课题3 分解纤维素的微生物的分离
课题3 分解纤维素的微生物的分离
课题3 分解纤维素的微生物的分离课题背景纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。
植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。
地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%～60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。
对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。
而要研究这些微生物，首先要将它们从土壤中种类众多的微生物中分离出来。
在本课题中，我们将探讨如何分离土壤中能够分解纤维素的微生物。
基础知识（一）纤维素与纤维素酶棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物（图2-11），此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。
许多商品纤维素都是由天然纤维素制得的，如水溶性的羧甲基纤维素钠（ CMC-Na ）、不溶于水的微晶纤维素（Avicel ）等。
纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
正是在这三种酶的协同作用下，纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养，同样，也可以为人类所利用。
下面我们通过一个小实验来体会纤维素酶的作用。
在2支20 mL的试管中，分别放入1 cm×6 cm的滤纸条，再分别加入pH为4.8、物质的量浓度为0.1 mol/L的醋酸—醋酸钠缓冲液10 mL、11mL。
在加入10 mL缓冲液的试管中加入 1 mL纤维素酶（70~80 U/mL ）。
将2支试管固定在50 mL的锥形瓶中，在摇床上以140 r/min的转速振荡反应1h，观察结果。
你也可以用报纸、复印纸做这个实验。
如果没有摇床，你可以采用定时人工振荡的方法。
时间足够长时，你会观察到滤纸被完全分解（图2-12）。
1U表示1个酶活力单位，是指在温度为25℃，其他反应条件，如pH等，均为最适的情况下，在1 min内转化1 mmol的底物所需的酶量。
人教版 高中生物 选修一 专题二 课题3 分解纤维素的微生物的分离
【情景创设】纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，大量存在于植物的根茎叶等器官中。
地球上40%-60%的纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。
人们要想利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等，就需要对这些微生物进行研究与应用，而要研究这些微生物，首先要将它们从土壤中种类众多的微生物中分离出来。
本课题中，我们就将探讨如何分离土壤中能够分解纤维素的微生物。
【问题设计】1、回顾纤维素的相关知识，说说纤维素酶的组成及作用。
2、筛选纤维素分解菌的原理是什么？3、说说分离分解纤维素的微生物的实验流程，回答P28旁栏思考1.4、简述采集土样的要求，回答P28旁栏思考2、3。
5、如何进行选择培养？结合P29“操作提示（二）”回答楷体字“资料二”相关问题及右栏思考2.6、常用的刚果红染色法有哪些？回答右栏思考1。
【达标检测】（必做）1. 纤维素酶能够分解（ ）A ．纤维素的微生物B ．淀粉的微生物C ．纤维素D ．淀粉2. 刚果红能与哪项物质形成红色复合物( )A ．纤维二糖B ．纤维素C ．葡萄糖D ．麦芽糖3. 寻找纤维素分解菌应到…（ ）A ．湿润的环境中B ．富含纤维素的环境中C ．富含无机盐的环境中D ．池塘中4. 纤维素分解菌的选择培养基有选择作用，原因在于其含有…( )A ． NaNO3B ．KClC ．酵母膏D ．纤维素粉5. 下列哪种生物能产生纤维素酶( )A.纤维素分解菌 B ．牛 C ．羊 D ．兔【使用时间】 第 3 周 第 2 课时 【编辑】李玲珍 刘萍萍 【审核】刘萍萍 【主题】 专题二 课题3 分解纤维素的微生物的分离 2012.02.256.刚果红染色时，加入刚果红可在……( )①制备培养基时②梯度稀释时③倒平板时④涂布时⑤培养基上长出菌落时A．①③ B．②⑤ C．③⑤ D．④⑤7.两种刚果红染色法的结果是（）A．均会出现透明圈 B均不会出现透明圈C方法一出现方法二不出现 D方法一不出现方法二出(选做)有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些微生物的研究，使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。
专题2课题3分解纤维素的微生物的分离
(3)某些商品纤维素 ①水溶性的羧甲基纤维素钠(CMCNa)； ②不溶于水的微晶纤维素(Avicel)。 2．纤维素酶 复合酶 ，包括三种组 (1) 组成：纤维素酶是一种 _________ 葡萄糖苷酶 分，即C1酶、Cx酶、________________ 。 (2)作用：C1酶和Cx酶使纤维素分解成_________ 纤维二糖 ； 葡萄糖苷酶 将纤维二糖分解为葡萄糖。 _____________ 二、纤维素分解菌的筛选 1．方法：刚果红染色法，常用的有两种：一种是 微生物，再加入刚果红进行___________ 颜色反应 ， 先培养______ 另一种是在倒平板时就加入刚果红。
关于分解纤维素的细菌的分离和纯
)
化操作的叙述中，下列正确的是(多选)(
