʒ104)稀释后加入E L I S A板中,然后显色㊁终止反应,根据读取的O D450n m值确定不同融合蛋白的结合效价㊂1.2.7融合蛋白与真核表达N P419L蛋白的结合构建带有F L A G标签的N P419L蛋白的真核表达载体㊂以p E T-28a-N P419L质粒为模板,引物为p C A G E N-N P419L-F和p C A G E N-N P419L-R (表1),P C R扩增靶基因㊂E c o RⅠ和N o tⅠ将P C R 产物和p C A G E N真核表达载体分别双酶切,T4 D N A连接酶将靶基因连接至p C A G E N载体,测序鉴定㊂将阳性质粒转染至H E K293T细胞,培养24h,4%多聚甲醛固定细胞以及1%B S A溶液封闭;依次孵育抗F L A G单抗和F I T C标记的羊抗鼠I g G,D A P I染核后,倒置荧光显微镜下观察重组N P419L蛋白的表达㊂确定蛋白表达后,I F A鉴定表达制备的纳米抗体与H R P融合蛋白结合真核表达的N P419L蛋白㊂质粒转染的细胞固定封闭后,加入纳米抗体与H R P融合蛋白室温孵育1h;依次孵育抗H i s单抗和F I T C标记的羊抗鼠I g G,D A P I 染核后倒置荧光显微镜观测结果㊂1.2.8融合蛋白在A S F抗体检测中的初步应用竞争E L I S A初步评价制备的纳米抗体与H R P 融合蛋白在A S F抗体检测中的应用㊂重组N P419L蛋白(400n g㊃孔-1)包被E L I S A板,2.5%脱脂奶粉封闭;制备的纳米抗体与H R P融合蛋白分别与A S F抗体阳性(34份)和阴性(47份)猪血清混匀后,加入E L I S A板中,37ħ孵育1h;洗板后每孔加入T M B显色液,避光显色15m i n后加入3m o l㊃L-1H2S O4终止反应,读取O D450n m值㊂比较分析阳性和阴性血清的O D450n m值,初步评价筛选获得的纳米抗体在A S F抗体检测中的应用㊂2结果2.1A S F V N P419L重组蛋白的原核表达、纯化及鉴定构建的A S F V N P419L蛋白原核表达质粒转化至B L21(D E3),经I P T G诱导表达后,S D S-P A G E 结果显示,成功获得预期大小为48k u的重组N P419L蛋白(图1A);菌体超声裂解后,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在(图1A);N i-N T A亲和层析纯化获得了纯度较高的目的蛋白(图1A)㊂W e s t e r n b l o t结果显示,表达制备的N P419L重组蛋白与A S F阳性猪血清具有良好的反应性,说明原核表达的重组N P419L蛋白具有良好的抗原性(图1B)㊂2.2免疫骆驼抗N P419L蛋白抗体效价的测定5次免疫后,采集免疫骆驼的血清,E L I S A结果显示,免疫骆驼中抗N P419L蛋白特异性抗体效价可达1ʒ128000(图2),表明制备的重组N P419L蛋白具有良好的免疫原性,可刺激骆驼产生较好的免疫应答反应㊂2.3抗A S F V N P419L蛋白纳米抗体噬菌体展示文库的构建5免后1周采集免疫骆驼的外周血并提取总3152畜牧兽医学报54卷M.蛋白质相对分子质量标准;1.p E T -28a 空载诱导表达菌体;2.未诱导表达菌体;3.诱导表达菌体;4.菌体裂解后沉淀;5.菌体裂解后上清;6.纯化的重组蛋白M.P r o t e i n m a r k e r ;1.N e ga t i v eb ac t e r i a w i t h i nd u c t i o n ;2.P o s i t i ve b a c t e r i a w i t h o u t i n d u c t i o n ;3.P o s i t i v e b a c t e r i a w i t h i n -d u c t i o n ;4.P e l l e t s af t e r s o n i c a t i o n ;5.S u pe r n a t a n t af t e r s o n i c a t i o n ;6.P u r i f i e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n 图1 S D S -P A G E (A )和W e s t e r n b l o t (B )鉴定原核表达纯化的A S F V N P 419L 重组蛋白F i g .1 I d e n t i f i c a t i o n o f t h e r e c o m b i n a n t A S F V N P 419L p r o t e i n b y S D S -P AG E (A )a n d W e s t e r n b l o t a n a l ys i s (B)图2 E L I S A 检测免疫骆驼中抗N P 419L 抗体的效价F i g .2 T i t e r s o f a n t i -N P 419L a n t i b o d yt i t e r i n t h e i m m u n i z e d b y de t e c t i o n of E L I S A R N A ,以R N A 为模板,经巢式R T -P C R 成功扩增得到了编码V HH 