第五章 体外分析技术
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第五章体外分析技术
（3）分离方法主要是使大分子和小分子物质分离。
双抗体法(测量B)： 用抗原免疫动物而产生的抗体称为第一抗体，用第一抗 体再免疫另一种动物所产生的抗体称为第二抗体。
当RIA反应完成后，于反应液中加入第二抗体，第二抗 体则与含有第一抗体的免疫复合物B相结合形成第二抗体复 合物，其分子量比第一抗体复合物大，可用离心方法分离 出来，称为双抗体法（double antibody method）。
(一)实验室内质量控制： 是一个实验室内部实验方法的质量控制，以便在一个人 的同一批或不同批实验中，不同操作者和不同方法之间有 可比性。 零标准管结合率（B0%）：即最大结合率，指不加非标记抗 原时，标记抗原与抗体的结合率，一般要求在30%～50%，该 指标主要用来反映标记物与抗体的质量是否稳定。 非特异性结合率（NSB%）：指不加抗体时标记抗原与非特 异物质的结合率，一般要求＜5%～10%。 最低浓度管与最高浓度管的结合率之差：＞30%。
标准曲线直线回归的参数：包括截距a、斜率b和相关系数r， 要求a、b值稳定，r ＞ 0.99。 ED25、ED50与 ED75：指标准曲线的结合率在25%、50%和75%时 对应的抗原浓度值，它反映标准曲线的稳定性，有助于批间 结果的比较。 质控图：连续测定10批以上高、中、低三种已知浓度的质控 血清的均数±标准差（x±s），画出均数线与两个标准差的 范围，将以后每次实验测定的高、中、低值标在图上，即为 质控图。 WHO要求在一次实验中有下列情况之一者，其结果应舍弃： ① 三种QCS中有一个测定值＞3s； ② 三种QCS中在同一方向上有两种＞2s；
2．反应动力学：因标记抗体是过量的，且反应是非竞争 性的，抗原抗体是全量反应，故反应速度比RIA快。
3．灵敏度明显高于放射免疫分析，约为放射免疫分析的 10～100倍。
体外分析技术
基本原理
*Ag + Ab
+
Ag
？
*Ag-Ab + *Ag
(B)
(F)
Ag-Ab + Ag
Ag= * Ag , AgAb=*AgAb Ag > *Ag , *AgAb (B) *Ag(F) Ag < *Ag , *AgAb (B) *Ag (F)
*Ag与Ag 免疫活性相同 *Ag＋Ag > Ab
B1% B2% B3% B4% B5% B6%
放射性竞争结 合分析
放射免疫分析 (RIA)
体外放射分析
体
放射性非竞争 免疫放射分析
外
结合分析
(IRMA)
分
析 技 术
体外非放射化学发光免疫分析 (CLIA)
荧光免疫分析 (FIA)
放射免疫分析法
Dr. Yalow
放射免疫分析法 （Radioimmunoassay) 在体外条件下, 利用Ag与定量 的*Ag对限量的特异性Ab的竞 争抑制结合反应，通过测定放 射性复合物的量来计算出Ag 量的一种超微量分析技术
IRMA与RIA工作原理的主要区别
RIA
IRMA
竞争性抗原抗体结合反应
非竞争性抗原抗体结合反应
采用标记抗原
采用标记抗体
三种主要反应试剂
二种主要反应试剂
所用抗体是限量的
所用抗体是过量的
*AgAb的量与待测Ag的量呈负相关 Ag*Ab的量与待测Ag的量呈正相关
反应到达平衡慢 低剂量区有不确定因素
反应到达平衡快 低剂量区无不确定因素
Ab
分离B、F
*Ag
B%=B/(B+F)
F%=F/(B+F)
体外分析技术核医学
通过核医学技术可以检测和定位肿瘤，为早期诊断和治疗提供准确信息。
2
心脏疾病评估
核心医学可以评估心脏功能、血液供应情况以及冠状动脉梗塞的程度。
3
神经精神疾病研究
利用核医学技术，研究人类的脑部功能，了解神经精神疾病的病理生理机制。
未来展望
随着科技的不断进步，体外分析技术核医学将继续发展，并在疾病诊断、治疗和疗效评估方面发挥越来越重要 的作用。
PET显像技术
正电子发射计算机断层显像（PET）利用放射性同位素的正电子发射特性，提供高分辨率、高敏感度的全身代 谢和功能成像。
SPECT显像技术
单光子发射计算机断层显像（SPECT）使用放射性同位素的单光子发射特性，提供三维的功能和代谢成像，广 泛用于心脏和脑部疾病诊断。
临床应用实例
1
癌症筛查
结束语
体外分析技术核医学为医学研究和临床实践带来了革命性的进展，将为人类 健康的未来带来更多希望和机遇。
Байду номын сангаас
体外分析技术核医学
体外分析技术核医学是一门研究放射性同位素用于医学诊断和治疗的技术。 本次演讲将带您了解该领域的原理、技术和应用实例，并展望未来发展。
原理介绍
体外分析技术核医学利用放射性同位素的特性，通过探测其发出的放射线来 获取有关人体内部结构和功能的信息。
体外标记法
体外标记法是使用放射性同位素标记生物分子，如蛋白质和抗体，以便在体 内观察特定细胞、器官或病变的存在和活动。
体外分析技术PPT
缺点
至少两株抗体：主要限于肽类和蛋白质，很多 小分子半抗原不能应用。
缓冲液PH及离子强度要求严格。
应用
CEA、AFP、铁蛋白、HbsAg、ACTH、PHA、 胰岛素、FSH，TSH、降钙素、血管紧张素I& II 、抗血友病因子、凝血VIII因子等 。
IRA与IRMA的区别
反应类型 结合类型 标记物 待测物 RIA 免疫反应 竞争结合 抗原 抗原 IRMA 免疫反应 非竞争 抗体 抗原
结合与游离部分的分离
快速而完全分离。 操作简便，来源容易，价格便宜。 不受血清、外界条件及其它试剂的干扰。 适用于任何容积的反应液。 非特异结合率小。
常用液相分离技术: 收集抗原抗体复合物（B）
双抗体沉淀法:
分离完全，非特异结合小，环境影响小，效 价高，但 成本高.
