(精品)核医学课件：体外分析技术

(FIA)
胶体金标记分析技术
(CGIA)
第一节 放射免疫分析 (radioimmunoassay，RIA)
放射免疫分析技术是核医 学中建立最早、应用最广泛的 体外放射分析技术
Yalow
Berson
发展史
1959年，美国学者Yalow 和Berson 创立了放 射免疫分析技术，并首先用于糖尿病人血浆 中胰岛素含量的测定。这是医学和生物学领 域中方法学的一项重大突破，开辟了医学检 测史上的一个新纪元。
量B、F的cpm
*Ag
B%=B/(B+F)
Ag 1
2
3
4
5 6？
25 50 100 200 400 800
B%
B% 标准曲线
常 用 的 反 应 参 数 有 B%，B/F，F/B、 F%等这些反应变量都可以用作纵坐标来对 应标准抗原的浓度作标准曲线，选用的反应 变量不同，标准曲线的形状也不同。但是这 些标准曲线都是反映的反应变量对应标准抗 原浓度变化而变化的函数关系。
标准抗原(标准品)是厂家在试剂盒中提供的已知 剂量的非标记抗原。
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标准曲线的绘制方法
用一系列已知浓度的标准抗原和一定量的标记抗原 在一定条件下同限量的特异性抗体进行反应；
在反应达到平衡后，利用适当的分离方法分离B和F 分别测量B和F的放射性计数； 用反应变量（如B/(B+F)）作为纵坐标，反应剂量
B%
标准曲线
未知样品的测量
➢ 在同等条件下，用待测抗原与一定量的标记 抗原和限量特异性抗体发生反应，并用同样 的方法分离待测抗原的B和F，测量其放射性 （cpm），计算出B/(B+F)，在剂量反应曲线 上就可以查出对应的抗原浓度。
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B1% B2% B3% B4% B5% B6% B%
Ab
分离B、F,测
Ag + *Ag + Ab ++
+
+
++
*AgAb + AgAb + *Ag +Ag
+
+
+
+
+
+
++
+
+
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标准曲线
*Ag-Ab复合物与Ag（被测物）之间的函数关系
可以用标准曲线来表示。标准曲线是用一系列标 准抗原反应而绘制出来的。
标准曲线是放射免疫分析的定量的基础，是衡量
物质浓度的客观尺度
5.固相分离法
它是将抗体或抗原通过物理吸附或化学结 合的方式联接在固相载体上免疫反应在固 相载体上完成，达到平衡后形成固相的抗 原-抗体复合物（B）,使其与F分离。
此方法的优点是操作简便、快捷，不用离 心，且分离效果好。
不足是抗体活性的回收率低，灵敏度会受 影响
(五)标记核素及放射性测量仪器
体外分析技术
(in vitro analysis techniques)
概述
体外分析技术： 广义地讲，它是泛指以离体组 织、血液或体液等作为生物样 本，在人体外进行的、分析样 本中成分或含量的检测技术
具体在核医学中体外分析技术是指在体 外利用放射性核素标记配体（ligand） 为示踪剂，以结合反应为基础，在试管 内或反应杯内进行的检测微量生物活性 物质的标记免疫分析技术。
二、基本试剂
1.抗体 2.标记抗原 3.标准抗原（标准品）
2、标记抗原
1）比活度
比活度——每微克抗原上标记放射性核素的千贝 可数（KBq/μg）比活度要求足够高
2）放射化学纯度
放化纯度——具有免疫活性的标记抗原占总放射 性的百分数。 应>90%。
3）免疫活性是指保持原有抗原的特性
从标记到使用的全过程中各种因素都会造成标记 抗原的免疫活性下降，与抗体的结合力下降
* Ag
基本反应式
Ag-Ab
*Ag:标记抗原，Ag 非标记抗原 Ab：抗体 *Ag- Ab 标记抗原抗体复合物 Ag- Ab 非标记抗原抗体复合物
Ag-Ab+Ag
条件：1.*Ag与Ag 免疫活性相同
2. *Ag与Ab 恒量
*Ag-Ab+*Ag
3.*Ag＋Ag > Ab
（B） (F)
分析原理
*Ag与Ag由于免疫化学性质一致，共同竞争 性与Ab结合，当*Ag和Ab的量保持恒定， *Ag与Ag之和大于Ab时，则*Ag-Ab复合物的 形成受Ag含量的制约，二者之间存在函数关 系 ， 即 Ag 量 越 大 ， *Ag-Ab 量 越 小 ； Ag 量 越 小，*Ag-Ab量越大；测定*Ag-Ab或*Ag量即 可推算出被测Ag量
