pLVX-EF1α-IRES-Puro慢病毒载体使用说明
慢病毒载体使用手册
LentiCRISPRv2 and lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA CRISPR (C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R epeats) is a microbial nuclease system involved in defense against invading phages and plasmids. CRISPR loci in microbial hosts contain a combination of CRISPR-associated (Cas) genes as well as non-coding RNA elements capable of programming the specificity of the CRISPR-mediated nucleic acid cleavage. Lentiviral CRISPR/Cas can infect a broad variety of mammalian cells by co-expressing a mammalian codon-optimized Cas9 nuclease along with a single guide RNA (sgRNA) to facilitate genome editing (Shalem*, Sanjana*, et al., Science 2014). Protocols for cloning into the lentiviral transfer plasmid and general considerations for producing lentivirus are described below. Separate protocols are available for amplifying the genome-scale CRISPR knock-out (GeCKO) libraries. This protocol is for creating individual lentiviral CRISPR plasmids targeting a single genomic locus.lentiCRISPRv2 (one vector system): This plasmid contains two expression cassettes, hSpCas9 and the chimeric guide RNA. The vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page.lentiGuide-Puro (two vector system): This plasmid expressed only the chimeric guide RNA. It does not contain Cas9. Please use lentiCas9-Blast (a separate lentiviral construct that delivers hSpCas9 and blasticidin resistance) to first integrate Cas9 into your cell line. The lentiGuide-Puro vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page.Which vector to use: lentiCRISPRv2 is identical to the original lentiCRISPRv1 but produces nearly 10X higher titer virus. lentiGuide-Puro produces >100X higher titer virus over lentiCRISPRv1 and should be used in cell lines where Cas9 has already been integrated in (e.g. using the separate lentiCas9-Blast lentivirus). For applications where Cas9 cannot first be introduced (e.g. primary cells), lentiCRISPRv2 is recommended. After transduction, use puromycin to select for cells with lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro.Lentiviral production: Before starting any lentiviral work, please ensure compliance with your Environmental Health and Safety office and government/organization/university. Briefly, to make lentivirus, a transfer plasmid (e.g. lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro) must be co-transfected into HEK293(F)T cells with the packaging plasmids pVSVg (AddGene 8454) and psPAX2 (AddGene 12260). As a positive control for viral production, we often use a CMV-EGFP lentiviral transfer plasmid (eg. AddGene 19319).Target design notes and online resources: For application of Cas9 for site-specific genome editing in eukaryotic cells and organisms, we have computationally identified suitable target sites for the S. pyogenes Cas9 and calculated most likely off-targets within the genome. Please visit to access these Cas9 target design tools. Complete plasmid sequences, protocols, a discussion forum and additional information can be found at the Zhang Lab GeCKO website: /gecko/ . Citation: Please reference the following publications for the use of this material.Improved lentiviral vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Sanjana NE*, Shalem O*, Zhang F. Nature Methods (2014).Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Shalem O*, Sanjana NE*, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelsen T, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F (2014). Science, 343, 83-7. DOI: 10.1126/science.1247005Target Guide Sequence Cloning ProtocolIn order to clone the target sequence into the lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro backbone, synthesize two oligos of the following form. All plasmids have the same overhangs after BsmBI digestion and the same oligos can be used for cloning into lentiCRISPRv2, lentiGuide-Puro or lentiCRISPRv1.Example oligo design : Note that the NGG PAM is not included in the designed oligos. Oligonucleotide ordering tips : Standard de-salted oligos (usually the most inexpensive synthesis) are sufficient forcloning. If not already resuspended, dilute each oligo to 100 µM in sterile water or TE.