聚乙二醇(PEG)沉淀法:
标记物 抗原 抗体
待测物 抗原 抗原
RBA 受体配体
非竞争
配基 受体 数量和性质
非放射性标记免疫分析
提高灵敏度 减少放射性废物 原理相同 探测信号不同 探测仪器不同
一、酶标记免疫分析
(enzyme immunoassay, EIA)
EIA和 IEMA（酶免疫分析法）的测定原理与 RIA和IRMA相同，竞争结合和非竞争结合。 IEMA应用最多-酶联免疫吸附分析(ELISA)。
只是用酶替代标记抗原或抗体的放射性核素 常用的酶辣根过氧化酶(HRP),底物四甲基联苯
胺(TMB) 分光光度计检测
二、化学发光免疫分析
化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay CLIA） 标记物为能产生化学发光的化合物，如异鲁米娜、甲基 氮蒽。碱性条件下遇过氧化物有单光子发射。缺点:发 光时间短。
核医学课件：体外分析技术
标准曲线
目前已普遍采用计算机进行数据处 理，自动绘制标准曲线，自动换算 样品中被测物质的浓度
实验操作基本步骤
1.加样：加样总体积要保持一致，所处的介质环境 也要一致。
2.孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间 不同，一般是37℃。
3.分离：选择好的分离方法分离游离抗原和 抗原－抗体复合物。 4.测量：测量游离或结合物部分的放射性。 5.数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算
* Ag
基本反应式
Ag-Ab
*Ag:标记抗原，Ag 非标记抗原 Ab：抗体 *Ag- Ab 标记抗原抗体复合物 Ag- Ab 非标记抗原抗体复合物
Ag-Ab+Ag
条件：1.*Ag与Ag 免疫活性相同
2. *Ag与Ab 恒量
*Ag-Ab+*Ag
理
*Ag与Ag由于免疫化学性质一致，共同竞争 性与Ab结合，当*Ag和Ab的量保持恒定， *Ag与Ag之和大于Ab时，则*Ag-Ab复合物的 形成受Ag含量的制约，二者之间存在函数关 系 ， 即 Ag 量 越 大 ， *Ag-Ab 量 越 小 ； Ag 量 越 小，*Ag-Ab量越大；测定*Ag-Ab或*Ag量即 可推算出被测Ag量
量B、F的cpm
*Ag
B%=B/(B+F)
Ag 1
2
3
4
5 6？
25 50 100 200 400 800
B%
B% 标准曲线
常 用 的 反 应 参 数 有 B%，B/F，F/B、 F%等这些反应变量都可以用作纵坐标来对 应标准抗原的浓度作标准曲线，选用的反应 变量不同，标准曲线的形状也不同。但是这 些标准曲线都是反映的反应变量对应标准抗 原浓度变化而变化的函数关系。
《内分泌与代谢系统疾病核医学诊断和治疗》- 体外分析技术
四碘甲腺原氨酸
两个3，5-二碘酪氨酸分子偶联而成的一种碘化的酪氨酸衍生物
5
体外分析技术的特点（2）
3、精密度高 反映出来的是随机误差小（统计及实 验误差）。(批内误差、批间误差)
4、应用广泛 以放射免疫分析法为例目前至少有300 多种生物活性物质的检测建立了该方法。如：激素、 蛋白质、抗体、免疫球蛋白、维生素及一些药物的分 析。体外分析技术已成为现代医学临床诊断、治疗监 测及评估、科学研究的重要手段。
• 逻辑分布(Logistic distribution)公式 P(Y=1│X=x)=exp(x'β)/1+exp(x'β)
12
Log-Logist作图法
13
分析曲线
a 以B/B0%为纵坐标的标准曲线
b 以B0% Logit为纵坐标的标准曲线
14
15
RIA实际应用中的参数（一）
1．最大结合管（B0）：标准抗原的量为0，只有标记抗原 和特异性抗体时，标记抗原与抗体充分反应后分离B和F，所测 得的B的放射性为B0。这是没有标准抗原与之竞争时，标记抗原 和抗体的结合达最大值。
• 化学发光免疫分析法 (chemical luminescent immunoassay，CLIA)
• 酶标记的免疫分析法 (enzyme immunoassay, EIA)
4
体外分析技术的特点（1）
1、灵敏度高 可测水平10-9～10-20 g/l。 一般化学分析法检出极限为10-3～10-6g 。
1.RIA的必备条件包括由国家批准的生产单位提 供的试剂、分离技术、测量仪器。
2.主要试剂的组成是：特异性抗体(specific antibody)、标记抗原（radionuclide labeled antigen）、标准品（standard）（非标记抗原）。
5-体外分析技术
上海交通大学 上海市第六人民医院 核医学科
非放射性标记免疫分析技术
提高灵敏度、减少放射性废物、 提高灵敏度、减少放射性废物、提高自动化程度
上海交通大学 上海市第六人民医院 核医学科
非放射性标记免疫分析方法
• • • • 酶标记免疫分析技术 化学发光免疫分析技术 时间分辨荧光免疫分析技术 蛋白芯片与基因芯片技术
上海交通大学 上海市第六人民医院 核医学科
上海交通大学 上海市第六人民医院 核医学科
上海交通大学 上海市第六人民医院 核医学科Βιβλιοθήκη IRMA的主要特点 的主要特点
• 属于非竞争性抗原抗体结合反应 • 抗原抗体复合物的量与所加非标记抗原的量呈 正相关 • 在低剂量下不会有不确定因素 • IRMA的非特异性结合对低剂量区影响大，对 的非特异性结合对低剂量区影响大， 的非特异性结合对低剂量区影响大 分离条件的要求严格。对于RIA来讲，低剂量 来讲， 分离条件的要求严格。对于 来讲 区放射性高，非特异结合主要影响高剂量区。 区放射性高，非特异结合主要影响高剂量区。
上海交通大学 上海市第六人民医院 核医学科
质量控制
• 质量控制的目的：对分析工作的误差进行经常性的检 质量控制的目的： 遇有质量异常则及时采取对策， 查，遇有质量异常则及时采取对策，以保证分析误差 控制在可接受的范围内， 控制在可接受的范围内，包括实验室内部和实验室间 质控两方面。 质控两方面。 • 放射免疫分析误差 随机误差和系统误差 放射免疫分析误差: • 质量控制指标 稳定性、灵敏度、准确度 质量控制指标: 稳定性、灵敏度、
体外分析技术
上海交通大学 上海市第六人民医院 核医学科
体外分析技术分类
• 放射免疫分析法 • 免疫放射分析法 • 非放射性标记免疫分析技术
第五章_体外分析技术
*Ag-Ab + *Ag (F) (B) Ag-Ab + Ag
Ag= * Ag , AgAb=*AgAb Ag > *Ag , *AgAb (B) *Ag(F) Ag < *Ag , *AgAb (B) *Ag (F)
10
Ag + *Ag