A．在地表下面10米深处的土壤中取样
B．要用只含有纤维素有机营养的选择液体培养
基进行选择培养
C．要用酚红培养基进行进一步鉴定
D．要进行稀释涂布平板法进行接种
解析：选 BD。从土壤中分离纤维素分解菌时， 取的土样要在枯枝败叶比较多的地方，并且要 取土壤 3 ～ 8 厘米深的表层土，太深的土壤中纤 维素很少，细菌数量也很少；而用含有纤维素 的液体培养基培养的目的是使得纤维素分解菌 被选择出来并加以“浓缩”；为了进一步分离 纯化细菌，就要进行稀释涂布接种，以得到单 个细菌长出来的菌落；最后纤维素分解菌的进 一步鉴定用的是发酵产纤维素酶的实验，酚红 培养基是用来进行尿素分解菌的鉴定。
成分
含量
纤维素粉
NaNO3
5g
1g
Na2HPO4· 7H2O
KH2PO4
1.2g
0.9g
MgSO4· 7H2O
KCl
0.5g
0.5g
课题3__分解纤维素的微生物的分离
一、基础知识
㈠纤维素与纤维素酶
纤维素的组成、分布、应用？ 1、纤维素的组成、分布、应用？
纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物， 纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物， 葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物 是含量最丰富的多糖类物质。 多糖类物质 是含量最丰富的多糖类物质。 其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。 棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物 其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。
2、纤维素酶的组成及作用？ 纤维素酶的组成及作用？
纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种 纤维素酶是一种复合酶， 组分， 组分，即C1酶、 CX酶和葡萄糖苷酶 纤维素 Cx酶 C1酶、Cx酶 纤维二糖 葡萄糖苷酶 葡萄糖
土壤中某些微生物能够产生纤维素酶, 土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把纤 维素分解为葡萄糖，后再利用。 维素分解为葡萄糖，后再利用。
3、小实验：体会纤维素酶的作用(对照实验) 小实验：体会纤维素酶的作用(对照实验)
醋酸—醋 醋酸 醋 试 滤纸条： 滤纸条： 管 酸钠缓冲 1cm× 1cm×6c 编 液： m 号 0.1mol/L 1 号 滤纸条 11ml 试 管 2 号 滤纸条 10ml 试 管 纤维 观察 素酶： 素酶： 记录 （70 结果 80U） -80U） 2支试管固定在 滤纸 50ml的锥形瓶中 未被 的锥形瓶中， 不加 50ml的锥形瓶中， r/min转速 140 r/min转速 分解 振荡反应 1h （如无摇床可以 滤纸 1ml 采用定时人工振 被分 解 荡的方法） 荡的方法）
CMCCMC-Na 5~10g (水溶性羧甲基纤维素钠 水溶性羧甲基纤维素钠) 水溶性羧甲基纤维素钠 酵母膏 KH2PO4 土豆汁 琼脂 1g 0.25g 100mL 15g
专题二 课题3 分解纤维素的微生物的分离
（二）纤维素分解菌的筛选 。 1、筛选方法： 筛选方法： 2、筛选纤维素分解菌的原理 刚果红是一种染料，它可以与像 刚果红是一种染料， ， 这样的多糖物质形成 ，但并 不和水解后的 和 发生这 种反应。 种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加 入刚果红时， 入刚果红时，培养基中会出现以 为 中心的 。这样，我们就可以通过 这样， 圈来筛选 。
链接高考
2009年40.【生物 选修1 2009年40.【生物——选修1生物技术实践】（15分） 选修 生物技术实践】 15分 在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外， （1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外， 温度 还要考虑______ ______和渗透压等条件。 ______、______和渗透压等条件 还要考虑______、酸碱度 和渗透压等条件。由于该细菌 易培养 具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、______、 具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、______、 生活周期短 ______等优点 因此常作为遗传学研究的实验材料。 等优点， ______等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。 在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染， （2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染， 灭菌 需对培养基和培养皿进行________ 消毒、灭菌）； ________（ ）；操 需对培养基和培养皿进行________（消毒、灭菌）；操 消毒 作者的双手需要进行清洗和______ ______； 作者的双手需要进行清洗和______；静止空气中的细菌 可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性， 可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还 损伤DNA DNA的结构 损伤DNA的结构 __________。 能__________。