* * * * *Lentiviral vector digestion, oligo annealing and cloning into digested vector:1. Digest and dephosphorylate 5ug of the lentiviral CRISPR plasmid with BsmB I for 30 min at 37C: 5 ug lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro 3 ul FastDigest BsmB I (Fermentas) 3 ul FastAP (Fermentas) 6 ul 10X FastDigest Buffer 0.6 ul 100 mM DTT (freshly prepared) X ul ddH 2O 60 ul total2. Gel purify digested plasmid using QIAquick Gel Extraction Kit and elute in EB. If BsmBI digested, a ~2kb filler piece should be present on the gel. Only gel purify the larger band . Leave the 2kb band.3. Phosphorylate and anneal each pair of oligos: 1 ul Oligo 1 (100 µM) 1 ul Oligo 2 (100 µM) 1 ul 10X T4 Ligation Buffer (NEB) 6.5 ul ddH 2O 0.5 ul T4 PNK (NEB M0201S) 10 ul total Please use the T4 Ligation Buffer since the buffer supplied with the T4 PNK enzyme does not include ATP (or supplement to 1mM ATP).Put the phosphorylation/annealing reaction in a thermocycler using the following parameters: 37o C 30 min 95o C 5 min and then ramp down to 25o C at 5o C/min4. Dilute annealed oligos from Step 3 at a 1:200 dilution into sterile water or EB.5. Set up ligation reaction and incubate at room temperature for 10 min:X ul BsmB I digested plasmidfrom Step 2 (50ng)1 ul diluted oligo duplex from Step 4 5 ul 2X Quick Ligase Buffer (NEB) X ul ddH 2O 10 ul subtotal1 ul Quick Ligase (NEB M2200S) 11 ul total Also perform a negative control ligation (vector-only with water in place of oligos) and transformation.6.Transformation into Stbl3 bacteria . Lentiviral transfer plasmids contain Long-Terminal Repeats (LTRs) and must be transformed into recombination-deficient bacteria. We use homemade Stbl3 (propagated from Invitrogen C7373-03) and get excellent plasmid yields. Although other RecA- strains may work, we have found the most consistent transformations and yields using Stbl3.。
慢病毒包装体系使用说明
慢病毒包装体系使用说明本说明书适用于以下产品：名称货号慢病毒包装体系KLV3501慢病毒包装体系（含293V细胞）KLV3502慢病毒包装体系（含转染试剂）KLV3503慢病毒包装体系（含293V细胞、转染试剂）KLV3504北京英茂盛业生物科技有限公司Web site：1北京英茂盛业生物科技有限公司/产品内容KLV3501KLV3502KLV3503KLV3504慢病毒载体（过表达或RNA 干扰载体任选一种） 3333辅助载体pH1 3 3 3 3 辅助载体pH2 3 3 3 3 HEK293V 细胞 3 3 Polyfect-V 转染试剂33载体采用质粒形式发货，请在收到质粒后放-20℃冻存，也可以直接转化大肠杆菌感受态进行质粒扩增。
HEK293V 细胞采用干冰或培养瓶发货。
请在收到细胞后根据附带说明书进行复苏或传代。
慢病毒载体慢病毒载体中含有病毒整合和表达所需原件及表达外源目的基因的元件。
外源基因通过载体中的多克隆位点插入慢病毒载体中进行表达。
pLV-EGFP-C 的载体图谱见下，本公司的其它慢病毒载体结构与之基本相似。
其它载体信息见本公司网站 或本说明书后面的附表。
慢病毒包装载体慢病毒包装载体包括pH1和pH2，表达生产病毒颗粒所需的病毒蛋白。
载体图谱见下：HEK293V细胞包装细胞的状态对病毒包装效果有直接影响。
我公司保存的293V细胞为低次代293V细胞，细胞性状稳定。
在高密度下生长3天仍可保持贴壁状态，持续产生病毒颗粒，因此可多次收获病毒，降低病毒包装实验成本。
Polyfect‐V转染试剂Polyfect-V转染试剂专为293V细胞转染及慢病毒包装研制,可以在细胞铺板同时进行转染，缩短病毒包装时间；无需要求细胞处于生长对数期，细胞转染时密度可以很高；细胞毒性极低；质粒和转染试剂用量是普通转染试剂的1/3到1/2等显著优点；包装病毒时转染效率接近100%，能提高病毒产量3-5倍。
3北京英茂盛业生物科技有限公司/慢病毒包装概述：病毒包装前需制备转染级慢病毒载体及两种包装载体。
慢病毒包装手册
慢病毒载体构建及包装操作手册目录慢病毒收到后的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、慢病毒包装和浓缩四、感染目的细胞附1. 汉恒生物慢病毒质粒列表附2. 慢病毒滴度测定方法简介附3. 慢病毒MOI感染参数附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较附5. 实验室病毒操作应急预案慢病毒安全使用和注意事项➢慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3)操作病毒时特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。
4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。
5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。
6)实验完毕用香皂清洗双手。
➢慢病毒收到后的注意事项1)慢病毒的储存用户收到病毒液后如在短期内使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。
注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。
b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。
2)慢病毒的稀释用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。
一、整体实验流程二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附表1）2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。
慢病毒感染细胞 操作手册
实验步骤：
1．准备目的细胞
1.1 细胞复苏 1) 从液氮罐中取出细胞冻存管 2) 迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻 3) 完全解冻后，1000rpm，离心2min 4) 70%酒精擦拭冻存管消毒后，移至超净台 5) 吸去冻存液上清，加入1ml 新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3 ml 含 完全培养基的6-cm dish 中，轻轻晃匀后置于37℃、5%CO2 培养箱培养 6) 次日更换一次培养液后再继续培养 1.2 细胞传代 1) 将生长90%汇合的细胞进行传代 2) 弃去旧培养液，加入2 ml 灭菌的D-Hank’s 溶液，洗涤细胞生长面，然后弃去该溶液 3) 加入1 ml 胰酶消化液，37℃消化约1-2 min，直到细胞完全消化下来 4) 加入完全培养基2ml，用刻度吸管吹打数次，将壁上的细胞冲洗下来 5) 混匀细胞后分至两个新的6-cm dish 中，补足完全培养基至4ml，继续培养
慢病毒感染细胞 操作手册
实验流程描述
培养生长状态良好的目的细胞，病毒感染前一天将目的细胞分入6-well 培养板培养，感染 当天按实验设计的组别加入慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染3 天后荧光显微镜下 观察GFP 表达情况，荧光率达80％以上，待细胞长满培养板收集细胞检测。
实验材料：
试剂
试剂名称 胎牛血清 FBS DMSO DMEM 胰酶 Opti-MEM
2． 目的细胞慢病毒感染
1) 处于对数生长期的目的细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液 2) 将细胞悬液（细胞数约为5×104）接种于6-well 中，37℃ 5%CO2 培养箱培养待细胞融 合度达到约30% 3) 根据细胞MOI 值，加入适宜量的病毒 4) 12h 后观察细胞状态：如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24h 后更换培养基；如 果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基 5) 感染3 天后观察慢病毒上报告基因GFP 的表达情况，荧光率大于80%者，将细胞分成两 分，一份分于12孔培养板中待长满后收集细胞用于RNA提取，一份分于6孔板中待长满后收集 细胞用于蛋白提取；感染效率低于80%的实验组，重新进行感染实验 6) 以上的操作是针对贴壁细胞设计的。悬浮细胞的区别主要在细胞分盘上，它不需要提前 一天分盘。操作时将细胞离心后悬浮在不同的培养基中，计数分盘后，就可以加入病毒。 操作时污染了病毒的管子和枪头以及培养基和最后的细胞都CO2 培养箱 生物安全柜
慢病毒载体包装构建过程
慢病毒载体包装构建过程（一）原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。
对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。
概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。
携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。
辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。
慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。
包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。
将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。
二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。
3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 eppendorf 管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。
计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。
计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心，1000rpm，5min。
慢病毒(Lentivirus)载体构步骤和方法
一、简介慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达.二、实验流程（大致的简单过程）慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体（自己构建）和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T 细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组,从而高水平的表达效应分子.大致的实验流程：1. 根据目的基因相关信息（序列,序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存）2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T 细胞[1]，进行病毒包装和生产，收集病毒液；4. 浓缩、纯化病毒液；5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞)；6。
通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果；7。
用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性.病毒液足够用于一般的动物活体实验。
三、重组质粒构建流程1.基因的获得：shRNA寡核苷酸序列的设计和合成（将正确序列克隆入载体中,退火形成双链，PCR扩增）2。
回收A．酶切产物的胶回收：一般做50-100ul 体系,然后跑电泳回收，回收量一般为30ul. B．PCR扩增产物的胶回收原理：首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。
慢病毒包装服务说明
慢病毒包装服务
服务细节信息
1. 请明示Gene accession number (mRNA NCBI reference)：
您能提供DNA模板（包括编码序列信息）吗？
能不能，我需要金斯瑞帮我合成或从cDNA库获取
2. 请选择您希望使用的启动子:
CMV EF1a TRE-3G 如果是其它启动子，请明示：
3. 您需要添加标签(6His-tag, Luc, HA, Myc, V5, GFP, RFP, CFP...)?
我不需要添加任何标签
在基因的N-端添加标签（请明示）：
在基因的C-端添加标签（请明示）：
4. 请选择筛选标记（抗生素）:
Puromycin
Hygromycin
Neomycin
其他：
5. 病毒滴度要求
>10^7 IFU/ml
>10^8 IFU/ml
注：金斯瑞所使用的病毒滴度检测方法为p24 ELISA法测定慢病毒滴度。
6. 病毒需求量
1 ml
2 ml
其他
其它特殊需求（如病毒溶解在什么样溶剂内、阴性对照是否需要等）：
备注：尽管我们使用的慢病毒载体（5质粒系统）包含了所有与生物安全相关元件，但考虑到您的安全，我们仍旧建议您在生物安全Ⅱ级或更高级别实验室内操作此病毒。
pLVX-IRES-Neo慢病毒载体使用说明
pLVX-IRES-Neo pLVX-IRES-Neo载体基本信息：载体名称:pLVX-IRES-Neo, pLVX IRES Neo质粒类型: 慢病毒载体；哺乳动物细胞表达载体；双顺反子载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝启动子: CMV克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 8269 bp5' 测序引物及序列: CMV-F: CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG (Invitrogen)3' 测序引物及序列: IRES-R: CCTCACATTGCCAAAAGACG载体标签: 无标签载体抗性: 氨苄青霉素筛选标记: 新霉素Neomycin克隆菌株: Stbl3 E.coli备注: pLVX-IRES-Neo载体以双顺反子的形式同时表达Neo抗性基因和目的基因；CMV启动子驱动目的基因的过表达。
稳定性: 稳表达组成型: 组成型病毒/非病毒: 慢病毒pLVX-IRES-Neo载体质粒图谱和多克隆位点信息：pLVX-IRES-Neo载体序列：ORIGIN1 TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAAAGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA61 CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC AGATATCCAC121 TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA 181 ATAAAGGAGA GAACACCAGC TTGTTACACC CTGTGAGCCT GCATGGGATG GATGACCCGG 241 AGAGAGAAGT GTTAGAGTGG AGGTTTGACA GCCGCCTAGC ATTTCATCAC GTGGCCCGAG 301 AGCTGCATCC GGAGTACTTC AAGAACTGCT GATATCGAGC TTGCTACAAG GGACTTTCCG 361 CTGGGGACTT TCCAGGGAGG CGTGGCCTGG GCGGGACTGG GGAGTGGCGA GCCCTCAGAT 421 CCTGCATATA AGCAGCTGCT TTTTGCCTGT ACTGGGTCTC TCTGGTTAGA CCAGATCTGA481 GCCTGGGAGC TCTCTGGCTA ACTAGGGAAC CCACTGCTTA AGCCTCAATA AAGCTTGCCT 541 TGAGTGCTTC AAGTAGTGTG TGCCCGTCTG TTGTGTGACT CTGGTAACTA GAGATCCCTC601 AGACCCTTTT AGTCAGTGTG GAAAATCTCT AGCAGTGGCG CCCGAACAGG GACTTGAAAG 661 CGAAAGGGAA ACCAGAGGAG CTCTCTCGAC GCAGGACTCG GCTTGCTGAA GCGCGCACGG 721 CAAGAGGCGA GGGGCGGCGA CTGGTGAGTA CGCCAAAAAT TTTGACTAGC GGAGGCTAGA 781 AGGAGAGAGA TGGGTGCGAG AGCGTCAGTA TTAAGCGGGG GAGAATTAGA TCGCGATGGG 841 AAAAAATTCG GTTAAGGCCA GGGGGAAAGA AAAAATATAA ATTAAAACAT ATAGTATGGG 901 CAAGCAGGGA GCTAGAACGA TTCGCAGTTA ATCCTGGCCT GTTAGAAACA TCAGAAGGCT 961 GTAGACAAAT ACTGGGACAG CTACAACCAT CCCTTCAGAC AGGATCAGAA GAACTTAGAT 1021 CATTATATAA TACAGTAGCA ACCCTCTATT GTGTGCATCA AAGGATAGAG ATAAAAGACA 1081 CCAAGGAAGC TTTAGACAAG ATAGAGGAAG AGCAAAACAA AAGTAAGACC ACCGCACAGC 1141 AAGCGGCCGG CCGCTGATCT TCAGACCTGG AGGAGGAGAT ATGAGGGACA ATTGGAGAAG 1201 TGAATTATAT AAATATAAAG TAGTAAAAAT TGAACCATTA GGAGTAGCAC CCACCAAGGC 1261 AAAGAGAAGA GTGGTGCAGA GAGAAAAAAG AGCAGTGGGA ATAGGAGCTT TGTTCCTTGG 1321 GTTCTTGGGA GCAGCAGGAA GCACTATGGG CGCAGCGTCA ATGACGCTGA CGGTACAGGC 1381 CAGACAATTA TTGTCTGGTA TAGTGCAGCA GCAGAACAAT TTGCTGAGGG CTATTGAGGC 1441 GCAACAGCAT CTGTTGCAAC TCACAGTCTG GGGCATCAAG CAGCTCCAGG CAAGAATCCT1501 GGCTGTGGAA AGATACCTAA AGGATCAACA GCTCCTGGGG ATTTGGGGTT GCTCTGGAAA 1561 ACTCATTTGC ACCACTGCTG TGCCTTGGAA TGCTAGTTGG AGTAATAAAT CTCTGGAACA 1621 GATTTGGAAT CACACGACCT GGATGGAGTG GGACAGAGAA ATTAACAATT ACACAAGCTT 1681 AATACACTCC TTAATTGAAG AATCGCAAAA CCAGCAAGAA AAGAATGAAC AAGAATTATT 1741 GGAATTAGAT AAATGGGCAA GTTTGTGGAA TTGGTTTAAC ATAACAAATT GGCTGTGGTA 1801 TATAAAATTA TTCATAATGA TAGTAGGAGG CTTGGTAGGT TTAAGAATAG TTTTTGCTGT 1861 ACTTTCTATA GTGAATAGAG TTAGGCAGGG ATATTCACCA