+ Ab
+ + +
*AgAb + AgAb + *Ag + Ag
1.抗体
2.标记抗原
3.非标记标准抗原（标准品）
2.标记抗原
1）比活度和放化纯度足够高
比活度——每微克抗原 放化纯度——具有免疫
上标记放射性核素的千
贝可数（KBq/μg）
活性的标记抗原占总放
射性的百分数。 >90%
2）半衰期足够长
3）保持原有抗原的特性 大分子：125I 小分子：3H or 125I
第一阶段
第二阶段
第三阶段
（B） （F）
在体外, 利用Ag与过量的*Ab的非竞争性结合反应，通过测定放射性 复合物的量来计算出Ag 量。标记抗体，抗体是过量的。
B%
IRMA与RIA工作原理的主要区别
RIA 竞争性抗原抗体结合反应 采用标记抗原 三种主要反应试剂 所用抗体是限量的
*AgAb的量与待测Ag的量呈负相关
IRMA 非竞争性抗原抗体结合反应 采用标记抗体 二种主要反应试剂 所用抗体是过量的 Ag*Ab的量与待测Ag的量呈正相关 反应到达平衡快 非特异结合主要影响低剂量区 低剂量区无不确定因素
常用的有 B%，B/F，B/Bo，F/B，Bo/B 等 这 些反应变量都可以用作纵坐标来对应标准抗原 的浓度作标准曲线，选用的反应变量不同，标
五、 体外分析技术
第五章体外分析技术第一节放射免疫分析的基本原理放射免疫分析的基础是抗原和相应的抗体能进行特异性结合。
放免分析体系中有两种抗原，即未标记抗原（Ag)和标记抗原（*Ag),两者都与抗体（Ab）有相同的结合能力，且两者的总和大于抗体的量，两种抗原与抗体的结合将彼此竞争，互相抑制。
反应体系中每管所加*Ag和Ab量相同，而Ag量不同，随着Ag量的增加，*Ag与Ab的结合（B）将减少，经实验和理论证明，B与Ag量成函数关系。
在实际的反应体系中有两种Ag，即已知成梯度浓度的一系列标准品和未知浓度的待测样品，两者在严格相同的条件下与*Ag及Ab反应，反应结束后，以标准品的浓度为横坐标，结合率为纵坐标，绘制出标准曲线。
再以待测样品的结合率从标准曲线上查出其含量来。
第二节放射免疫分析法的建立和基本试剂（一）抗体衡量抗体的指标有（1）抗体的亲和力，（2）抗体的特异性，（3）抗体的滴度。
（二）标记抗原对标记抗原的要求是（1）标记后保持抗原的生物特性；（2）有效期较长；（3）比活度和放化纯度要高。
（三）标准品对标准品的要求是（1）含量要准确，（2）与待测样品的抗原特性相同,(3)不含干扰反应的物质。
（四）基本操作过程1.在试管内加入Ag（包括标准品和待测样品）*Ag和Ab。
2.温育。
3.分离游离抗原和抗原抗体复合物。
4.测抗原抗体复合物的放射性。
5.数据处理。
第三节分离方法和数据处理一、分离方法1.中止反应后收集抗原抗体复合物测放射性(B) 常用方法有以下几种:(1)聚乙二醇(PEG)沉淀法。
（2）双抗体沉淀法。
（3）葡萄球菌A蛋白沉淀法。
（4）其它。
2.收集游离抗原测放射性(F) 常用活性炭吸附法.3.固相法将抗体吸附于固相支持物上,当反应达到平衡后,抗原抗体复合物就留在支持物上,倒去上清液,再洗涤数次,测定固体支持物上的放射性B。
（二）数据处理1.手工作图法根据标准管测得的数据算出结合率，以标准品浓度为横坐标，结合率为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。
(核医学课件)02.RIA体外分析技术
RIA体外分析技术的优势与局限
1 优势
高灵敏度：能够检测极低浓度的物质
2
高特异性：能够准确区分类似结构的分 子
3
4 局限
广泛应用：适用于多种生物样品和分析 物质
放射性污染风险，需要严格的实验室操 作控制
常见的RIA体外分析技术方法
RIA技术在医学诊断和研究中有多种变种：
• 双抗体RIA • 竞争性RIA • 免疫放射分析（IRMA） • 固相RIA • 辐射免疫沉淀法（RIP）
放射性示踪技术
免疫学
RIA利用放射性示踪技术标记 分析物质，使其具备辨识性， 进而实现可靠的浓度测定。
RIA基于抗原抗体反应原理， 利用特异性抗体对待测物质 进行检测，确保高特异性和 高敏感性。
实验室应用
RIA广泛应用于医学诊断、生 物医学研究和临床实验，可 检测和分析激素、肿瘤标志 物、免疫功能指标等生物分 子的含量。
激素诊断
RIA可用于测定病。
肿瘤标志物检测
RIA可以精确测定血液或组织中的肿瘤标 志物，用于早期诊断、治疗监测和预后评 估。
免疫功能检测
RIA在评估免疫功能指标，如免疫球蛋白、 细胞因子等方面发挥重要作用。
药物浓度测定
RIA可测定药物在体内的浓度，用于调整 和监测药物治疗的效果。
(核医学课件)02.RIA体外 分析技术
为了有效地进行医学诊断，了解RIA体外分析技术的原理和应用至关重要。本 节将介绍RIA体外分析技术的基本知识和发展前景。
RIA体外分析技术的概述
RIA体外分析技术是一种高灵敏度、高特异性的实验室分析方法，用于测量微量物质在体内或体外 的浓度。通过结合放射性示踪技术和免疫学，RIA可以检测和定量分析各种生物分子。
【核医学】体外放射分析技术
三、放射测量
• 直接检测技术灵敏度通常较低 • 采用示踪技术进行间接测量 • 37Bq/10-15g，提高比活度可提高灵敏度 • 放射性原子标记到配体或结合剂分子 • 何种核素？何种射线？
非放射定量技术
• 化学发光技术 • 时间分辨荧光分析技术 • 电化学发光技术 • 酶定量技术：灵敏度差。
• 受体放射分析 (receptor radioassay) ：检 测受体本身数量及其他参数。
• 放射受体分析(radioreceptor assay）：测 受体抗体：如TRAb。
• 四、酶活性放射分析、放射酶促分析 • 五、蛋白结合分析
第三节 临床应用
• 一、内分泌系统疾病 • 甲状腺、肾上腺、性腺、垂体、下丘脑 • 二、肿瘤标志物 • 三、神经系统、循环系统、消化系统、泌
• [L]+ [L*]+[B] [LB] +[L*B]
• 2、非竞争结合
•结合在试管 或包被珠上
• Sp.Ab1+Ag Sp.Ab1.Ag
• Sp.Ab1.Ag +Ab2* Sp.Ab1.Ag.Ab2*+Ab2*
优点
• 竞争结合： • 节约结合剂用量 • 非竞争结合： • 灵敏度高，试验周期更短，误差更小。
logistic拟合法
3、两类分析系统的比较
标记对象 抗体 方法学 反应动力学 标准曲线 NSB影响 误差 批间比较
RIA
IRMA
抗原
抗体
多克隆，量少 单克隆，量大
竞争
非竞争
复杂，不稳定 简单，稳定性好
负相关，量程窄 正相关，量程较宽
高剂量段
低剂量端
较大
较小
可比性强
可比性差
第五章体外分析技术
的疗效判断,评价胰岛素产品质量.