实验设计
1.实验流程 1.实验流程
课题3 分解纤维素的微生物的分离
方法二 配制质量浓度为 10 mg/mL 的 CR 溶液→灭菌→按照每 200 mL 的培养基加入 1 mL 的比 例加入 CR 溶液→混匀→倒 平板→接种后培养→出现透 明圈 倒平板时就加入刚果红
NaCl溶液的作用： 漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红， 以免出现的透明圈不够清晰。
两种方法的优点与不足
【一】土壤取样
〖思考题〗将滤纸埋在土壤中有什 么作用？你认为滤纸应该埋进土壤 多深？ 人工设置适宜环境，使纤 维素分解菌相对聚集。将纸埋 于深约10cm的腐殖土壤中。
培养基成分分析
培养基组成 纤维素粉 葡萄糖 5g NaNO3 1g KCl 0.5g Na2HPO4· 7H2O 1.2g KH2PO4 0.9g MgSO4 · 7H2O 0.5g 酵母膏 水解酪素 0.5g 0.5g 提供主要的营养物质 碳源（能源） 氮源、无机盐 无机盐 生长因子、氮源、 碳源（极少） 氮素、生长因子 水
种类、作用
刚果红染色 富含纤维素土壤 增大分解菌含量 染色鉴别
土壤取样 选择培养 涂布培养
纯化培养
分离出分解菌
14．下表为纤维素分解菌的鉴别培养基配方，请设计试验 测定培养基用于鉴定纤维素分解菌的最适pH。 CMC-Na 酵母膏 KH2PO4 琼脂 5-10g 1g 0.25g 15g 土豆汁 100mL 蒸馏水 1000mL
专题2 课题3
微生物的培养与应用
分解纤维素的微生物的分离
主要成分 -------纤维素
替代石油能源的生物燃料-----纤维素
草中含有纤维素
课题3 分解纤维素的微生物的分离
【学习目标】
知识与技能 1、简述纤维素酶的种类及作用。 2、掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术。 过程与方法 1、分析分离分解纤维素的微生物的实验流程。 2、掌握实验操作的原理。 情感、态度与价值观 1、通过自主设计、完成实验，培养勇于探究的科学精 神。 2、通过了解土壤中能分解纤维素的微生物在保护环境 中的作用，增强社会责任感。
课题3 分解纤维素的微生物的分离
课题3 分解纤维素的微生物的分离知识梳理1.纤维素与纤维素酶：(1)纤维素：一种由首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的类物质。
①组成：纤维素的基本组成单位是_______,是地球上含量最丰富的_____类物质。
②分布：主要分布在植物的___________等器官。
_____是自然界中纤维素含量最高的天然产物,此外,木材、作物秸秆等也富含纤维素。
③种类：除___________外,还有水溶性的羧甲基纤维素钠、不溶于水的微晶纤维素等。
(2)纤维素酶：是一种酶，包括酶、酶和酶三种组分。
纤维素酶的作用：纤维素纤维二糖葡萄糖纤维素酶也具有专一性,只能分解纤维素。
纤维素酶发挥作用需要温和的条件,包括适宜的温度和pH等。
2.纤维素分解菌的筛选：(1)方法：染色法（方法一：先培养_____________，再加入刚果红进行颜色反应；方法二：在_______时就加入刚果红）。
(2)原理：纤维素 + 刚果红→纤维素一刚果红红色复合物纤维素分解,红色复合物无法形成（红色_______）→出现以___________为中心的透明圈。
(3)培养基：以为唯一碳源的选择培养基。
（纤维素分解菌的选择培养基中的碳源并不只有纤维素,其中酵母膏和水解酪素也可起碳源的作用。
）3.实验流程土壤取样：选择富含的环境选择培养：用富含_____________的选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度：制备系列稀释液涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上，挑选产生的菌落4.课题延伸(1)为确定透明圈内的菌落是否是纤维素分解菌,需要进行________________的实验,方法有液体发酵和固体发酵两种。
(2)纤维素酶的测定方法,一般是对纤维素酶分解_____等纤维素后所产生的_______进行定量测定。
问题探讨1.为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌?________________________________________________________________________________ 2.为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物?________________________________________________________________________________ 3.纤维素分解菌的选择培养为什么要用液体培养基?________________________________________________________________________________ 4.培养基中出现透明圈一定是纤维素分解菌的作用吗?________________________________________________________________________________高考题2.(2014·新课标全国卷Ⅰ·T39)植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。
课题3 分解纤维素的微生物的分离