TTATCGTTTC AGACCCACCT 1921 CCCAACCCCG AGGGGACCCG ACAGGCCCGA AGGAATAGAA GAAGAAGGTG GAGAGAGAGA 1981 CAGAGACAGA TCCATTCGAT TAGTGAACGG ATCTCGACGG TATCGCCTTT AAAAGAAAAG 2041 GGGGGATTGG GGGGTACAGT GCAGGGGAAA GAATAGTAGA CATAATAGCA ACAGACATAC 2101 AAACTAAAGA ATTACAAAAA CAAATTACAA AAATTCAAAA TTTTCGGGTT TATTACAGGG 2161 ACAGCAGAGA TCCAGTTTAT CGATAAGCTT GGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA 2221 ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG 2281 TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA ATGGGTGGAG TATTTACGGT 2341 AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG 2401 TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC 2461 CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC 2521 AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA 2581 TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA 2641 ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG GTAGGCGTGT ACGGTGGGAG GTCTATATAA 2701 GCAGAGCTCG TTTAGTGAAC CGTCAGATCG CCTGGAGACG CCATCCACGC TGTTTTGACC 2761 TCCATAGAAG ACACCGACTC TACTAGAGGA TCTATTTCCG GTGAATTCCT CGAGACTAGT 2821 TCTAGAGCGG CCGCGGATCC CGCCCCTCTC CCTCCCCCCC CCCTAACGTT ACTGGCCGAA 2881 GCCGCTTGGA ATAAGGCCGG TGTGCGTTTG TCTATATGTT ATTTTCCACC ATATTGCCGT 2941 CTTTTGGCAA TGTGAGGGCC CGGAAACCTG GCCCTGTCTT CTTGACGAGC ATTCCTAGGG 3001 GTCTTTCCCC TCTCGCCAAA GGAATGCAAG GTCTGTTGAA TGTCGTGAAG GAAGCAGTTC 3061 CTCTGGAAGC TTCTTGAAGA CAAACAACGT CTGTAGCGAC CCTTTGCAGG CAGCGGAACC 3121 CCCCACCTGG CGACAGGTGC CTCTGCGGCC AAAAGCCACG TGTATAAGAT ACACCTGCAA 3181 AGGCGGCACA ACCCCAGTGC CACGTTGTGA GTTGGATAGT TGTGGAAAGA GTCAAATGGC 3241 TCTCCTCAAG CGTATTCAAC AAGGGGCTGA AGGATGCCCA GAAGGTACCC CATTGTATGG 3301 GATCTGATCT GGGGCCTCGG TGCACATGCT TTACATGTGT TTAGTCGAGG TTAAAAAAAC 3361 GTCTAGGCCC CCCGAACCAC GGGGACGTGG TTTTCCTTTG AAAAACACGA TGATAAGCTT 3421 GCCACAACCA TGGCTGAACA AGATGGATTG CACGCAGGTT CTCCGGCCGC TTGGGTGGAG 3481 AGGCTATTCG GCTATGACTG GGCACAACAG ACAATCGGCT GCTCTGATGC CGCCGTGTTC 3541 CGGCTGTCAG CGCAGGGGCG CCCGGTTCTT TTTGTCAAGA CCGACCTGTC CGGTGCCCTG 3601 AATGAACTGC AGGACGAGGC AGCGCGGCTA TCGTGGCTGG CCACGACGGG CGTTCCTTGC 3661 GCAGCTGTGC TCGACGTTGT CACTGAAGCG GGAAGGGACT GGCTGCTATT GGGCGAAGTG 3721 CCGGGGCAGG ATCTCCTGTC ATCTCACCTT GCTCCTGCCG AGAAAGTATC CATCATGGCT 3781 GATGCAATGC GGCGGCTGCA TACGCTTGAT CCGGCTACCT GCCCATTCGA CCACCAAGCG 3841 AAACATCGCA TCGAGCGAGC ACGTACTCGG ATGGAAGCCG GTCTTGTCGA TCAGGATGAT 3901 CTGGACGAAG AGCATCAGGG GCTCGCGCCA GCCGAACTGT TCGCCAGGCT CAAGGCGCGC 3961 ATGCCCGACG GCGAGGATCT CGTCGTGACC CATGGCGATG CCTGCTTGCC GAATATCATG 4021 GTGGAAAATG GCCGCTTTTC TGGATTCATC GACTGTGGCC GGCTGGGTGT GGCGGACCGC 4081 TATCAGGACA TAGCGTTGGC TACCCGTGAT ATTGCTGAAG AGCTTGGCGG CGAATGGGCT4141 GACCGCTTCC TCGTGCTTTA CGGTATCGCC GCTCCCGATT CGCAGCGCAT CGCCTTCTAT 4201 CGCCTTCTTG ACGAGTTCTT CTGAACGCGT CTGGAACAAT CAACCTCTGG ATTACAAAAT 4261 TTGTGAAAGA TTGACTGGTA TTCTTAACTA TGTTGCTCCT TTTACGCTAT GTGGATACGC 4321 TGCTTTAATG CCTTTGTATC ATGCTATTGC TTCCCGTATG GCTTTCATTT TCTCCTCCTT4381 GTATAAATCC TGGTTGCTGT CTCTTTATGA GGAGTTGTGG CCCGTTGTCA GGCAACGTGG 4441 CGTGGTGTGC ACTGTGTTTG CTGACGCAAC CCCCACTGGT TGGGGCATTG CCACCACCTG 4501 TCAGCTCCTT TCCGGGACTT TCGCTTTCCC CCTCCCTATT GCCACGGCGG AACTCATCGC 4561 CGCCTGCCTT GCCCGCTGCT GGACAGGGGC TCGGCTGTTG GGCACTGACA ATTCCGTGGT 4621 GTTGTCGGGG AAGCTGACGT CCTTTCCATG GCTGCTCGCC TGTGTTGCCA CCTGGATTCT 4681 GCGCGGGACG TCCTTCTGCT ACGTCCCTTC GGCCCTCAAT CCAGCGGACC TTCCTTCCCG 4741 CGGCCTGCTG CCGGCTCTGC GGCCTCTTCC GCGTCTTCGC CTTCGCCCTC AGACGAGTCG 4801 GATCTCCCTT TGGGCCGCCT CCCCGCCTGG AATTAATTCT GCAGTCGAGA CCTAGAAAAA 4861 CATGGAGCAA TCACAAGTAG CAATACAGCA GCTACCAATG CTGATTGTGC CTGGCTAGAA 4921 GCACAAGAGG AGGAGGAGGT GGGTTTTCCA GTCACACCTC AGGTACCTTT AAGACCAATG 4981 ACTTACAAGG CAGCTGTAGA TCTTAGCCAC TTTTTAAAAG AAAAGAGGGG ACTGGAAGGG 5041 CTAATTCACT CCCAACGAAG ACAAGATATC CTTGATCTGT GGATCTACCA CACACAAGGC 5101 TACTTCCCTG ATTAGCAGAA CTACACACCA GGGCCAGGGG TCAGATATCC ACTGACCTTT 5161 GGATGGTGCT ACAAGCTAGT ACCAGTTGAG CCAGATAAGG TAGAAGAGGC CAATAAAGGA 5221 GAGAACACCA GCTTGTTACA CCCTGTGAGC CTGCATGGGA TGGATGACCC GGAGAGAGAA 5281 GTGTTAGAGT GGAGGTTTGA CAGCCGCCTA GCATTTCATC ACGTGGCCCG AGAGCTGCAT 5341 CCGGAGTACT TCAAGAACTG CTGATATCGA GCTTGCTACA AGGGACTTTC CGCTGGGGAC 5401 TTTCCAGGGA GGCGTGGCCT GGGCGGGACT GGGGAGTGGC GAGCCCTCAG ATCCTGCATA 5461 TAAGCAGCTG CTTTTTGCCT GTACTGGGTC TCTCTGGTTA GACCAGATCT GAGCCTGGGA 5521 GCTCTCTGGC TAACTAGGGA ACCCACTGCT TAAGCCTCAA TAAAGCTTGC CTTGAGTGCT 5581 TCAAGTAGTG TGTGCCCGTC TGTTGTGTGA CTCTGGTAAC TAGAGATCCC TCAGACCCTT 5641 TTAGTCAGTG TGGAAAATCT CTAGCAGTAG TAGTTCATGT CATCTTATTA TTCAGTATTT 5701 ATAACTTGCA AAGAAATGAA TATCAGAGAG TGAGAGGCCT TGACATTGCT AGCGTTTACC 5761 GTCGACCTCT AGCTAGAGCT TGGCGTAATC ATGGTCATAG CTGTTTCCTG TGTGAAATTG 5821 TTATCCGCTC ACAATTCCAC ACAACATACG AGCCGGAAGC ATAAAGTGTA