骨钙素解甲状
腺\甲状旁腺功能
肝脏
急性黄疸型肝炎\慢性活动性肝炎\肝硬化
胆酸 放免<300μg/dl 肝癌\胆汁淤积时明显升高,慢性迁延性肝
炎及胆囊炎轻度升高。妊娠胆淤明显升高。
透明质酸 放免 <120μg/l 肝硬化\肝纤维化\慢性肝炎时升高,肝硬
同上
甲状腺球 放免〈30%
甲状腺自身免疫疾病特异指
蛋白抗体
标，桥本氏甲状腺炎
甲状腺微 放免〈20%
甲状腺自身免疫疾病特异指
粒体抗体
标，桥本氏甲状腺炎
TSH 免放 0.4-3.1μIU/ml 鉴别原发与继发甲低,评价下
丘脑-垂体-甲状腺轴功能,垂体瘤,库欣综合征
甲状腺 放免4-14.5μg/ml 诊断甲癌\慢性淋巴细胞性
三、质量控制
Quality Control , QC
（一）定义：质量控制 就是控制误差， 即对分析工作中的误差进行经常性的 检查，遇有质量异常则及时采取对策， 以保证分析误差控制在可接受的范围 内。
放射免疫分析是一类高灵敏度的超微 量分析技术，极易受各种因素的影响 而使检测结果失真，因此必须有严格 的质量控制体系。
CA-153 放免<30U/ml 乳癌诊断特异,乳癌肝及骨转移\卵巢癌\
子宫内膜癌一定程度增高
肾上腺及肾脏
尿免疫球蛋白 放免<8mg/l 早期诊断肾脏受损\受损部位及程度判断
尿白蛋白 放免<10mg/l
同上
尿β2微球蛋白 放免<230mg/l
同上
上午8时: 50~280μg/l 综合征,肾上腺肿瘤、肿瘤、应激
糖类抗原 放免<20mg/l 肿瘤诊断\预后, 放化疗及手术后的疗
体外分析技术
s=SQRT((s12+s22+s32+s42)/4) CV=s/X 要求：批内CV<5% 批间<10%
反应误差关系（RER）: 整批误差指标 要求： RER<0.04
∑(A-B)
双管计数误差之和
RER=
=
√2 2
双管计数均值之和 ∑(A+B)/2
cv
2.评价RIA试剂盒质量－精密度
精密度图 由于测定值的精密度随剂量水平而变化，要求
2.评价RIA试剂盒质量－特异性
反映分析方法中所用抗体对被测物质的专一性。 常用交叉反应来表示。
2.评价RIA试剂盒质量－准确度
回收率：测定值/真值×100% 要求90%~110% 平行性反应（了解）
标准品与样品的剂量
2.评价RIA试剂盒质量－稳定性
试剂盒在合理保存条件下，分析试剂在有效期内的 性状稳定性。
（竞争性）体外放射免疫分析基本原理*
c
c
Ag*
Ag
Ab
v
Ag*-Ab Ag-Ab
（竞争性）体外放射免疫分析基本原理*
反应可用下式表达
* Ag + Ab
Ag
* Ag—Ab Ag—Ab
（竞争性）体外放射免疫分析基本原理*
其基本原理是竞争免疫性结合（competitive binding）。
其基础是标记抗原(*Ag )和未标记抗原(Ag[被 测抗原、标准物])，与特异性抗体具有相同的 结合能力；且特异性抗体的量不足。
RIA的基本步骤
加
孵
分
测
数
放
据
射
处
样
育
离
性
理
质量控制 （Quality Control，QC）
反应误差关系（RER）: 整批误差指标 要求： RER<0.04
∑(A-B)
双管计数误差之和
RER=
=
√2 2
双管计数均值之和 ∑(A+B)/2
cv
2.评价RIA试剂盒质量－精密度
精密度图 由于测定值的精密度随剂量水平而变化，要求
2.评价RIA试剂盒质量－特异性
反映分析方法中所用抗体对被测物质的专一性。 常用交叉反应来表示。
2.评价RIA试剂盒质量－准确度
回收率：测定值/真值×100% 要求90%~110% 平行性反应（了解）
标准品与样品的剂量
2.评价RIA试剂盒质量－稳定性
试剂盒在合理保存条件下，分析试剂在有效期内的 性状稳定性。
（竞争性）体外放射免疫分析基本原理*
c
c
Ag*
Ag
Ab
v
Ag*-Ab Ag-Ab
（竞争性）体外放射免疫分析基本原理*
反应可用下式表达
* Ag + Ab
Ag
* Ag—Ab Ag—Ab
（竞争性）体外放射免疫分析基本原理*
其基本原理是竞争免疫性结合（competitive binding）。
其基础是标记抗原(*Ag )和未标记抗原(Ag[被 测抗原、标准物])，与特异性抗体具有相同的 结合能力；且特异性抗体的量不足。
RIA的基本步骤
加
孵
分
测
数
放
据
射
处
样
育
离
性
理
质量控制 （Quality Control，QC）
体外分析技术
体外分析技术体外分析技术是指在试管内进行反应从而测定某生物活性物质的超微量分析技术。
该类技术的特点是高灵敏度和高特异性，广泛用于临床和科学研究的很多领域。
应用最多的是：放射免疫分析、免疫放射分析、受体的放射配基结合分析及非放射性免疫分析。
第一节放射免疫分析一、原理放射免疫分析法 (radioimmunoassay,RIA) 的基本原理是，限量标记抗原[*Ag]和可变量的非标记待测抗原[Ag]与定量的特异抗体[Ab]发生竞争结合反应，通过测定复合物的放射性来计算出待测非标记抗原的量。
这一过程可用下式表示：*Ag + Ag + Ab [AgAb]* + [AgAb]上述式中，Ab的分子数少于*Ag，因此即使系统中没有Ag，仅有*Ag，当反应达到平衡时，绝大部分 (因为是可逆反应，不会是100%) Ab将形成*AgAb复合物。
如果系统中加入Ag，则Ag与*Ag竞争结合Ab，形成AgAb，*AgAb将减少。
Ag越多则*AgAb越少。
实践和理论推导都证明，*AgAb和Ag呈二次方程的函数关系，如以Ag为横坐标，*AgAb (B)或*AgAb 占加入总*Ag的% (B%)为纵坐标，是一条斜率逐步由大变小的下降曲线。
如以游离的*Ag (F)或游离*Ag占加入总*Ag的% (F%)为纵坐标，则是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。
也可以*AgAb/*Ag的比值 (R)为纵坐标，也是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。
分析中，首先以不同量的已知标准品Ag和定量*Ag及限量Ab进行竞争结合反应，得到以B或B%、F或F%、或R为纵坐标的剂量效应曲线 (也称标准曲线)，然后以未知样品测得的B或B%、F或F%、或R从曲线上查出相应的剂量。