的基因片段,其预期大小为400b p(图3A )㊂经酶切,连接和电转化后,成功构建了库容量为6ˑ108的抗N P 419L 蛋白的V HH 噬菌体展示文库㊂经菌液P C R 鉴定,文库阳性率约为89.5%(图3B )㊂阳性单克隆测序结果表明插入的V HH 基因没有重复序列(图3C ),说明构建的文库多样性较好㊂2.4 抗A S F V N P 419L 蛋白特异性纳米抗体的淘选以表达制备的N P 419L 重组蛋白为包被抗原,三轮噬菌体展示淘选后,结果显示与对照相比,抗N P 419L 蛋白的特异性噬菌体比例逐渐升高,由0.7升至85(表2),表明抗N P 419L 特异性噬菌体得到有效富集㊂将第三轮淘选的噬菌体进行滴度测定,结果显示与阴性对照组相比,抗N P 419L 的噬菌体得到明显富集(图4A )㊂第三轮淘选后测定滴度的平板上随机挑取96个单克隆,经I P T G 诱导制备可溶性的纳米抗体粗提物㊂利用制备的粗提物进行E L I S A ,结果显示制备的96个粗提物中有23个可能与N P 419L 蛋白发生特异性结合(图4B )㊂将阳性粗提物对应的单克隆进行测序,根据获得的23个V HH C D R 3的氨基酸序列比对结果,成功筛淘获得6株抗N P 419L 蛋白的特异性纳米抗体,分别命名为A S F V -N P 419L -N b 18㊁-20㊁-34㊁-46㊁-49和-89,且6株纳米抗体均在F R 2区存在典型的亲水性氨基酸替换(图5)㊂2.5 抗A S F V N P 419L 蛋白与H R P 融合蛋白的表达获得的抗N P 419L 纳米抗体的基因序列连接至pC MV -N 1-H R P 载体,成功构建了纳米抗体与H R P 融合蛋白的真核表达载体㊂阳性质粒转染H E K 293T 细胞48h 后,I F A 结果显示抗N P 419L 纳米抗体与H R P 融合蛋白成功在细胞中表达(图6A )㊂利用收集的上清直接包被E L I S A 板显色,结果显示,融合蛋白成功分泌至细胞培养上清中,具有H R P 与其底物T M B 反应的特性(图6B )㊂该6株融合蛋白命名为A S F V -N P 419L -N b 18-H R P ㊁-20-H R P ㊁-34-H R P ㊁-46-H R P ㊁-49-H R P 和-89-H R P ㊂2.6 6株纳米抗体与H R P 融合蛋白与A S F V N P 419L 蛋白的结合原核表达制备的N P 419L 蛋白为包被抗原,收集的6株纳米抗体与H R P 融合蛋白上清为孵育的一抗,直接E L I S A 结果显示,与无关抗原相比6株融合蛋白均可特异性结合原核表达制备的A S F V41526期王映等:抗非洲猪瘟病毒N P 419L 蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用A.巢式P C R 扩增V HH 基因(M.D N A 相对分子质量标准;1.第一轮P C R 扩增;2.第二轮P C R 扩增);B .P C R 鉴定V HH 文库阳性率;C .阳性克隆序列A.A m p l i f i c a t i o n o f V HH g e n e b y ne s t e d P C R (M.D N A m a r k e r ;1.T h ef i r s t r o u n d o f P C R ;2.T h e s e c o n d r o u n d o f P C R );B .I d e n t i f i c a t i o n o f V HH l i b r a r y p o s i t i v e r a t e b y P C R ;C .T h e s e q u e n c e s o f t h e p o s i t i v e P C R p r o d u c t s i n t h e l i b r a r y 图3 V H H 噬菌体展示文库的构建F ig .3 C o n s t r u c t i o n o f V H H ph a g e di s p l a y l i b r a r y表2 N P 419L 特异性噬菌体富集情况T a b l e 2 E n r i c h m e n t o f p h a g e p a r t i c l e s c a r r y i n g s pe c if i c a n t i -N P 419L n a n o b o d i e s 淘选轮数R o u n d o f p a n n i n g投入量/(p f u ㊃w e l l -1)I n p u t p h a g e 阳性洗脱量/(p f u ㊃w e l l -1)P o u t p u t 对照洗脱量/(pf u ㊃w e l l -1)N o u t pu t 特异性噬菌体比例P /N 第一轮R o u n d 15.0ˑ10102.1ˑ1063.0ˑ1060.7第二轮R o u n d 25.0ˑ10106.4ˑ1082.2ˑ10729.1第三轮R o u n d 35.0ˑ10101.7ˑ1082.0ˑ10685.0N P 419L 蛋白(图7A )㊂E L I S A 分析6株融合蛋白结合重组N P 419L 蛋白的效价,结果表明A S F V -N P 419L -N b 20-H R P 的结合效价最高,达104;A S F V -N P 419L -N b 