AAGCCTGGGG 5881 TGCCTAATGA GTGAGCTAAC TCACATTAAT TGCGTTGCGC TCACTGCCCG CTTTCCAGTC 5941 GGGAAACCTG TCGTGCCAGC TGCATTAATG AATCGGCCAA CGCGCGGGGA GAGGCGGTTT 6001 GCGTATTGGG CGCTCTTCCG CTTCCTCGCT CACTGACTCG CTGCGCTCGG TCGTTCGGCT 6061 GCGGCGAGCG GTATCAGCTC ACTCAAAGGC GGTAATACGG TTATCCACAG AATCAGGGGA 6121 TAACGCAGGA AAGAACATGT GAGCAAAAGG CCAGCAAAAG GCCAGGAACC GTAAAAAGGC 6181 CGCGTTGCTG GCGTTTTTCC ATAGGCTCCG CCCCCCTGAC GAGCATCACA AAAATCGACG 6241 CTCAAGTCAG AGGTGGCGAA ACCCGACAGG ACTATAAAGA TACCAGGCGT TTCCCCCTGG 6301 AAGCTCCCTC GTGCGCTCTC CTGTTCCGAC CCTGCCGCTT ACCGGATACC TGTCCGCCTT 6361 TCTCCCTTCG GGAAGCGTGG CGCTTTCTCA TAGCTCACGC TGTAGGTATC TCAGTTCGGT 6421 GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC TGGGCTGTGT GCACGAACCC CCCGTTCAGC CCGACCGCTG 6481 CGCCTTATCC GGTAACTATC GTCTTGAGTC CAACCCGGTA AGACACGACT TATCGCCACT 6541 GGCAGCAGCC ACTGGTAACA GGATTAGCAG AGCGAGGTAT GTAGGCGGTG CTACAGAGTT 6601 CTTGAAGTGG TGGCCTAACT ACGGCTACAC TAGAAGAACA GTATTTGGTA TCTGCGCTCT 6661 GCTGAAGCCA GTTACCTTCG GAAAAAGAGT TGGTAGCTCT TGATCCGGCA AACAAACCAC 6721 CGCTGGTAGC GGTGGTTTTT TTGTTTGCAA GCAGCAGATT ACGCGCAGAA AAAAAGGATC6781 TCAAGAAGAT CCTTTGATCT TTTCTACGGG GTCTGACGCT CAGTGGAACG AAAACTCACG6841 TTAAGGGATT TTGGTCATGA GATTATCAAA AAGGATCTTC ACCTAGATCC TTTTAAATTA6901 AAAATGAAGT TTTAAATCAA TCTAAAGTAT ATATGAGTAA ACTTGGTCTG ACAGTTACCA6961 ATGCTTAATC AGTGAGGCAC CTATCTCAGC GATCTGTCTA TTTCGTTCAT CCATAGTTGC7021 CTGACTCCCC GTCGTGTAGA TAACTACGAT ACGGGAGGGC TTACCATCTG GCCCCAGTGC7081 TGCAATGATA CCGCGAGACC CACGCTCACC GGCTCCAGAT TTATCAGCAA TAAACCAGCC7141 AGCCGGAAGG GCCGAGCGCA GAAGTGGTCC TGCAACTTTA TCCGCCTCCA TCCAGTCTAT7201 TAATTGTTGC CGGGAAGCTA GAGTAAGTAG TTCGCCAGTT AATAGTTTGC GCAACGTTGT7261 TGCCATTGCT ACAGGCATCG TGGTGTCACG CTCGTCGTTT GGTATGGCTT CATTCAGCTC7321 CGGTTCCCAA CGATCAAGGC GAGTTACATG ATCCCCCATG TTGTGCAAAA AAGCGGTTAG7381 CTCCTTCGGT CCTCCGATCG TTGTCAGAAG TAAGTTGGCC GCAGTGTTAT CACTCATGGT7441 TATGGCAGCA CTGCATAATT CTCTTACTGT CATGCCATCC GTAAGATGCT TTTCTGTGAC7501 TGGTGAGTAC TCAACCAAGT CATTCTGAGA ATAGTGTATG CGGCGACCGA GTTGCTCTTG7561 CCCGGCGTCA ATACGGGATA ATACCGCGCC ACATAGCAGA ACTTTAAAAG TGCTCATCAT7621 TGGAAAACGT TCTTCGGGGC GAAAACTCTC AAGGATCTTA CCGCTGTTGA GATCCAGTTC7681 GATGTAACCC ACTCGTGCAC CCAACTGATC TTCAGCATCT TTTACTTTCA CCAGCGTTTC7741 TGGGTGAGCA AAAACAGGAA GGCAAAATGC CGCAAAAAAG GGAATAAGGG CGACACGGAA7801 ATGTTGAATA CTCATACTCT TCCTTTTTCA ATATTATTGA AGCATTTATC AGGGTTATTG7861 TCTCATGAGC GGATACATAT TTGAATGTAT TTAGAAAAAT AAACAAATAG GGGTTCCGCG7921 CACATTTCCC CGAAAAGTGC CACCTGACGT CGACGGATCG GGAGATCAAC TTGTTTATTG7981 CAGCTTATAA TGGTTACAAA TAAAGCAATA GCATCACAAA TTTCACAAAT AAAGCATTTT8041 TTTCACTGCA TTCTAGTTGT GGTTTGTCCA AACTCATCAA TGTATCTTAT CATGTCTGGA8101 TCAACTGGAT AACTCAAGCT AACCAAAATC ATCCCAAACT TCCCACCCCA TACCCTATTA8161 CCACTGCCAA TTACCTGTGG TTTCATTTAC TCTAAACCTG TGATTCCTCT GAATTATTTT8221 CATTTTAAAG AAATTGTATT TGTTAAATAT GTACTACAAA CTTAGTAGT//pLVX-IRES-Neo其他相关慢病毒载体：Tet-pLKO-neo Tet-pLKO-puro pPACKH1-GAGpMD2.G pCMV-dR8.2-dvpr pLKO.1-GFP-shRNA pLKO.1-TRC control pLKO.1-hygro pLKO.1-TRCpCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro FUW-tetO-hOKMSFUW-tetO-hOCT4 FUW-tetO-hSOX2 FUW-tetO-hKLF4FUW pLVX-AcGFP1-N1 pLVX-AcGFP1-C1pLVX-AmCyan1-N1 pLVX-DsRed-Express2-C1 pLVX-DsRed-Express2-N1 pLVX-DsRed-Monomer-N1 pLVX-PAmCherry-C1 pLVX-PAmCherry-N1 pLVX-ZsGreen1-N1 pLVX-IRES-ZsGreen1 pLVX-IRES-mCherry pLVX-mCherry-C1 pLVX-mCherry-N1 pLVX-tdTomato-C1 pLKO.1-puro pLentilox 3.7 pLVX-Tet-On-Advanced pLVX-IRES-Puro pLVX-IRES-Neo pLVX-IRES-HygpLVX-EF1α-DsRed-Monomer-C1 pLVX-EF1α-AcGFP1-N1 pLVX-EF1α-AcGFP1-C1 pLVX-EF1α-mCherry-C1 pLVX-EF1α-IRES-mCherry pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1 pLVX-MetLuc Control pLVX-MetLuc pLVX-Hom-Mem1pLVX-Het-2 pLVX-DD-AcGFP1-Actin pPRIME-TET-GFP-FF3pSIH1-H1-CopGFP pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro pCDF1-MCS2-EF1-copGFP pLOX-CWBmi1 pLOX-CW-CREpRSV-rev pMDLg-pRRE pLL3.7pLVX-DD-AmCyan1 Control pLVX-DD-AmCyan1 Reporter pLVX-DD-tdTomato Reporter pLVX-DD-tdTomato Control pLVX-PTuner-Green pLVX-CherryPicker2pLVX-TetOne-Puro-Luc pLVX-TetOne pLVX-TetOne-PuropLVX-TetOne-Luc pLVX-rHom-Nuc1 pLVX-rHom-Sec1pLVX-rHom-1 pLVX-Hom-Nuc1 pLVX-Het-Nuc1pLVX-PTuner pLVX-PTuner2 pLVX-DD-ZsGreen1 Reporter pLVX-Het-1 pLVX-CherryPicker Control pLVX-Tet3GpCDH-CMV-MCS-EF1-RFP-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-Hygro pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo pCDH-MCS-T2A-Puro-MSCV pCDH1-MCS2-EF1-copGFP pCDF1-MCS2-EF1-Puro pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP pWPXL pLVX-TRE3G-ZsGreen1 pLVX-TRE3G-mCherry pLenti6.3-EmGFP-BveI miR pLenti6/V5-GW/lacZpLenti6.3/V5-GW/EmGFP pLenti6.3-MCS pLenti6.3-DsRed2-BveI miR pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP pLVX-shRNA2 psPAX2VSV-G pSico PGK Puro pcDNA6.2-DsRed2-MCS1 miR pcDNA6.3-EmGFP-NC- II pcDNA6.2-EmGFP-NC- I pcDNA6.2-EmGFP-BsaI miR pLenti6.3-BveI miR pLenti6.3-MCS-IRES2-DsRed2 pLEX-MCSpGIPZ pLP2 pLP1FUGW pFUGW pLOX-Ttag-iresTKpMDLg/pRRE pLentG-KOSM pCMV-dR8.91pLVX-TRE3G-Luc Control pLVX-TRE3G-IRES pCgpvpSico pSicoR pLVTHMpGensil-1 pLVX-EF1α-IRES-Puro pCDF1-MCS2-EF1-copGFP pPACKH1-REV pLVX-Het-Mem1 pLVX-shRNA1pLKO.1-puro-GFP-siRNA pPRIME-TREX-GFP-FF3 pcDNA6.2-DsRed2-BsmBI miR pCDH-MSCV-MCS-EF1-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP pLVX-TRE3GFUW-tetO-hMYC pLOX-TERT-iresTK pLP/VSVGFUW-M2rtTA pCDH-EF1-MCS-(PGK-Puro) pcDNA6.2-EmGFP-MCS1 miR pLVX-AmCyan1-C1 pLVX-Hom-1 pcDNA6.2-BsaI miRpLVX-DsRed-Monomer-C1 pLVX-mCherry-Actin pTRIPZpLVX-ZsGreen1-C1 pLVX-CherryPicker1 LeGO-iC2pLVX-IRES-tdTomato pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro pLKO.3GpLVX-tdTomato-N1 pLVX-PTuner2-C pLVX-PuropLVX-Tight-Puro pLVX-DD-ZsGreen1 Control pSicoR PGK PuropLVX-EF1α-DsRed-Monomer-N1 pCDH-UbC-MCS-EF1-Hygro pLVTHpLVX-EF1α-mCherry-N1 pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP。
稳定表达猪德尔塔冠状病毒N_蛋白的Vero_细胞系的建立及鉴定
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒（PDCoV ）核衣壳（N ）蛋白的非洲绿猴肾（Vero ）细胞系，本研究将PDCoV-N 基因克隆入慢病毒载体中，获得重组质粒pLVX-PDCoV-N ，利用慢病毒包装系统转染293T 细胞，包装成表达N 蛋白的慢病毒颗粒，慢病毒感染Vero 细胞，嘌呤霉素加压筛选目的细胞。
RT-PCR 扩增N 基因和测序表明细胞系基因组中存在N 蛋白编码序列，Western blot 和IFA 试验表明N 蛋白可在细胞系中稳定表达。
应用制备的细胞系对临床PDCoV 阳性血清样品进行检测，与ELISA 检测结果符合率达到100%。
本研究成功建立了稳定表达PDCoV N 蛋白的Vero 细胞系，为PDCoV N 蛋白生物学特性研究和PDCoV 的临床检测、流行病学调查奠定了基础。
关键词：猪德尔塔冠状病毒；核衣壳（N ）蛋白；慢病毒；稳转细胞系中图分类号：S858.28 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2024）01-0056-06Establishment and Characterization of a Vero Cell Line Stably Expressing NProtein of Porcine DeltacoronavirusQIAN Bingxu 1,2, BO Zongyi 1,3, BAI Xueyan 1, ZHANG Chengcheng 1, GUO Mengjiao 1, LI Mengjiao 1,LIAO Kai 1,2, XUE Feng 2, WU Yantao 1, ZHANG Xiaorong 1(1. College of V eterinary Medicine of Y angzhou University, Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Y angzhou 225000, China; 2. International Cooperative Laboratory for Animal Health and Food Safety, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 3. Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety, Ministry ofEducation of China, Y angzhou University, Y angzhou 225000, China)收稿日期：2021-08-23基金项目：扬州大学高端人才支持计划；江苏高校优势学科建设工程资助项目作者简介：钱炳旭，男，博士研究生，主要从事动物传染病防控研究；薄宗义，男，助理研究员，主要从事动物传染病防控研究通信作者：张小荣，E-mail：***********.cn稳定表达猪德尔塔冠状病毒N 蛋白的Vero 细胞系的建立及鉴定钱炳旭1,2，薄宗义1,3，白雪雁1，张成成1，郭梦娇1，李梦娇1，廖 凯1,2，薛 峰2，吴艳涛1，张小荣1（1.扬州大学兽医学院 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225000；2.南京农业大学动物健康与食品安全国际合作实验室，南京210095；3.扬州大学农业科技发展研究院教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，扬州225000）2024,32(1):56-61Abstract: To obtain a African green monkey kidney cell (Vero) line stably expressing nucleocapsid (N) protein of Porcine deltacoronavirus (PDCoV), the PDCoV N gene was cloned into a lentiviral vector to obtain the recombinant plasmid PLVX-PDCoV-N. Then, the recombinant plasmid PLVX-PDCoV-N was transfected into 293T cells by lentivirus packaging system and packaged into lentivirus particles for N protein expression. Vero cells were infected then with the lentivirus and the target cells were screened by puromycin. The results of RT-PCR and sequencing of PCR product showed the genome of the resulting Vero cell line containing N gene. The N protein that was stably expressed in the Vero cell line was confi rmed by Western blot and IFA. The Vero cell line was used to detect clinical PDCoV positive serum samples and the coincidence with the results of ELISA was 100%. The study successfully established a· 57 ·钱炳旭等：稳定表达猪德尔塔冠状病毒N 蛋白的Vero 细胞系的建立及鉴定第32卷第1期猪德尔塔冠状病毒（Porcine delta coronavirus, PDCoV）是近年来新发的冠状病毒，2012年在中国香港被首次报道[1]，2014年在美国首次出现大规模流行[2-3]。
pLVX-Myc-MCS-Strep-IRES-Puro使用说明
pRSV-Rev pMDLg/pRRE pLVX-shRNA2-Puro pLKO.1 GFP shRNA pHIV-H2BmRFP pGreen-Puro pUMVC pOTENT-CMV-Flag-His-Puro pCDF1-MCS2-EF1-Puro pCDH-EF1-luc2-T2A-Tdtomato pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP pGenesil-1 pCMV-VSV-G pLVX-Tet3G pLVX-TRE3G-Zsgreen1 pLVX-TRE3G pLP/VSVG pLP2 pLP1 pCMV-dR8.91 psPAX2 pLJM1 pLKO.1-Puro pLKO.1-TRC pLKO.1 pLVX-DsRed-Monomer-N1 pLVX-AcGFP1-N1 pLVX-EF1α-IRES-puro pLVX-EF1α-IRES-mCherry pLVX-IRES-mCherry pLVX-IRES-Neo pLVX-IRES-ZsGreen1 pLVX-IRES-Puro pLVX-shRNA2 pLVX-shRNA1 pLVX-Puro
pLVX-Myc-MCS-Strep-IRES-Puro 载体其他相关的逆病毒载体： pLVX-Tight-Puro pMD2.G pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro pLVX-IRES-tdTomato pRRLSIN.CPPT.PGK-GFP.WPRE pLenti-Bi-cistronic pLKO.1-EGFP pLVX-Tet-On-Advanced pLVX-Myc-MCS-Strep-IRES-Puro pLVTHM pTRIPZ pLKO.1-Hygro TRC2-pLKO.5-Puro
慢病毒使用手册