IQC内容包括
1.零标准管结合率（B0） 即最大结合率，当标准 抗原为零时标记抗原与抗体的结合率，一般要求 在30%-50%,该指标主要反映特异性抗体的质量是 否稳定。
2.非特异性结合率(NSB%)是指不加特异性抗体时标 记抗原与非特异物质的结合率，一般要求<5%10%。NSB%增高，测定结果的假阳性率增高。
目的：是对整个分析过程中的任何环节造成 的误差进行经常性的检查，以保证分析误差 控制在可接受的的范围内。
质 量
实验室内质量控制 （室内质控，IQC）
控 制
实验室间质量评价 （室间质评）
（一）室内质量控制 （internal quality control，IQC）
是保证从采集样品开始到发出报告的全过程 能及时发现检测过程中出现的各种误差，分 析发生原因，实施修正办法，以确保结果的 准确性
作为横坐标（即一系列标准抗原）作一条曲线，就 得到不同浓度的标准抗原对反应变量的竞争抑制曲 线，这就是标准曲线。
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B1% B2% B3% B4% B5% B6%
Ab
分离B、F，分别
测量B、F的cpm
*Agwk.baidu.com
B%=B/(B+F)
F%=F/(B+F)
R=B/F
Ag 1
2
3
4
5
6
浓度 25 50 100 200 400 800
判断失控的标准是质控规则，WHO要求在 一次实验中，有下列情况之一者，其结 果应予舍弃：① 三种QCS中有一个测定
值＞3s；② 三种QCS中在同一方向上有 两种＞2s；③ 三种均在同一方向上＞1s
。失控后，需查找原因，待纠正后重新 检测该批样本，原有检测结果不能发出
（二）RIA质量控制常用指标
1、精密度（repeatability）：
6.质控品 是指专门用于质量控制目的的标本或 溶液，不能用于校准，分定值和不定值两种
7、质控图
根据药盒给出的或连 续测定20次高、中、 低三种已知浓度的质 控品所求出的各自 的均数±标准差
（x±s），画出均数
线与两个标准差的范 围，将以后每次实验 测定的高、中、低值 标在图上，即为质控 图。
8、失控的判断
分类:
放射性竞争 结合分析
放射免疫分析
(radioimmunoassay, RIA)
体外放射分析
体
放射性非竞 免疫放射分析
外
争结合分析 (immunoradiometric
分
assay, IRMA)
析
酶标记免疫分析
技
(EIA)
术
化学发光免疫分析技术
(CLIA)
体外非放射分析
时间分辨荧光免疫分析技术
3.最低浓度管和最高浓度管的结合率之差 应大于30%
4.标准曲线连线回归的参数 包括截距a、斜 率b和相关系数r是标准曲线的主要质控指 标，要求a、b值稳定，r ＞ 0.99。
5.ED25、ED50、ED75 指标准曲线的结合率在 25%、50%和75%时对应的抗原浓度值，它反映 标准曲线的稳定性，有助于批间结果的比较。
3.标准抗原（标准品）
是厂家给出已知剂量的非标记抗原。一 般每一个RIA试剂盒里都有浓度由小到大 的多瓶标准抗原。 要求：
化学结构、免疫活性与被测抗原相同
放射化学纯度高 定量精确
（四）分离方法
分离方法的要求：
➢ 分离完全、快速。
➢ 不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过 程中不使抗原-抗体复合物解离或形成新的复 合物。
标准曲线
目前已普遍采用计算机进行数据处 理，自动绘制标准曲线，自动换算 样品中被测物质的浓度
实验操作基本步骤
1.加样：加样总体积要保持一致，所处的介质环境 也要一致。
2.孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间 不同，一般是37℃。
3.分离：选择好的分离方法分离游离抗原和 抗原－抗体复合物。 4.测量：测量游离或结合物部分的放射性。 5.数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算
常用标记核素 125I：γ射线，半衰期60天 3H：β射线 半衰期12.3年 测量仪器 γ计数器 β液体闪烁计数器 目前应用最多的标记核素是125I