89-H R P 的结合效价最低,在1ʒ102稀释时已不能结合;其余4株结合效价为103(图7B)㊂经E c o RⅠ和N o t Ⅰ双酶切鉴定后,琼脂糖凝胶电泳结果显示成功构建了重组N P 419L 蛋白的真核表达质粒(图7C )㊂阳性质粒转染H E K 293T 细胞,利用抗F L A G 单抗进行I F A 检测发现,重组N P 419L 蛋白成功在细胞质中表达(图7D )㊂利用收集的抗N P 419L 蛋白纳米抗体与H R P 融合蛋白为一抗进行I F A 检测,结果发现A S F V -N P 419L -N b 20-H R P 与H E K 293T 细胞中表达的N P 419L 蛋白结合,其余融合蛋白不结合(图7D )㊂2.7 A S F V -N P 419L -N b 20-H R P 融合蛋白在A S F V 抗体检测中的应用A S F V -N P 419L -N b 20-H R P 融合蛋白作为检测探针,竞争E L I S A 检测A S F 抗体阳性和阴性猪血清,结果发现47份阴性血清的O D 450n m 值在1.17~1.35之间㊂34份阳性血清中,32份的5152畜牧兽医学报54卷A.噬菌体滴度;B .间接E L I S A 检测重组纳米抗体与N P 419L 的结合A.P h a g e t i t e r s ;B .D e t e c t i o n t h e r e a c t i v i t y o f r e c o m b i n a n t n a n o b o d i e s w i t h N P 419L p r o t e i n b yi n d i r e c t E L I S A 图4 间接E L I S A 筛选N P 419L 特异性纳米抗体F i g .4 S c r e e n i n g o f N P 419L -s p e c i f i c n a n o b o d i e s b y In d i r e c t E L I SA 图5 N P 419L 特异性纳米抗体氨基酸序列比对F i g .5 A m i n o a c i d s e q u e n c e s a l i g n m e n t o f N P 419L -s pe c if i c n a n o b o d i e s O D 450n m 值在0.21~0.67之间,平均竞争率为73%,统计学分析显示该32份阳性血清显著竞争抑制了A S F V -N P 419L -N b 20-H R P 融合蛋白与N P 419L 蛋白的结合(图8)㊂另外2份阳性血清用该竞争E L I S A 方法未检测出,而商品化试剂盒检测结果为弱阳性㊂上述结果初步表明,制备的A S F V -N P 419L -N b 20-H R P 融合蛋白可以作为A S F 抗体检测的竞争探针,应用于猪血清中A S F 抗体检测竞争E L I S A 试剂盒的开发㊂61526期王映等:抗非洲猪瘟病毒N P 419L蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用A.I F A 鉴定细胞中融合蛋白的表达;B .E L I S A 鉴定融合蛋白分泌至细胞上清中表达A.E x p r e s s i o n o f a n t i -N P 419L n a n o b o d y -H R P f u s i o n p r o t e i n s i n t h e H E K 293T c e l l s b y I F A a n a l y s i s ;B .S e c r e t o r y e x pr e s -s i o n o f a n t i -N P 419L n a n o b o d y -H R P f u s i o n p r o t e i n s i n t h e H E K 293T c e l l s b y E L I S A a n a l y s i s 图6 抗N P 419L 蛋白纳米抗体与H R P 融合蛋白在H E K 293T 细胞中的表达鉴定F i g .6 E x pr e s s i o n o f a n i -N P 419L n a n o b o d i e s f u s e d w i t h H R P i n t h e H E K 293T c e l ls A.融合蛋白特异性结合原核表达的重组N P 419L 蛋白;B .上清中融合蛋白结合N P 419L 蛋白的结合效价;C .重组N P 419L 真核表达载体的酶切鉴定(M.D N A 相对分子质量标准;1.