二、试剂盒基本试剂试剂盒由国家批准的生产单位提供，提供RIA的主要试剂、操作方法、保存条件及保存期限。
使用者应按说明书的要求合理使用。
如果临床工作需要，使用者可以对试剂稀释度、操作步骤等进行适当修改，但应当对改变了的方案进行精密度、准确度、灵敏度等考核，并作详细记录。
核医学体外分析技术(68页).doc
核医学--体外分析技术
（四）分离方法的5个种类要熟记 分离的目的是放射免疫反应达到平衡 后，使抗原抗体复合物和游离抗体抗原分 开，分别测量其放射性。分离技术直接影 响分析结果的准确性，理想的分离技术应 具备既安全又迅速，不受其他因素干扰， 操作简便，重复性好等优点。
核医学--体外分析技术
1.双抗体法 是用抗原免疫动物产生相应的抗体作为第一 抗体，再以第一抗体为抗原免疫另一种动物，所 产生的抗体为第二抗体。第二抗体与第一抗体形 成的抗原抗体复合物结合后形成第二抗体复合物， 其分子量比第一抗体复合物大，可离心分离出来， 这种方法称为双抗体法（double antibody method）。 优点是：易分离、特异性强、使用方便。 不 足：易受其他因素干扰、成本高、操作时 间长。
核医学--体外分析技术
二、基 本 试 剂 放射免疫分析的反应中主要包括3种剂； 1、抗体（ Ab） 2、标记抗原（*Ag） 3、标准抗原（标准品）及试剂盒提 供分离试剂或材料，缓冲液及质量控制 （高、中、低值）用品等。
核医学--体外分析技术
(一) 抗体有3个条件必须满足 需要选择亲和力大、特异性强、滴度高的抗体。 1、抗原和抗体之间的结合能力和其牢固性称亲和力 （affinity），亲和力大者反应结合速度快，解离度小。 2、指抗体分别与相应抗原和抗原结构类似物结合能力 的比较，交叉反应越小，特异性（specificity）越强。 3、稀释倍数简称滴度，滴度（titer）越高，所需的抗 血清量越少，杂质干扰也越少。
90年代时间分辨技术 70年代酶(荧光)免疫技术 （EIA...FEIA）
50年代放免分析技术 （RIA）
（TRFIA）
核医学--体外分析技术
放射免疫分析技术（ra d ioimmunoassay,RIA）
第五章 体外分析技术
1968年Miles和Hales建立了免疫放射分析方法，利用标 记抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，故其 灵敏度比放射免疫分析法明显提高，而且标准曲线的测 量范围也明显扩大。
放射免疫分析
RADIOIMMUNOASSAY,RIA
Definition
是以抗原抗体的免疫反应 为基础，利用待测抗原与 定量的标记抗原同有限量 的特异性抗体竞争性结合， 以放射性测量为微量定量 手段，获得待测生物样品 中抗原浓度的技术。
Main methods
Ag + Ab + * Ag AgAb + Ag
*Ag + *AgAb
Main methods
放射性标记抗原与非标记抗原（包括标准抗原或待测抗原） 与有限量的特异性抗体发生可逆性竞争结合，形成抗原抗 体复合物。 反应体系中同时存在*Ag、Ag和Ab，而*Ag的量一定、Ab的 量固定，而且Ag+*Ag＞＞Ab时，随着Ag的增加，*AgAb的 量相应减少，即与Ag（包括标准抗原或待测抗原）的量呈 负相关。当反应达到平衡后，将反应体系中的标记抗原抗体复合物与游离的标记抗原分离，测定其放射性。以标 准抗原的浓度为横坐标，以标记抗原-抗体复合物的结合 率（B/T、B/F、或F/T）为纵坐标，绘制剂量反应曲线， 也称剂量效应曲线（calibration curve）。
Radiolabeled compounds
标记物
合适的核素标记（半衰期、射线类型、能量 等）,常用核素有125I和3H 标记物的用量要小，应等于或低于待测物的 最小量 足够的比活度 放化纯度高 免疫活性 稳定性好，贮存不易脱标
Specific binding reagent
体外分析技术讲义
B%=B/(B+F) F%=F/(B+F) R=B/F
RIA的基本原理示意图，原理是竞争性结合抑制反应
• 核医学（第9版）
2. 放射免疫分析加样流程
RIA加样程序（体积：µl）
试剂 标准品
NSB管 100（零标准品）
S0-S5标准管 100
样品管 —
质控管 —
质控血清
—
—
—
50
待测样本
—
—
100
—
• 核医学（第9版）
1. 酶标记免疫分析
酶标记免疫分析技术（EIA）中以酶联免疫吸附 法（ELISA）应用最广泛。
ELISA是用聚苯乙烯作微量反应板，酶标记抗 原或抗体，反应模式与RIA/IRMA相同，用酶替代了 125I，检测仪器是酶标仪。
常用的酶有：辣根过氧化物酶、碱化磷酸酶、 葡萄糖氧化酶。
20世纪50年代，放射免疫分析法的建立与临床应用，开创了微量物质检 测的新纪元。
• 核医学（第9版） 1. RIA的基本原理
特异性 抗体Ab
*Ag与Ag 免疫活性相同； 在一定的反应条件下； *Ag、Ab为恒定量； *Ag＋Ag > Ab。
Ag =* Ag , AgAb =*AgAb Ag > *Ag , *AgAb (B) *Ag(F) Ag < *Ag , *AgAb (B) *Ag (F)
125I-Ag
100
100
100
100
蒸馏水
100
—
—
—
抗体
—
ห้องสมุดไป่ตู้100
100
100
混匀，37℃温育1小时
分离试剂
500
500
《体外分析技术》课件
行业意义与价值
体外分析技术的发展不仅提 高了医疗诊断和药物研发的 效率，还对人类健康和食品 安全产生了积极的影响。
六、参考文献
• 文献1 • 文献2 • 文献3
《体外分析技术》PPT课 件
欢迎来到《体外分析技术》PPT课件！在本课程中，我们将介绍体外分析技术 的概念、应用和优缺点，以及其在医学、生物学和食品安全监测等领域的重 要性。
一、介绍体外分析技术
什么是体外分析技术
体外分析技术是指在体外环境下进行的生化分析方法和ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ验技术。
