TaKaRa定量PCR介绍

F
R
提升反应检测的灵敏度。
1,500 base
OOligligooddTTPPrirmimeer r 目的片段在距Poly(A) Tail
5’
目的片段
AAA··· 3’ 1.5 kbp 以内适用，RT效率
F
R
较高。
Gene Specific Primer
实时荧光定量介绍
April 11, 2020 3
的用途
Real Time PCR用途
定性分析
病毒及病原菌检测 物种鉴定 基因分型
实时荧光定量介绍
定量分析
绝对定量
病毒及病原菌定量分析 导入基因拷贝数解析 GMO定量检测
相对定量
差异显示结果验证 基因芯片结果验证
siRNA效果确认 mRNA表达量分析
April 11, 2020 4
实时荧光定量介 绍
主要内容
1 Real Time PCR基础知识 2 Real Time PCR实验方法 3 Real Time PCR解析方法 4 Real Time PCR应用实例
实时荧光定量介绍
April 11, 2020 2
基础知识
1 Real Time PCR基础知识
1. Real Time PCR的用途及原理 2. Real Time PCR的检测方法
( 代表，代表）
阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的 荧光检出界限。
实时荧光定量介绍
April 11, 2020 7
的原理
在反应体系中加入荧光物质，并实时监测荧光信号积累的整个进程， 最后通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析。
实时荧光定量介绍
April 11, 2020 8
无
4
48
无
2
升降温速度
快 快、慢两种
快 快 快 快
慢 快
96
无
5
快
0.2普通
0.2 8联管、 专用
专用毛细玻璃管 专用板
专用、塑料＋石英 0.2为普通, 0.1为专用 0.2普通
荧光 校正功能
无 有
无
无 无 无
0.2普通
无
66A 3000P®
3005
66
无
4
4
96
无
5
实时荧光定量介绍
快
0.2普通
无
慢
I 法与法比较
I法 简便易行 价格便宜 要求反应的特异性 不能进行多重
常用于表达量分析等
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One-SPtreop bReT-法PCR 特异性高 多重PCR检出 Probe设计要求高 Probe合成费用高
常用于解析，病毒、病源菌检测 April 11, 2020 20
主要内容
反转录反应
为一寡核苷酸，一端标记一个荧光报告基 团（），一端标记一个荧光淬灭基团（）， 寡核苷酸为杂合体。
RNA
Q
R
✓RNase H
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April 11, 2020 18
法原理示意图
热变性
Primer
Q
F
退火
Primer
Pol.
Q RNase H
F
延伸
Primer Pol.
实时荧光定量介绍
Q
F
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检测系统简介
生产厂商
公司 公司 公司 公司 公司 公司 公司 公司 杭州博日
仪器名称
800 7700、7000、7300、7900、 7500 ® 2.0、® 480 、、® 、5 2000、3000 、 6000 、、 4000®、3000P® 、3005 33A、 66A
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April 11, 2020
◇ One Step和Two Step RT-PCR的选择
◇ RT Primer的选择
◇
Total2RNA中GenRoemaicl
DNA混入的对策
Time PCR实验方法
Real Time PCR反应
◇ Real Time PCR引物及探针的设计 ◇ 引物反应性确认 ◇ PCR条件优化顺序
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的原理
使用 扩增装置实时监测扩增产物并进行分析的方法。
发
射激
光发 光
Ct值
实时荧光定量介绍
April 11, 2020 5
的原理
同一个样品重复96次的扩增曲线
Ct值
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April 11, 2020 6
中的概念
值概念
扩增过程中，每个反应管内的荧光信号值 达到设定的阈值时所经历的循环数。
April 11, 2020 21
和 的选择
Two-Step RT-PCR
RT反应
RNA
cDNA
PCR反应
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One-Step RT-PCR
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和 的选择
高扩增效率 cDNA使用更加灵活 更多RT Primer选择 常用于mRNA表达量分析等 实时荧光定量介绍
0.2 8联管 或单管
有
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基础知识
1 Real Time PCR基础知识
1. Real Time PCR的用途及原理 2. Real Time PCR的检测方法
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的检测方法
I
荧光染料嵌合法 荧光探针法
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.
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法作用机理
探针为一寡核苷酸， 5’ 端标记一个报告基团（）， 3’ 端标记一个淬灭基团（）。
R
Q
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April 11, 2020 16
法原理示意图
热变性
Primer
R
Q
退火
Primer
Pol.
R
Q
延伸
Primer Pol.
实时荧光定量介绍
R
Q
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法原理
荧光染料嵌合法（ I）
I：是一种能结合于所有双螺旋小沟区域的 具有绿色激发波长的染料。
I
实时荧光定量介绍
April 11, 2020 14
I 法作用机理示意图
热变性
Primer
F
F
F
F F
退火
Primer
Pol. F
F
F
FLeabharlann Baidu
F
延伸
Primer Pol.
F
实时荧光定量介绍
F
F
F
F
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7500
5
® 480
800
3005
66A
实时荧光定量介绍
6000 April 11, 2020
各公司 检测系统比较
仪器名称
800 7000 7500
2.0 480
3000
5
反应孔数
反应孔间 独立性
检出通道
96
无
2-4
4
96
无
5
32
6
无
96 384
5
16 (6×16 ) 有
4
36 (0.2) 72 (0.1)
操作简便 有效降低污染 特异性RT Primer
常用于病毒、病源菌检测等
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的选择
6
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的选择
Random
目的片段在mRNA任何位
5’
目的片段
3’ 置都能使用。通常mRNA
F
R
Random
表达量分析最适。
5’
目的片段
AAA··· 3’ 适用于mRNA表达量分析，