课题3 分解纤维素的微生物的分离核心知识要点1．纤维素酶(1)组成：纤维素酶是一种复合酶，它包括C 1酶、C X 酶和葡萄糖苷酶。
(2)作用2．菌种筛选(1)方法：刚果红染色法。
(2)原理 纤维素分解菌↓⎭⎪⎬⎪⎫刚果红纤维素→红色复合物――→纤维素酶红色消失、出现透明圈。
即：使用以纤维素为唯一碳源的选择培养基，根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
3．筛选流程土壤取样：富含纤维素的环境选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的数量梯度稀释涂布平板：将样品涂布于含CR 的鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落：产生纤维素酶的菌落周围出现透明圈【重难详解】1．微生物的鉴别方法(1)菌落特征鉴别法：根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别。
(2)指示剂鉴别法：如以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素。
(3)染色鉴别法：如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解纤维素的微生物。
2．筛选微生物的三种方法(1)单菌落挑取法：利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物。
(2)选择培养法：利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物。
(3)鉴定培养法：利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物。
3.两种刚果红染色法的比较4．筛选微生物的两个实例比较1.植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。
回答下列问题：(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将________分解成________。
(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成________色复合物。
用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。
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培养基的制备参照课本旁栏中的比例配 制。在250 mL锥形瓶中装入30 mL培养基， 用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外 包裹两层包装纸（或报纸），用线绳扎紧，在 121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。 选择培养的操作：称取土样20 g，在无 菌条件下加入装有30 mL培养基的摇瓶中。将 摇瓶臵于摇床上，在30 ℃下振荡培养1～2 d， 至培养基变混浊。此时可以吸取0.1 mL培养液 进行梯度稀释和涂布平板，也可以按课本中所 述，重复选择培养的步骤一次，然后再进行梯 度稀释和涂布平板。
1.本实验的流程与课题2中的实验流程 有哪些异同？
答：本实验流程与课题2的流程的区别如 下。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在 以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接 分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤 维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选 择培养基上。其他步骤基本一致。
2.为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素 分解菌？ 答：由于生物与环境的相互依存关系，在富 含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对 提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几 率要高于普通环境。 3.将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸 应该埋进土壤多深？
（一） 纤维素与纤维素酶 1.纤维素在生物圈的分布；
纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质.植物的 根茎叶等器官都含有大量的维生素.地球上的植物每年 产生的纤维素超过70亿吨. 人类以淀粉为主要能量来源，但完全不能消化纤维 素，而反刍动物和大量的微生物则主要以纤维素为能 量来源。这是因为，在反刍动物的瘤胃中生活着大量 的可以分解纤维素的微生物。 Nhomakorabea梯度稀释
将菌悬液涂布到有特定选择作用的培养基上
挑选单菌落
发酵培养
本课题知识小结:
专题2 :微生物的培养与应用
一、课题目标
简述纤维素酶的种类及作用，从土壤中分 离出分解纤维素的微生物，讨论这类微生物的 应用价值。
（1）纤维素酶分解纤维素生化原理 （2）区别选择培养与鉴别培养概念 （3）比较纤维素粉培养法与刚果红染色法原理
二、课题重点与难点
从土壤中分离分解纤维素的微生物。
三、基础知识