体外分析技术的主要用途
体外分析技术被广泛应用于医学诊断、药物筛选、生物学研究和食品安全监测等领域。
免疫荧光染色 法 （Immunofluo rescence staining）
利用荧光标记的抗体 在细胞或组织中检测 目标分子的方法。
质谱分析法 （Mass spectrometry）
一种用于分析样品中 化合物结构和组成的 分析技术。
三、体外分析技术的应用
1 医学诊断
体外分析技术在临床医学中被广泛应用于疾 病诊断、治疗监测和病原体检测等方面。
缺点
假阳性率高，可能会导致误诊和误判；限制性较大， 一些分析方法只适用于特定的样品类型；操作技术 要求高，需要专业人员进行分析和解读。
五、结论
体外分析技术的应用前 景
随着科技的进步和人们对健 康的关注，体外分析技术在 医学和生命科学领域的应用 前景非常广阔。
体外分析技术的发展方 向
未来的发展方向包括提高分 析方法的灵敏度和准确性， 开发更多适用于复杂样本的 分析技术。
体外分析技术的发展历程
体外分析技术经历了从传统的化学分析到现代的基于生物分子相互作用的分析方法的发展。
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2
第一节 放射免疫分析法 radioimmunoassay， RIA
1959年，美国的两位科学家Berson和 Yalow首次将示踪技术的高度灵敏性和免 疫学抗原-抗体结合的高度特异性结合起 来，创立了放射免疫分析技术，开创了 生物活性物质微量测定技术的新时代。 RIA 的特点：灵敏度高、特异性强、准 确度高、稳定性好。经不断改进，现在 广泛应用于临床检测和科学研究的很多 领域。
15
3）高滴度Fra bibliotek滴度 是抗体实际应用时的稀释倍数 抗体的滴度越高，其中的干扰物质 的影响就越小。 滴度的测定：以一定浓度的*Ag与稀释 度不同的抗体进行反应，当*Ag的结合 率为50%时对应的抗体的稀释度即为 该抗体的滴度。这时的抗体浓度就是 实际使用时的浓度。
16
（二）分离技术
22
4、特异性（specificity）是指该反应体 系不受干扰物质物质影响的程度。常用 的指标是交叉反应率。 5、稳定性（stability）是指测定试剂在 合理保存和正确使用条件下，在规定的 有效期内，保持其全部原有性能不变的 能力。常用指标有：零标准管结合率 （B0%≥20%）、非特异性结合率 （NSB%≤5%）、标准曲线上的质控指 标等。 6、有效性（effectivity）主要指临床诊 断符合率及临床使用评价，检测结果在 正常和异常之间有良好的区分，得出可 信的结论。 23
21
1、精密度（precision）是指在相同条件 下对某一样品多次检测所得结果的符合 程度，即复管的重复性，它是最重要的 质量参数。 常用精密度图来评价实验室 内部的精密度水平。 2、准确度（accuracy）是指测定值与真 值的接近程度，用回收率来评价，回收 率是反应测定值偏差的质控指标。 3、灵敏度（sensitivity）是指检测能与 零剂量区分的最小检测量。 累计10次测定结果，计算出零标准 管的结合率为X—2SD时对应的剂量值， 即为灵敏度。
第二节 免疫放射分析
immunoradiometric assay , IRMA
免疫放射分析技术是1968年由 Miles和Hales创立的，IRMA是 非竞争性体外放射分析技术的代 表。
24
一、基本原理
用放射性核素标记抗体作示踪剂， 在反应系统中加入过量的标记抗 体，抗原与标记抗体进行全量反 应，多余的抗体用一定的手段除 去，测定复合物的放射性，其活 度与待测抗原量正相关。
11
2、标记抗原
标记抗原是样品测量的基础 对标记抗原的要求是： 1）比活度和放射化学纯度必须足够 高——以保证分析的灵敏度 标记抗原的放化纯必须不小于95% 2）放射性核素的半衰期合适 3）标记抗原的生理活性未改变 4）标记抗原的应有较高的稳定性
12
3、抗体
在放射免疫分析中，抗体质量的好 坏是影响放射免疫分析的关键因素 之一。 高质量的抗体必须具备三个条件： 高亲和力、高特异性、高滴度
25
RIA和IRMA低剂量区的不确定因素 示意图
26
IRMA的标准曲线
27
IRMA的特点
1、属于非竞争性抗原抗体结合反 应； 2、抗原抗体复合物的与抗原的量 正相关 3、在低剂量区不会有不确定因素 4、IRMA的非特异性结合对低剂量 区的影响大
28
二、基本方法
1、双抗体夹心法 2、标记第三抗体法 3、生物素-亲和素系统的应用
29
30
31
RIA和IRMA的区别
项目 反应机制 反应试剂 分离方法 RIA 竞争性反应 抗原、标记抗原、抗体 只需一个抗原决定族 IRMA 非竞争性反应 抗原、 过量的标记抗体 需两个或两个以上抗 原决定族
复合物的放射 与待测抗原量呈负相关 性
NSB的影响 主要影响高剂量区
与待测抗原量呈正相 关
1、logit-log模型 2、四参数logistic模型： 3、四参数质量作用定律模型
18
三、质量控制
Quality Control , QC
（一）定义：质量控制 就是控制误差， 即对分析工作中的误差进行经常性的 检查，遇有质量异常则及时采取对策， 以保证分析误差控制在可接受的范围 内。 放射免疫分析是一类高灵敏度的超微 量分析技术，极易受各种因素的影响 而使检测结果失真，因此必须有严格 的质量控制体系。
19
（二）误差的来源
1、系统误差：这种误差表现为检测结 果呈倾向性的偏高或偏低，常有一些可 以确定的因素导致，如：量器不准、试 剂不纯、标准品的定量不准、仪器状态 不佳、分离效果不好、不适当的曲线拟 合模型等等，系统误差是通过努力可以 消除的。 2、随机误差：这种误差多由难以确定 且无法控制的原因引起，误差的出现是 随机的，由各种偶然因素造成，符合正 态分布，如量取液体或分离时的误差。
4
反应式
5
具体方法
用一系列浓度已知的标准抗原 （浓度递增的标准品）在严格相同的 条件下与一定量的*Ag和有限量的Ab共 同反应，反应达到平衡后，分离B与F， 测定B的放射性做为纵坐标，以每一反 应管的标准品浓度为横坐标，绘成标 准曲线。根据被测抗原试管中的B的 CPM值在标准曲线上求出该抗原的浓 度