阳性质粒的双酶切鉴定);D.I F A 鉴定融合蛋白结合真核表达的重组N P 419L 蛋白A.S p e c i f i c i t y ;B .A f f i n i t y ;C .E n z y m a t i c d i ge s t i o n of r e c o m b i n a n t p l a s m i d s p C A G E N -N P 419L (M.D N A m a r k e r ;1.E n -z y m a t i c d ig e s t i o n o f p C A G E N -N P 419L );D.D e t e c t i o n th e bi n d i n g o f N b 20t o N P 419L i n H E K -293T c e l l s b y IF A 图7 抗N P 419L 纳米抗体与H R P 融合蛋白结合不同表达形式N P 419L 蛋白的鉴定F i g .7 A c t i v i t y i d e n t i f i c a t i o n o f N P 419L -s pe c if i c n a n o b o d i e s 3 讨论最近有研究发现,我国出现了基因Ⅰ型和低毒力的基因Ⅱ型A S F V 毒株[29-30],该类毒株可导致猪的轻度感染和慢性疾病,加大了早期诊断难度,给我国A S F 的防控带来更多问题和挑战㊂因此,仍需要制备抗A S F V 不同蛋白的抗体并深入研究它们的生物学特性,为该病诊断技术和疫苗的开发提供理论和材料支撑㊂纳米抗体作为第三代基因工程抗体,逐渐成为病原体特性研究及疫病诊断和防治技术研发的有效工具㊂基于A S F 对我国养猪业的危害以及纳米抗体易基因工程改造和体外表达成本低7152畜牧兽医学报54卷***.P<0.001图8竞争E L I S A检测A S F抗体阳性和阴性猪血清F i g.8C o m p e t i t i v e E L I S A f o r d e t e c t i o n o f A S F a n t i b o d y p o s i-t i v e a n d n e g a t i v e s w i n e s e r u m的优势,本研究成功筛选制备了6株抗A S F V N P419L蛋白的纳米抗体,并且初步评价了其中1株纳米抗体在A S F抗体检测中的应用㊂然而,目前针对该病抗体的检测,大多数使用p30㊁p72㊁p54和p p62等A S F V主要的结构蛋白为靶抗原㊂因此, N P419L蛋白与上述蛋白在A S F抗体检测中的差异以及其能否也成为一种理想的检测靶抗原,仍需要后续深入的研究,进而为A S F抗体的检测提供一种新的策略㊂本研究通过抗原表达㊁动物免疫和噬菌体展示筛淘等技术成功筛选了6株抗A S F V N P419L的特异性纳米抗体㊂然而,前期我们制备其它病原(如新城疫和禽流感病毒)和蛋白的纳米抗体,通常能够筛选到20株左右㊂比较整个试验的操作过程,作者发现免疫的抗原以可溶形式存在时,筛选获得的纳米抗体较多㊂本研究中原核表达制备的重组N P419L 蛋白以包涵体的形式存在,该蛋白在透析复性过程中也迅速析出而无法完全复性㊂面对该问题,作者也通过降低诱导表达温度(16ħ)和转速(150r㊃m i n-1)等表达条件,但是重组N P419L蛋白均以包涵体的形式存在㊂因此,为了后续能够筛选更多株的抗N P419L蛋白的纳米抗体,建议后续可以用真核表达系统表达制备可溶形式的N P419L蛋白进行免疫㊂本研究制备的6株纳米抗体通过体外原核表达的重组N P419L蛋白免疫双峰驼获得,需要鉴定该6株纳米抗体能否结合A S F V内源性N P419L蛋白㊂基于此,作者先鉴定了6株纳米抗体与H R P 融合蛋白与真核表达的N P419L蛋白的结合特性,发现仅A S F V-N P419L-N b20-H R P可特异性结合真核表达的N P419L蛋白㊂随后利用该融合蛋白为一抗,I F A和W e s t e r n b l o t检测了A S F V感染P AM细胞后的内源性N P419L蛋白,结果均为阴性,该结果似乎提示该融合蛋白不能结合病毒内源性N P419L蛋白㊂然而,该融合蛋白可作为竞争探针有效检测猪血清中的A S F抗体,提示该纳米抗体识别的表位在A S F V感染猪后可刺激机体产生抗体㊂因此,作者推测该融合蛋白不能结合内源性N P419L蛋白可能是由于融合蛋白亲和力低或上清中含量低㊂总之,后续仍需对该株纳米抗体进行免疫学特性研究,验证其作为A S F V N P419L蛋白功能研究工具的可行性㊂纳米抗体易被体外基因工程改造,近年来被广泛的应用于疫病诊断和食品检测技术的研发中㊂例如,在疫病诊断领域,利用纳米抗体与H R P融合蛋白为检测探针,目前已成功建立了鸡新城疫[26]㊁猪繁殖与呼吸综合征[31]㊁猪圆环病毒2型[32]等重要动物疫病的抗体竞争E L I S A检测方法[33]㊂此外,也有利用纳米抗体的生物素或胶体金标记,建立了病原的夹心E L I S A和胶体金检测试纸条[34]㊂与基于传统抗体建立的诊断或检测技术相比,该类创新技术展现了生产成本低,耐极端环境和操作简易的特点㊂本研究成功表达制备了6株抗A S F V N P419L 纳米抗体与H R P融合蛋白,其中1株融合蛋白可有效的作为竞争探针检测猪血清中A S F的抗体㊂但是利用该融合蛋白检测的34份A S F抗体阳性猪血清,结果2份为阴性㊂该结果提示该融合蛋白作为探针检测A S F的抗体,可能敏感性较低,后续仍需要优化竞争E L I S A相关条件,提高该检测方法的敏感性㊂4结论利用大肠杆菌表达系统成功表达并纯化了重组A S F V N P419L重组蛋白,该蛋白具有很好的抗原性;通过双峰驼免疫和文库构建等技术,成功构建了库容为6ˑ108的噬菌体展示文库,利用噬菌体展示技术成功筛选获得6株抗N P419L蛋白的特异性纳米抗体;真核表达了该6株纳米抗体与H R P的融合蛋白,其中1株融合蛋白A S F V-N P419L-N b20-H R P可结合真核表达的N P419L蛋白,并可与A S F抗体阳性猪血清竞争地结合N P419L蛋白㊂8152。