制备菌悬液： 按照本专题课题1的稀释操作方法，将 选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大 倍数至106。 涂布平板： 将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1 mL，滴加在平板培养基上，用涂布器将菌液 涂布均匀，在30 ℃倒臵培养，至菌落长出。 每个稀释度下需涂布3个平板，并注意设臵对 照。刚果红染色的具体操作步骤参照课本［资 料三］。
2.纤维素酶的结构和作用原理
纤维素与淀粉都是由葡萄糖组成的，但组成两者的 葡萄糖的连接方式不同，因而使两者的形态完全不同。纤 维素是由葡萄糖分子按β-1,4糖苷键连接而成的，淀粉是 由葡萄糖分子按α-1,4糖苷键连接而成的。
内切酶 内切酶作用于无定型的纤维素 （Cx酶） 区域，使纤维素断裂成片段
纤维素酶 外切酶 又叫纤维二糖水解酶，它可以作用 (复合酶) （C1酶） 于纤维素的结晶区或小片段纤维素，
答：将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌 相对聚集，实际上是人工设臵纤维素分解菌生 存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10 cm左 右腐殖土壤中。
4.想一想，这两种方法各有哪些优点与不足？ 你打算选用哪一种方法？
方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果 红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出 的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。 方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题， 缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物 质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。 但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊， 因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素 酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些 微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程 中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌 不易区分。
从糖链末端开始切掉两个葡萄糖分 子，产生纤维二糖 葡萄糖苷酶 将纤维二糖分解成葡萄糖。
（二）纤维素分解菌的筛选
1.刚果红染色法； 2.刚果红染色法的原理。
四、实验案例
土壤中纤维素分解菌的分离
实验的具体操作步骤如下: 1.土样采集 土样采集的方法与本专题课题2类似。 土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因 为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多 的分解纤维素的微生物。如果找不到合适的环 境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也 会有能分解纤维素的微生物生长。 2.选择培养 选择培养需要的仪器有：250 mL锥形 瓶、无菌称量瓶、药匙、1 mL和10 mL的移液 管、天平、摇床、温度计等。
3.刚果红染色法分离 纤维素分解菌这一步所需要的仪器有： 无菌培养皿、涂布器、1 mL移液管，装 有9mL无菌水的20 mL大试管，温箱等。 培养基的制备参照课本旁栏中的比例配 制。在500 mL三角瓶中装入200 mL培 养基，在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。 倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔 化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿 中倒入15～20 mL培养基，凝固后待用。
五、课题成果评价
（一）培养基的制作是否合格以及选择 培养基是否筛选出菌落： 对照的培养基在培养过程中没有菌落生 长则说明培养基制作合格。如果观察到产生 透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维 素的微生物。 （二）分离的结果是否一致： 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌 和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是 细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也 可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。
5.为什么选择培养能够“浓缩”所需的微 生物？ 答：在选择培养的条件下，可以使那些能 够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁 殖，而那些不适应这种营养条件的微生物 的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的 作用。
6.学完这个专题后,你能否总结出分离培养微生物 的一般方法?请用流程图表示.
土壤取样 选择培养