主要影响低剂量区
32
20
（三）实验室内部质量控制
实验室内部质量控制侧重对检测质量 的控制，它保证从收集样本开始到发 出报告为止的全过程中，能及时发现 检测过程中出现的各种误差，分析产 生的原因，找出纠正的办法，以确保 检测的质量。 常用以下指标对检测结果做可靠性评 价：精密度、准确度、特异性、灵敏 度、稳定性、有效性
3
一、基本原理
放射免疫分析法的基本原理是竞争性抑制，被测量的 微量物质Ag（未标记抗原）和标记有放射性核素的该 种物质*Ag(标记抗原)对其抗体Ab有相同的结合能力， 在反应系统中， Ag和 一定量的*Ag竞争有限量的Ab， 反应遵循质量作用定律， 即Ag和 *Ag与Ab结合的量 取决于Ag和 *Ag的浓度比例。生成的*AgAb的量随Ag 的增加而减少，它们是负相关的关系，即Ag抑制*Ag 与Ab的结合，反之*Ag也抑制Ag与Ab的结合。反应达 到平衡后，分离*AgAb （B）与*Ag（F），B、F或 B/F与Ag的量呈函数关系，利用这一函数关系求出待 测抗原的的浓度。
6
函数式
7
标准曲线
8
得到的标准曲线之所以是曲线而不是直线， 这是可逆反应的质量作用定律决定的。函 数式见上图 根据放射免疫分析法的基本原理，建立放 射免疫分析必须具备以下技术条件： 1、可靠的标准品 2、高比活度的标记品 3、高亲和力的抗体 4、合适的分离技术 5、理想的曲线拟合方式
9
二、基本方法
（一）基本试剂
放射免疫分析反应需要三种基本试剂： 1、标准品（非标记标准抗原） 2、标记抗原 3、抗体
10
1、标准品
标准品是样品定量的基础，它的 质和量的变化直接影响待测样品的测 定值。 对标准品的要求如下： 1）标准品和待测样品应属于同一种物质； 2）在与抗体反应时，标准品和待测样品 应有相同的活性和亲和能力； 3）高度纯化，不含有影响分析的杂质； 4）对标准品的定量一定要精确
1、聚乙二醇（PEG）沉淀法 2、双抗体沉淀法 3、双抗体+PEG法 4、葡萄球菌A蛋白（SPA）沉淀法 5、活性炭吸附法：葡聚糖包被的活性炭 6、微孔滤膜过滤法：玻璃或醋酸纤维滤膜 7、磁化分离技术：氧化铁-活性炭（-抗体） 8、固相分离技术： 1）第一抗体与试管联接 2）第二抗体与试管联接
17
（三）数据处理
第五章 体外放射分析技术
In Vitro Radioassay
1
定义与分类
一、定义：体外放射分析技术是利用核射线 对体内的各种生物活性物质进行体外定量 分析的各种方法。 二、分类： 1、竞争性体外放射分析法（如RIA） 2、非竞争性体外放射分析法（如IRMA） 3、由体外放射分析技术派生出来的非放射 性标记免疫分析技术
13
1）高亲和力
只有高亲和力的抗体才能得到斜率 高的标准曲线，而斜率高的标准曲 线是高灵敏度和高精密度的必备条 件。亲和力测定方法最常用的是 Scatchard作图法（P36） KA值越大（即直线斜率越大）， 抗体的亲和力越大方法的灵敏度和 精密度越高
14
2）高特异性
抗体必须与反应系统中抗原以外的 物质尤其是抗原类似物结合得少， 以免影响分析结果 抗体特异性的测定： 方法：测抗体的交叉反应率 交叉反应率越小，抗体的特异性越 高
第一节 放射免疫分析法 radioimmunoassay， RIA
1959年，美国的两位科学家Berson和 Yalow首次将示踪技术的高度灵敏性和免 疫学抗原-抗体结合的高度特异性结合起 来，创立了放射免疫分析技术，开创了 生物活性物质微量测定技术的新时代。 RIA 的特点：灵敏度高、特异性强、准 确度高、稳定性好。经不断改进，现在 广泛应用于临床检测和科学研究的很多 领域。
15
3）高滴度Fra bibliotek滴度 是抗体实际应用时的稀释倍数 抗体的滴度越高，其中的干扰物质 的影响就越小。 滴度的测定：以一定浓度的*Ag与稀释 度不同的抗体进行反应，当*Ag的结合 率为50%时对应的抗体的稀释度即为 该抗体的滴度。这时的抗体浓度就是 实际使用时的浓度。
16
（二）分离技术
22
4、特异性（specificity）是指该反应体 系不受干扰物质物质影响的程度。常用 的指标是交叉反应率。 5、稳定性（stability）是指测定试剂在 合理保存和正确使用条件下，在规定的 有效期内，保持其全部原有性能不变的 能力。常用指标有：零标准管结合率 （B0%≥20%）、非特异性结合率 （NSB%≤5%）、标准曲线上的质控指 标等。 6、有效性（effectivity）主要指临床诊 断符合率及临床使用评价，检测结果在 正常和异常之间有良好的区分，得出可 信的结论。 23
21
1、精密度（precision）是指在相同条件 下对某一样品多次检测所得结果的符合 程度，即复管的重复性，它是最重要的 质量参数。 常用精密度图来评价实验室 内部的精密度水平。 2、准确度（accuracy）是指测定值与真 值的接近程度，用回收率来评价，回收 率是反应测定值偏差的质控指标。 3、灵敏度（sensitivity）是指检测能与 零剂量区分的最小检测量。 累计10次测定结果，计算出零标准 管的结合率为X—2SD时对应的剂量值， 即为灵敏度。
第二节 免疫放射分析
immunoradiometric assay , IRMA
免疫放射分析技术是1968年由 Miles和Hales创立的，IRMA是 非竞争性体外放射分析技术的代 表。
24
一、基本原理
用放射性核素标记抗体作示踪剂， 在反应系统中加入过量的标记抗 体，抗原与标记抗体进行全量反 应，多余的抗体用一定的手段除 去，测定复合物的放射性，其活 度与待测抗原量正相关。
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2、标记抗原
标记抗原是样品测量的基础 对标记抗原的要求是： 1）比活度和放射化学纯度必须足够 高——以保证分析的灵敏度 标记抗原的放化纯必须不小于95% 2）放射性核素的半衰期合适 3）标记抗原的生理活性未改变 4）标记抗原的应有较高的稳定性
12
3、抗体
在放射免疫分析中，抗体质量的好 坏是影响放射免疫分析的关键因素 之一。 高质量的抗体必须具备三个条件： 高亲和力、高特异性、高滴度