淋病奈瑟氏菌免疫血清的研究

淋病奈瑟氏菌免疫血清的研究
高恩明;肖忆梅;李亚楠;袁增麟
【期刊名称】《中国生物制品学杂志》
【年(卷),期】1991(0)4
【摘要】用中国医学细菌保藏管理中心提供的淋病奈瑟氏菌 W 分群参考菌株,参考 Sandstrom 的方法免疫家兔。

用 ELIISA 法测定免疫前、注射佐剂后、免疫抗原后和加强免疫后家兔血清中抗体,结果呈曲线递增升高,最高滴度可达1∶5120～1∶20480。

传统用于试管凝集试验的甲醛固定的菌液抗原和用于玻片凝集试验的菌苔抗原,其与抗血清的凝集反应较弱,而且菌苔粘稠,不易观察结果。

改用100℃1小时处理的菌液抗原,其与抗血清的凝集反应较强,而且不粘稠,无自凝现象。

【总页数】3页(P164-166)
【关键词】淋病奈瑟氏菌;抗血清;ELISA;凝集试验
【作者】高恩明;肖忆梅;李亚楠;袁增麟
【作者单位】中国药品生物制品检定所
【正文语种】中文
【中图分类】R977
【相关文献】
1.临床研究淋病奈瑟氏菌为何会对内胺类药物耐药 [J], 张咏梅
2.淋病奈瑟氏菌L型分子生物学性状的研究 [J], 程兴望;唐宁枫;林特夫;黄谷良
3.淋病奈瑟氏菌的耐药机制研究 [J], 袁建芬;喻海忠
4.表面等离子体共振芯片检测系统快速检测淋病奈瑟氏菌的研究 [J], 顾大勇;石磊;禹华伟;梁冰;鲁卫平;周元国;徐云庆;史蕾;张雅鸥
5.应用细菌培养法与PCR检测法检测淋病奈瑟氏菌的对比研究 [J], 陈秀英
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淋病奈瑟菌