三、RIA的质量控制
放射免疫测定是一种超微量分析方法，样 品量甚微，反应环节多，干扰因素多，易 出现误差，所以必须进行质量控制。
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质量控制（quality control,QC)就是利用科 学的方法对测定结果进行控制，以达到规定 的质量标准。
6.健全性 也称为可靠性，是评价标准品与 被测物的免疫活性是否相同。
（三） 室间质量评价(external quality assessment,EQC）
EQC是由市、省或国家临检中心按预先规定的 条件由多家实验室对相同样本进行检测，收 集检测结果进行分析评价，再反馈给参评科 室以评价实验室的操作过程。是为实验室确 保维持较好的检测水平对其能力进行考核、 监督和确认的一种验证活动。
3、准确度（accuracy）
指测定值与已知真实值的符合程度。可用回 收率来表示：回收率%＝测定值/真实值 ×100%，准确度一般要求达到90%-110%。
4、特异性（specificity）
RIA法的特异性主要取决于抗体的特异性， 交叉反应越小，特异性越好。
5.稳定性 指试剂盒在适宜的保藏条件下， 在有效期内保持原有性能不变的能力。
1977年，这项技术的发明者Yalow分享了诺 贝尔医学与生理学奖。
一、基本原理
是在体外条件下，利用非标记抗原（ Ag） 与定量的标记抗原（* Ag）对限量的特异 性抗体（Ab）发生可逆性竞争性结合反应 ，通过测定放射性复合物的量来计算出非 标记抗原（ Ag）量的一种超微量检测技术
Ag+Ab
Ag+Ab +
体外放射分析技术是核医学不可缺少的重 要组成部分，利用体外分析技术检测体内 超微量生物活性物质的变化，已经广泛应 用于疾病的早期诊断、治疗决策、疗效评 估、和预后判断，以及应用于分子生物学 、细胞生物学和分子药理学等医学基础研 究
优点
灵敏度高 特异性强 重复性好 准确度高 操作简便 应用范围广
基本原理
Ag + *Ab
Ag-*Ab + *Ab
（B）
（F）
在体外条件下, 利用Ag与过量的*Ab的非竞争性结合
反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag 量的
一种超微量分析技术。
二、实验方法
1.双抗体夹心法 2.标记第三抗体法 3.双标记抗体法
IRMA的优点：反应速度快、灵敏度高、特异 性强、稳定性好
3.双抗体法+沉淀法
此方法取双抗体法和沉淀法两者的优点，易 分离、速度快、特异性强、价格低廉、使用 方便、弥补了操作时间长等不足。
4.吸附分离法
应用特殊处理的吸附剂，可吸收小分子物质, 而大分子的抗原-抗体复合物则在反应液中， 经离心使B和F分离。吸附法简单快速，经济 易得，但非特异性结合偏高，缺乏专一性， 干扰因素多。
精密度又称重复性，指同一样品在多次重复 测定中所得结果的一致性。一般用变异系数 （CV）来表示,RIA要求批内CV应小于5%，批 间CV应小于5%-10%
主要反映随机误差的大小
2、灵敏度（sensitivity）：
RIA的灵敏度是指能够测定的可以用统 计学方法可以与零剂量管相区别的最 小量，即该RIA方法的最小可检测量。
第二节 免疫放射分析 （immunoradiometric assay,IRMA）
1968年由Miles和Hales创立免疫放射分析
一、基本原理
免疫放射分析是一种非竞争性的抗原抗体 反应，是用过量的放射性标记抗体来测定 样品中的抗原，其中标记抗体是过量的， 抗原全部是非标记的。
将放射性核素标记在抗体上，用过量的抗 体与抗原结合，反应平衡后，用分离方法 除去多余的抗体，测量抗原-标记抗体复合 物的放射性。利用抗原-标记抗体复合物的 放射性活度与抗原剂量之间的函数关系来 测定待测抗原的量
➢ 受环境因素（温度、PH值等）的影响小。
➢ 操作简便，分离剂来源丰富、价廉。
1.双抗体法
本方法的优点是:易分离，特异性强, 使用方便。 不足是：易受其他因素干扰，成本高
，操作时间长。
2.沉淀法
利用某些中性盐和有机溶剂在一定条件下，能 使蛋白质沉淀的特性。在不影响F的情况下使B 沉淀，其目的是使B和F分离。 沉淀法的优点：分离速度快，价格便宜。 不足：分离效果易受温度、PH、蛋白质含量、 试剂浓度等因素影响，非特异性结合较高。