1.慢病毒使用操作手册1.1 慢病毒的储存与稀释:1.1.1 病毒的储存：如果用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80 ℃冰箱（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）。
A．病毒可以-80 ℃保存6个月，滴度不会明显下降；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度。
B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。
1.1.2 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰上融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4 ℃保存(请尽量在三天内用完) 。
1.2 慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和细胞建系1.2.1 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。
如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用细胞培养板，如96孔板、24孔板等等检测病毒对目的细胞的亲嗜性）1.2.2 慢病毒感染目的细胞预实验1.2.2.1 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项A.测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。
B.在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
C.我们提供的病毒单位为TU/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。
如：病毒滴度为1E8 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1E8个具有生物活性的慢病毒颗粒。
慢病毒载体的详细介绍
慢病毒载体的详细介绍病毒是一种生物制剂，其在感染时可以有效地将其遗传物质引入靶细胞，并依赖宿主细胞进行复制。
载体可以携带目的基因进入细胞，代替野生型病毒基因。
因此，非复制载体缺乏在细胞中自我繁殖的遗传信息，但仍保留向靶细胞引入目的基因的能力。
慢病毒（LV）属于逆转录病毒家族（逆转录病毒，慢病毒属）。
LV是目前最实用的基因载体，也是基因治疗应用中重要的研究工具，因为其可以感染细胞并使携带的基因整合到基因组上长期稳定的表达。
人类免疫缺陷病毒I型（HIV-1）可能是已经研究的慢病毒中最适用的，虽然其致病性早就被人们所知，但是艾滋病病毒衍生的载体载基因治疗中的应用越来越受到人们关注，尤其是其在分化和不分裂的细胞的研究。
此，已经有相当多的研究致力于设计具有更高生物安全特性的LV。
此外，非基因治疗LV的应用也得到了广泛的研究，包括基于RNA干扰的哺乳动物细胞稳定基因敲除的基因功能的研究。
虽然在实验研究中使用LV可能更倾向于它们的功能特性，包括提高生产力和/或转染效率，但更安全的载体的设计有助于提高实验的安全性。
LV被认为是重组病毒，还是细胞转染工具LV，这主要可能取决于涉及活动的目的或类型的若干监管规定和指导方针。
在使用LV时，相关法规、指南做出了规定：（i）在工作场所，保护工人远离生物制剂暴露的风险；（ii）操作规范，正确谨慎处理转基因释放的（微）生物体或生物体含有重组DNA分子；（iii）保证人或兽用生物制品和药品的安全性，如使用LV的人员和LV转染的细胞虽然用于治疗目的的LV或慢病毒转导细胞的使用产生了一些重要的问题包括质量、疗效、安全性、伦理、社会和监管问题，但是本次探讨的范围是限于LV在研究活动的生物风险评估。
我们的目标是概述目前用于改善载体生物安全的不同策略，并比较最新的慢病毒包装系统。
虽然这次探讨的重点是由单独的载体构成的危险，但是我们也认识到LV风险评估也应考虑到与转基因相关的危害。
在LV中克隆癌基因或使shRNA介导的肿瘤抑制基因的敲除显然是需要严格的生物安全措施实施的高风险操作。
慢病毒使用操作指南
慢病毒使用操作指南1. 引言1.1 目的本文档旨在提供关于慢病毒使用的详细操作指南，以确保实验室人员能够正确、安全地处理和利用该种类病毒。
2. 概述2.1 定义与特点- 慢病毒是一类具有复制缓激活机制并且感染后可长期存在于寄主体内的RNA或DNA 症候群相关性（SAR）等多个领域中发挥重要作用。
3. 实验前准备工作在进行任何涉及到潜在危险生物材料如此类型之前, 快速评估风险，并采取适当措施来最小化这些风险。
4 . 材料清单：下面列出了完成所需任务时可能需要的基本设备和试剂: - 生物安全柜级别II (BSL-2) 或更高级别环境下进行所有步骤；- 防护手套、防护眼镜/面罩和实验服;...5 . 实验流程：进行以下步骤以成功执行您对操纵蠕虫样品库存的需求:5.1 准备工作- 确保实验室环境符合慢病毒操作所需要的生物安全级别；- 检查所有设备和试剂是否齐全并处于良好状态。
5.2 培养基准备：...6 . 安全注意事项与风险评估7 . 应急措施及处理方法8 . 相关法律名词及注释：在本文档中，以下是一些常见使用到的法律名词以及其相应解释说明。
a) 生物安全柜 (Biosafety Cabinet, BSC):是用来提供对人员、产品和环境进行防护，并且在其中进行微生物学或细胞培养等活动时，提供无菌条件下能够有效地限制有害因素扩散传播而又不影响正常运行过程。
9. 结束语本文档涵盖了详尽的慢病毒使用操作指南，旨在确保实验室人员正确理解并遵循相关规定以最大程度上降低任何可能存在的危险性。
10. 文档涉及附件：请参考随信发送之文件列表。
金拓思慢病毒产品说明书
金拓思慢病毒产品说明书一、产品简介慢病毒载体是一类重组逆转录病毒载体，由于其结构和功能的特点，慢病毒载体作为一种重要的基因转移工具应用于基因治疗和细胞分子生物学研究领域。
区别于一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型细胞，达到良好的基因治疗效果。
我公司生产的重组慢病毒均以国际通用的第三代载体四质粒体系生产，通过重组改造后将含有目的基因的慢病毒骨架及其相应的作用元件组合为新质粒，并通过辅助质粒将病毒包装的元件组成重组病毒。
通过自我灭活的方式，阻止病毒自我复制。
保证了慢病毒使用过程中的良好生物安全性。
二、重要说明2.1安全操作说明1.应在Ⅱ级及以上级别生物安全柜中使用慢病毒产品。
2.虽经过改造后病毒安全性极大提高，操作中仍需佩戴口罩、手套等安全防护措施以免产生潜在危害。
3.操作中所有接触慢病毒试剂的样品、耗材、器皿等均需通过84消毒液（1:20）浸泡后，高温121℃灭活15min以上。
4.实验过程中有病毒液洒落的情况时，应用纸巾将病毒液吸干后喷洒70乙醇，并将擦干的纸巾一并高温处理以免造成其它伤害、污染环境。
2.2使用注意事项所有慢病毒产品均通过干冰低温运输，请收到产品后立即转入-80℃冰箱保存。
每次使用时提前取出病毒液放置在4℃冰箱待融化，并保存于4℃冰箱。
每次融化后请尽快使用，病毒液应尽量避免反复冻融降低病毒滴度。
三、慢病毒制备与使用3.1实验材料细胞：人贴壁细胞293T培养基：高糖DMEM培养基血清：胎牛血清抗生素：青链霉素转染试剂：Transfection-mate增强剂：Polybrene3.2病毒制备方法3.2.1细胞准备细胞复苏：1.将液氮保存细胞取出后，迅速放入37℃水浴锅内，应及时轻柔摇动加快解冻速度。
2.将完全溶解的细胞离心，1500rpm，3min。
慢病毒包装试剂盒说明书
YRGene 慢病毒包装试剂盒说明书产品编号：LPK010 产品规格：10个10cm 皿 产品简介：赢润生物的慢病毒包装试剂盒包括如下成分：（1） 优化配比的慢病毒包装辅助质粒混合物，可兼容大多数慢病毒表达载体。
（2） 高效转染试剂（Invitrogen Lip2000原装产品分装，293T 细胞转染效率接近 100%）。
（3 ）高效率的慢病毒浓缩液，无需超速离心，也不需要价格昂贵的过滤柱，快速富集病毒粒子，其优 势在于操作安全简单，对设备要求低，产毒效率高，能够快速、高效地收获高滴度病毒。
产品组成：1. 转染前，传代 293FT 细胞于10cm 培养皿中（例如，接种 1 x 107细胞于10cm 培养皿中，使用完全 培养基DMEM+10%FBS培养），当细胞密度能够达到 90-95%即可进行转染。
Tips :培养基里面不要添加抗生素。
2. 转染前1-3小时，更换培养基，加入7ml 新鲜的完全培养基（DMEM+10%FBS ）,注意不要添加抗生素。
3. 准备转染。
在5ml 离心管中，分别配制 A 管与B 管试剂（Tube A and Tube B ）配好后，放置5min ，然后将A 管缓慢加入B 管，混合均匀。
室温放置20min ，使得脂质体-DNA 混合物形成。
Tips :混合后可能会出现淡淡的乳白状，不会影响转染。
然后将混合液逐滴均匀加入 10cm 培养皿，轻微混匀。
置于37C, 5% CO ?培养箱中培养过夜。
4. 第三天，更换培养基，加入 10ml 的完全培养基，同样注意不要加抗生素。
5. 转染后48-72h 后收取上清，转移至 15ml 离心管。
Tips :上清里面含有病毒，请小心操作。
6. 3000rpm 在4C 离心15min ，去除沉淀。
7. 上清液用0.45卩m 滤器过滤后转移到新的离心管中。
慢病毒浓缩：1. 每10ml 过滤后的病毒初始液，加入 Concen Solution 3ml ，每20-30min 混合一次，共进行 3-5次。
慢病毒操作资料说明