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第三代NG疫苗----核酸疫苗（DNA疫苗）
定义：是将编码某种或多种特定蛋白的基因克隆到一个真核质粒表达载体上，然后直接注射到体内。以便在宿主细胞内表达目的蛋白，诱发特异性免疫应答。
近年来NG DNA疫苗研究，通过BALB/C小鼠肌肉注射和基因枪表皮轰击法免疫接种NG FA1090珠PorB蛋白DNA疫苗的研究显示，肌肉注射免疫接种可诱导Th1型活性，基因表皮轰击法免疫可诱导Th2型活性；重组ProB蛋白或委内瑞拉马脑炎病毒复制子颗粒表达的ProB都能明显增加ProB抗体水平，重组 ProB对抗体同种型几乎不影响，委内瑞拉马脑炎病毒复制子颗粒表达的ProB可提高Th1型免疫应答。
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第二代NG疫苗----亚单位疫苗
菌毛蛋白脂寡糖 IgA1蛋白酶转铁结合蛋白（Tbp）外膜蛋白奈瑟菌表面蛋白A(NspA)
分为
亚单位疫
定义
苗
是不含病原体核酸，仅能诱发宿主产生中和抗体的微生物蛋白或表面抗原疫苗。
PI 孔蛋白、PII 热修饰蛋白、PIII 还原反应可修饰蛋白（Rmp)
淋病奈瑟菌 (NG)及淋病
主讲：NG疫苗最新研究进展
NG
疫苗最新研究进展
淋病奈瑟菌疫苗
第一代NG疫苗
第二代NG疫苗
第三代NG疫苗
全细胞
亚单位疫苗
核酸疫苗
疫苗
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第一代NG疫苗----全细胞疫苗
整个细菌体
活疫苗死疫苗
1976年，Arko使用灭活的全细胞NG免疫雄性黑猩猩，部分黑猩猩获得尿道NG感染的抵抗力。但由于个体差异及免疫不持久，抗感染未获成功。 1978年，NG全细胞疫苗在人体实验失败后，这方面研究相对减少。 1997年，Arko给予小鼠口服免疫活NG，免疫组检测发现 IgG和IgA水平升高。但此法缺点是死疫苗要多次接种，不良反应大；活疫苗又有恢复毒性的危险。

淋病奈瑟菌免疫逃逸机制研究进展

淋病奈瑟菌免疫逃逸机制研究进展齐越【摘要】淋病严重危害人类健康,人类是其病原体淋病奈瑟菌的唯一天然宿主,而且普遍易患.淋病奈瑟菌的菌毛、脂寡糖、IgA1蛋白酶以及外膜蛋白等致病因子和与免疫逃逸相关的毒力因子,有助于其逃避宿主细胞免疫、体液免疫以及补体介导的免疫杀伤作用,因此人类感染后不能产生牢固的特异性免疫,呈现反复感染.随着淋病奈瑟菌的致病和逃逸机制的研究深入,近年来淋病奈瑟菌免疫逃逸机制研究进展迅速.%Neisseria gonorrhoeae does severe harm to human health,and human is the only natural host of Neisseria gonorrhoeae and commonly susceptible to it. Pilus, LOS, IgA1 as well as PⅠ , PⅡ , PⅢ, these virulence factors of pathogen and immune escape of Neisseria gonorrhoeae help its escape from attack of the host cell immunity, humoral immune and complement mediated killer immune function. Hence, infected people could not gain solid and specific immunity, and repeated infection occur. With further study of pathogenic and escape mechanism of Neisseria gonorrhoeae, rapid development has been made in the immune escape mechanisms in recent years.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2013(019)001【总页数】3页(P13-15)【关键词】淋病奈瑟菌;毒力因子;免疫逃逸机制【作者】齐越【作者单位】大理学院基础医学院病原生物学综合实验室,云南,大理,671000【正文语种】中文【中图分类】R378.16淋病奈瑟菌是一类寄生于多形核白细胞胞质内并引起人类淋病的革兰阴性双球菌。

猪流感病毒核蛋白基因的原核表达及其在诊断中的初步应用_倪建强

第26卷第1期中　国　预　防　兽　医　学　报 Vol.26,No.1 2004年1月 Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine Jan.2004猪流感病毒核蛋白基因的原核表达及其在诊断中的初步应用倪建强,张春玲＊＊,李海燕,崔尚金,仇华吉,王云峰,田志军,童光志＊(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150001)摘要:根据GenBank中A/S wine/Hong Kong/126/82(H3N2)株猪流感病毒(SIV)NP基因核苷酸序列设计合成一对引物,经RT_PCR扩增了我国SIV分离株A/S wine/Heilongjiang/3/2000(H3N2)的核蛋白(NP)基因。

将扩增所得NP基因克隆于p MD18_T载体,酶切鉴定后对其序列分析表明NP基因与香港分离株同源性高达93.8%,然后定向亚克隆NP基因于原核表达载体pET30(a)的多克隆位点中,经酶切鉴定后,将含有NP基因的重组质粒命名为pET_NP。

用pE T_NP转化受体菌BL21,用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导,并在不同诱导时间收集样品。

经SDS_PAGE电泳分析证实NP基因获得了表达,并在终浓度为1mM的IPTG诱导下,6h其表达量达到高峰,经Western blot分析证实表达的重组核蛋白具有反应活性,大小约为60kD。