25
RIA和IRMA低剂量区的不确定因素 示意图
26
IRMA的标准曲线
27
IRMA的特点
1、属于非竞争性抗原抗体结合反 应； 2、抗原抗体复合物的与抗原的量 正相关 3、在低剂量区不会有不确定因素 4、IRMA的非特异性结合对低剂量 区的影响大
28
二、基本方法
1、双抗体夹心法 2、标记第三抗体法 3、生物素-亲和素系统的应用
29
30
31
RIA和IRMA的区别
项目 反应机制 反应试剂 分离方法 RIA 竞争性反应 抗原、标记抗原、抗体 只需一个抗原决定族 IRMA 非竞争性反应 抗原、 过量的标记抗体 需两个或两个以上抗 原决定族
复合物的放射 与待测抗原量呈负相关 性
NSB的影响 主要影响高剂量区
与待测抗原量呈正相 关
1、logit-log模型 2、四参数logistic模型： 3、四参数质量作用定律模型
18
三、质量控制
Quality Control , QC
（一）定义：质量控制 就是控制误差， 即对分析工作中的误差进行经常性的 检查，遇有质量异常则及时采取对策， 以保证分析误差控制在可接受的范围 内。 放射免疫分析是一类高灵敏度的超微 量分析技术，极易受各种因素的影响 而使检测结果失真，因此必须有严格 的质量控制体系。
19
（二）误差的来源
1、系统误差：这种误差表现为检测结 果呈倾向性的偏高或偏低，常有一些可 以确定的因素导致，如：量器不准、试 剂不纯、标准品的定量不准、仪器状态 不佳、分离效果不好、不适当的曲线拟 合模型等等，系统误差是通过努力可以 消除的。 2、随机误差：这种误差多由难以确定 且无法控制的原因引起，误差的出现是 随机的，由各种偶然因素造成，符合正 态分布，如量取液体或分离时的误差。
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反应式
5
具体方法
用一系列浓度已知的标准抗原 （浓度递增的标准品）在严格相同的 条件下与一定量的*Ag和有限量的Ab共 同反应，反应达到平衡后，分离B与F， 测定B的放射性做为纵坐标，以每一反 应管的标准品浓度为横坐标，绘成标 准曲线。根据被测抗原试管中的B的 CPM值在标准曲线上求出该抗原的浓 度
主要影响低剂量区
32
20
（三）实验室内部质量控制
实验室内部质量控制侧重对检测质量 的控制，它保证从收集样本开始到发 出报告为止的全过程中，能及时发现 检测过程中出现的各种误差，分析产 生的原因，找出纠正的办法，以确保 检测的质量。 常用以下指标对检测结果做可靠性评 价：精密度、准确度、特异性、灵敏 度、稳定性、有效性
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一、基本原理
放射免疫分析法的基本原理是竞争性抑制，被测量的 微量物质Ag（未标记抗原）和标记有放射性核素的该 种物质*Ag(标记抗原)对其抗体Ab有相同的结合能力， 在反应系统中， Ag和 一定量的*Ag竞争有限量的Ab， 反应遵循质量作用定律， 即Ag和 *Ag与Ab结合的量 取决于Ag和 *Ag的浓度比例。生成的*AgAb的量随Ag 的增加而减少，它们是负相关的关系，即Ag抑制*Ag 与Ab的结合，反之*Ag也抑制Ag与Ab的结合。反应达 到平衡后，分离*AgAb （B）与*Ag（F），B、F或 B/F与Ag的量呈函数关系，利用这一函数关系求出待 测抗原的的浓度。
6
函数式
7
标准曲线
8
得到的标准曲线之所以是曲线而不是直线， 这是可逆反应的质量作用定律决定的。函 数式见上图 根据放射免疫分析法的基本原理，建立放 射免疫分析必须具备以下技术条件： 1、可靠的标准品 2、高比活度的标记品 3、高亲和力的抗体 4、合适的分离技术 5、理想的曲线拟合方式
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二、基本方法
（一）基本试剂
放射免疫分析反应需要三种基本试剂： 1、标准品（非标记标准抗原） 2、标记抗原 3、抗体
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1、标准品
标准品是样品定量的基础，它的 质和量的变化直接影响待测样品的测 定值。 对标准品的要求如下： 1）标准品和待测样品应属于同一种物质； 2）在与抗体反应时，标准品和待测样品 应有相同的活性和亲和能力； 3）高度纯化，不含有影响分析的杂质； 4）对标准品的定量一定要精确
1、聚乙二醇（PEG）沉淀法 2、双抗体沉淀法 3、双抗体+PEG法 4、葡萄球菌A蛋白（SPA）沉淀法 5、活性炭吸附法：葡聚糖包被的活性炭 6、微孔滤膜过滤法：玻璃或醋酸纤维滤膜 7、磁化分离技术：氧化铁-活性炭（-抗体） 8、固相分离技术： 1）第一抗体与试管联接 2）第二抗体与试管联接
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（三）数据处理
第五章 体外放射分析技术
In Vitro Radioassay
1
定义与分类
一、定义：体外放射分析技术是利用核射线 对体内的各种生物活性物质进行体外定量 分析的各种方法。 二、分类： 1、竞争性体外放射分析法（如RIA） 2、非竞争性体外放射分析法（如IRMA） 3、由体外放射分析技术派生出来的非放射 性标记免疫分析技术
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1）高亲和力
只有高亲和力的抗体才能得到斜率 高的标准曲线，而斜率高的标准曲 线是高灵敏度和高精密度的必备条 件。亲和力测定方法最常用的是 Scatchard作图法（P36） KA值越大（即直线斜率越大）， 抗体的亲和力越大方法的灵敏度和 精密度越高
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2）高特异性
抗体必须与反应系统中抗原以外的 物质尤其是抗原类似物结合得少， 以免影响分析结果 抗体特异性的测定： 方法：测抗体的交叉反应率 交叉反应率越小，抗体的特异性越 高