用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与SIV抗血清可形成清晰的反应沉淀线,而与其它9种猪病原阳性血清不发生反应。

正常菌体蛋白与SIV阳性血清也不发生反应。

通过对40份送检血清样品的检测结果显示其与HI试验的相符率高达95%以上。

试验证明利用原核表达系统制备的重组核蛋白作为诊断用抗原,不仅制备过程简单而且所建立的琼扩诊断方法特异、快速、简便,其灵敏度也能满足现地的使用要求。

目前正在进行现地的中试试验。

关键词:SIV;　核蛋白;　琼脂扩散试验中图分类号:S852.65+9.5;　Q78 文献标识码:A 文章编号:1008_0589(2004)01_0018_04Primary application of swine influenza virus nucleoprotein expressed inprokaryotic expression systemNI Jian_qiang,ZHANG Chun_lin g,LI Hai_yan,CUI Shang_jin QIU Hua_ji,WANG Yun_feng,TIAN Zhi_jun,TONG Guangzhi＊(National Key Laboratory of Veterinary Biotec hnology,Harbin Veterinary Research Institute,Harbin150001,China)A bstract:According to the sequence of Nucleoprotein(NP)gene of s wine in fluenza virus(SIV)A/Swine/HongKong/126/82 (H3N2),cDNA encodin g for NP of a SIV isolate,A/Heilongjiang/3/2000(H3N2),was amplified and cloned into p MD18_T plas mid. Sequencing anal ysis indicated the homology between Hon gKong strain and Heilongjiang strain is93.8%.The NP gene then was sub-cloned into prokaryotic expression plas mid pET30(a).The recombinant plasmid carrying NP gene was des ignated as pET_NP.After transformation of BL21with pET_NP,an expressed fusion protein was identified by SDS_PAGE in E.coli.BL21after induced by IPTG. The recombinant NP protein is about60kD in size.The im mune reactivities of the recombinantprotein were con firmed by western_blot and AGIP test with polyclonal antibodies.In the AGIP test recombinant NP as antigen,no reaction was shown to sera from other nine s wine infectious pathogens.The total of40seru m samples were randomly collected from field and evaluated by AGIP with recombinant NP and HI test,the coincidental rate bet ween the t wo tests is about95%.The results above showed that recombinant NP based AGIP is specific,economic,and easy to perform for serologically diagnosis of SIV infection in field condition.Key words:SIV;　nucleoprotein;　AGIP　This work is supported by National High_Tech Plan(863Plan)(2001AA213051)　＊Corresp onding Author,E_mail:gztong@　基金项目:本项研究获国家863计划(2001AA213051)资助　作者简介:倪建强(1974～),男,内蒙古呼和浩特市人,博士研究生,主要从事动物病毒分子生物学研究.　＊通讯作者,Email:gzton g@　＊＊新疆农业大学硕士研究生　收稿日期:2003-03-24 猪流感(SI)即猪流行性感冒,是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病。

淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒国家参考品的制备_王春娥

微生物学免疫学进展 2016 年 10 月第 44 卷第 5 期 Prog in Microbiol Immunol，Oct． 2016，Vol． 44 No． 5
·21·
·论著·
淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒国家参考品的制备
王春娥，卢旭，刘茹凤，石继春，李红，陈琼，唐静，陈翠萍，叶强
中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京 100050
关键词：淋病奈瑟菌；核酸；试剂盒；参考品
中图分类号：Ｒ392-33
文献标志码： A
文章编号： 1005-5673（ 2016） 05-0021-05
DOI： 10． 13309 / j． cnki． pmi． 2016． 05． 004
Preparation of national reference for detection kit of neisseria gonorrhoeae nucleic acid
基金项目：国家科技基础条件平台国家微生物资源平台奖补经费资助项目（ NIMＲ 2015-2）
作者简介：王春娥（ 1980－），女，助理研究员，主要从事医学微生物菌种资源的收集、保藏及相关科研。
通讯作者：叶强，主任技师，E-mail： qiangyee@ nifdc． org． cn
淋病奈瑟菌（ Neisseria gonorrhoeae，NG）属革兰阴性球菌，为严格的人体寄生菌。NG 可引起人类泌尿生殖系统化脓性感染（俗称淋病），淋病是中国发病率较高的性传播疾病之一，早期发现和有效治
1 材料与方法
1． 1 菌株 NG 菌株（ CMCC 29105、29106、29400、 29403、29805、29806、29807、29808、29816、29818 ），非 NG 菌株［铜绿假单胞菌株（ CMCC 10104）、金黄色葡萄球菌株（ CMCC 26001 ）、脑膜炎奈瑟菌株（ CMCC 29018 ）、脑膜炎奈瑟菌株（ CMCC 29204 ）、干酪乳杆菌株（ CMCC 34103）、大肠埃希菌株（ CMCC 44103）、变形杆菌株（ CMCC 49102 ）、伤寒沙门菌株（ CMCC 50096 ）、福氏志贺氏菌株（ CMCC 51573）、白色念珠菌株（ CMCC 98001）］均来源于中国医学细菌保藏管理中心。 1． 2 主要试剂及仪器（ PCＲ-荧光探针法） NG 核酸检测试剂盒 A 和 NG 核酸检测试剂盒 B 均为中山大学达安基因股份有限公司产品； NG 核酸检测试剂盒 C 为上海科华生物工程股份有限公司产品； NG 核酸检测试剂盒 D 为上海之江生物科技股份有限公司产品；沙眼衣原体 / NG 核酸检测试剂盒 E（多重实时荧光 PCＲ法）为 Cepheid AB 公司产品。注射用生理盐水、GC 基础培养基、血红蛋白粉、Vitox Supplement 均购自 Oxoid 公司；普通营养琼脂、MＲS 培养基均购自 BD 公司。显微镜（ OLYMPUS BX51）、细菌计数板（ THOMA HELBEＲ）、标准细菌比浊管均由中国食品药品检定研究院提供；荧光定量 PCＲ仪（ ABI7500）购自 ABI 公司；全自动医用 PCＲ分析系统（ GeneXpert Dx）购自 Cepheid AB 公司。 1． 3 菌株的培养选择适宜的培养基将菌株进行复苏、传代培养。将 NG 菌株接种至 GC 培养基上，于 37 ℃ 、5% CO2 培养箱中培养 18 h，刮取新鲜培养物进行形态学、生理生化特性鉴定，并提取基因组 DNA 进行分子生物学特征分析；将脑膜炎奈瑟菌接种至巧克力色琼脂培养基上，于 37 ℃ 、5% CO2 培养箱中培养 18 h，刮取新鲜培养物进行形态学、生理生化特性鉴定；干酪乳杆菌接种至 MＲS 培养基，于 37 ℃ 培养箱中过夜培养；白色念珠菌接种至改良马丁培养基，于 25 ℃ 培养箱中过夜培养；其余菌株分别

淋病奈瑟菌的免疫胶体金检测及与传统方法的灵敏度比较

1 2 3 3
线性关系
改变待测淋病奈瑟菌液的浓度，多次实验，计算不同浓度下检出率的变化，观察两种方法线性关系。
灵敏度
设计一个浓度梯度检测两种方法检出的最低所需菌群浓度，最低浓度越低，灵敏度越高。
重复性、假阴性率
确定一个浓度，在该浓度下进行多次重复检测实验，比较两种方法重复性的好坏和假阴性率。
假阳性率
1.2
目前的淋病奈瑟菌检测技术
1 2
涂片检查法
4
5 6 7
分子生物学检测技术淋病奈瑟菌基因芯片检测技术
培养检查法
免疫学检测法酶联免疫吸附试验免疫胶体金技术
3
3.1 3.2
共凝试验快速检测淋病奈瑟菌
泡沫快速试验
1.3
立题依据和国内外研究背景
当前对于感染有淋病奈瑟菌的女性而言，早期绝大多数是无症状的状态。因此，我们猜测可以研制一种家庭快速检测淋病奈瑟菌的简易装置（类似于验孕棒，验孕棒的原理就是以怀孕女性尿液中升高的人绒毛膜促性腺激素——hcg作为抗原，利用免疫胶体金技术来检测是否怀孕，同理可用尿液中的淋病奈瑟菌的外膜蛋白作为抗原，利用免疫胶体金技术来检测是否感染）。为了确保该简易装置的可行性和提高检出率，本次实验将分离提纯淋病奈瑟菌的主要的外膜蛋白进行免疫胶体金试验，并对处于轻度症状的女性进行淋病奈瑟菌检测以估计免疫胶体金法的检出率。
使用不含菌的培养液对两种方法进行多次检测，比较假阳性率高低。
3.3
技术路线（临床指标检测）
1
2 3
采集淋病奈瑟菌女性携带者的尿液和非携带者的尿液
制作简易的层析法免疫胶体金检测试剂，试剂中包含全部实验所得单抗种类。
将测试剂浸入尿液，检测、统计、计算假阳性率、假阴性率。