慢病毒操作资料说明慢病毒操作资料说明1、Hexadimethrine bromide.pdf：这是Hexadimethrine bromide（别名Polybrene）的说明书，该试剂用于提高慢病毒的感染效率，在病毒滴度测定和病毒感染实验中均需使用；2、Lenti-X™ Concentrator.pdf：这是Lenti-X Concentrator的说明书，该试剂用于病毒粒子的浓缩纯化；3、Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf：这是过表达慢病毒（用于基因过表达）的操作说明书4、Lenti-X™ shRNA Expression Systems User Manual.pdf：这是干扰慢病毒（用于基因干扰）的操作说明书5、pLVX-shRNA1 Vector Information.pdf：pLVX-shRNA1慢病毒干扰载体说明书6、pLVX-IRES-Neo Vector Information.pdf：pLVX-IRES-Neo 慢病毒过表达载体说明书7、慢病毒（Lentivirus）载体.pdf：慢病毒载体介绍8、Lenti-X™ Lentiviral Packaging Systems FAQs.pdf：慢病包装系统常见问题介绍9、病毒纯化-PEG6000.doc：病毒纯化方法10、病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc：病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒；11、病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc：病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒；12、Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.pdf：慢病毒包装、纯化、滴度测定操作指南，供理论学习；13、C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf：磷酸钙转染方法；14、慢病毒实验方法.doc：慢病毒包装报告单；15、慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染.doc：慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染操作指南；。
英茂盛业-EF1a启动子双标非融合慢病毒表达载体
pLV-EF1a-EGFP(2A)Puro Cat. No. VL3404 慢病毒基因过表达载体MCSMluI XhoI SmaIXbaI EcoRI NotI BstBI BamHI TTTCTAGAAA TGTACAAGGA ATTCACGCGT GCGGCCGCCT CGAGTTCGAA CCCGGGCCCG GATCCCTAGA AAAGATCTTT ACATGTTCCT TAAGTGCGCA CGCCGGCGGA GCTCAAGCTT GGGCCCGGGC CTAGGGATCT载体特性：类型：慢病毒基因过表达载体基因启动子：EF1a promoter荧光标签：EGFP真核细胞筛选抗性：Puromycin原核抗性：AmpicillinpLV‐EF1a‐EGFP(2A)Puro载体是基于HIV1的慢病毒基因过表达载体，采用EF1a启动子启动目的基因的表达。
EF1a启动子来源于EF1a启动子来自人类靶向延长因子1α（EF1A）基因，可在多数种类细胞中稳定表达，尤其是某些CMV启动子会发生沉默的细胞，如干细胞。
通过将EGFP基因放在不同的启动子，该载体保留了EGFP蛋白便利性，也避免了融合标签蛋白对目的基因功能产生影响。
PGK启动子驱动表达EGFP基因和Puromycin抗性基因。
可以使用Puromycin筛选出稳定过表达目的基因的细胞。
EGFP基因有助于判断病毒包装效率以及感染效率，同时也有助于稳定细胞的筛选。
pLV‐EF1a‐EGFP(2A)Puro载体包含了生产慢病毒所必须的病毒原件以及提高病毒滴度及基因表达效率的原件。
载体结构紧凑，在保证产生高滴度病毒的同时，载体对外源基因片段的容量达到3kb，多数哺乳动物基因都可以在pLV‐EF1a‐EGFP(2A)Puro中成功表达。
用法说明pLV‐EF1a‐EGFP(2A)Puro载体用于在包括原代培养细胞在内的各种哺乳动物细胞中稳定表达外源基因和Puromycin抗性基因。
慢病毒相关技术介绍
13
7/31/2020
•
提高慢病毒滴度的策略
14
7/31/2020
•
影响慢病毒滴度的因素
转染效率
转染试剂的类型 转染的DNA量 转染的DNA质量
包装细胞
细胞种类 细胞密度 细胞状态
测定滴度
测定滴度时细胞 的选择
测定方法的选择
15
7/31/2020
•
Clontech提高慢病毒滴度的策略
2
提高慢病毒滴度的策略
3
提高转导效率的方法
3
7/31/2020
•
Lenti-X慢病毒包装系统
4
7/31/2020
•
背景简介
病毒包装流程示意图
5
7/31/2020
•
第四代包装系统—Lenti-X™ HTX
将Gag-Pro和RT-IN分离，降低产生具有复制 能力病毒的几率，大大提高生物安全性。
Lenti-X HTX
使用创新型的转染试剂——Xfect™
16
7/31/2020
•
高品质包装细胞系—Lenti-X™ 293T
Time of transfection
Harvest Time
17
7/31/2020
•
Lenti-X 293T VS 293FT
1.50E+08 1.30E+08 1.10E+08 9.00E+07 7.00E+07 5.00E+07 3.00E+07 1.00E+07
泛嗜性vsvg和单嗜性ecolentixhtxpackagingsystem63124749lentixhtxecotropicpackagingsystem6312512慢病毒cdna表达系统高效基因传递系统可用于几乎所有哺乳动物细胞lentixexpressionsystem632164lentixbicistronicexpressionsystemneohygpuro632181233慢病毒rnai表达系统可以获得高效率的rnai可用于几乎所有哺乳动物细胞lentixshrnaexpressionsystem632177august222012134慢病毒诱导表达系统可以在几乎所有哺乳动物细胞中精确地诱导基因表达lentixtetonadvancedinducibleexpressionsystem632162lentixtetoffadvancedinducibleexpressionsystem6321635慢病毒报告系统可用于多种类型细胞lentixddcyangreenredreportersystem6317485153lentixreadytoglowsecretedluciferasereportersystem631746august22201214august22201215转染效率细胞状态包装细胞测定滴度时细胞的选择测定方法的选择测定滴度august22201216策略使用的病毒载体中包含改善载体性能和提高病毒滴度的wprerre和cpptcts序列提供多种病毒载体包装组分中含有经过比例优化的5种非病毒载体引入tetoff诱导表达系统配以tet系统专用的胎牛血清fbs使用高品质的293t包装细胞系lentix293tcelllineaugust22201217timetransfectionharvesttimeaugust22201218100e07300e07500e07700e07900e07110e08130e08150e08lentix293t293fttiterifutiterifuclontech的293t包装细胞获得的病毒滴度是293ft的26倍august22201219哺乳动物细胞用创新型转染试剂xfect应用的细胞类型广泛转染效率高
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
pLVX-EF1α-IRES-Puro pLVX-EF1α-IRES-Puro载体基本信息：出品公司: Clontech载体名称: pLVX-EF1α-IRES-Puro, pLVX-EF1a-IRES-Puro, pLVX-EF1alpha-IRES-Puro 质粒类型: 哺乳动物细胞慢病毒表达载体高拷贝/低拷贝:高拷贝启动子: EF1α/ EF1a克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 8825 bp5' 测序引物及序列:EF-1a Forward: TCAAGCCTCAGACAGTGGTTC3' 测序引物及序列:IRES-R: CCTCACATTGCCAAAAGACG载体标签: --载体抗性: 氨苄青霉素筛选标记: 嘌呤霉素(Puromycin)克隆宿主菌: Stbl3备注: --稳定性: 稳表达组成型: 组成型病毒/非病毒: 慢病毒pLVX-EF1α-IRES-Puro载体质粒图谱和多克隆位点信息：pLVX-EF1α-IRES-Puro载体序列：ORIGIN1 TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAAAGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA61 CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC AGATATCCAC121 TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA 181 ATAAAGGAGA GAACACCAGC TTGTTACACC CTGTGAGCCT GCATGGGATG GATGACCCGG 241 AGAGAGAAGT GTTAGAGTGG AGGTTTGACA GCCGCCTAGC ATTTCATCAC GTGGCCCGAG 301 AGCTGCATCC GGAGTACTTC AAGAACTGCT GATATCGAGC TTGCTACAAG GGACTTTCCG 361 CTGGGGACTT TCCAGGGAGG CGTGGCCTGG GCGGGACTGG GGAGTGGCGA GCCCTCAGAT 421 CCTGCATATA AGCAGCTGCT TTTTGCCTGT ACTGGGTCTC TCTGGTTAGA CCAGATCTGA481 GCCTGGGAGC TCTCTGGCTA ACTAGGGAAC CCACTGCTTA AGCCTCAATA AAGCTTGCCT 541 TGAGTGCTTC AAGTAGTGTG TGCCCGTCTG TTGTGTGACT CTGGTAACTA GAGATCCCTC601 AGACCCTTTT AGTCAGTGTG GAAAATCTCT AGCAGTGGCG CCCGAACAGG GACTTGAAAG 661 CGAAAGGGAA ACCAGAGGAG CTCTCTCGAC GCAGGACTCG GCTTGCTGAA GCGCGCACGG 721 CAAGAGGCGA GGGGCGGCGA CTGGTGAGTA CGCCAAAAAT TTTGACTAGC GGAGGCTAGA 781 AGGAGAGAGA TGGGTGCGAG AGCGTCAGTA TTAAGCGGGG GAGAATTAGA TCGCGATGGG 841 AAAAAATTCG GTTAAGGCCA GGGGGAAAGA AAAAATATAA ATTAAAACAT ATAGTATGGG 901 CAAGCAGGGA GCTAGAACGA TTCGCAGTTA ATCCTGGCCT GTTAGAAACA TCAGAAGGCT 961 GTAGACAAAT ACTGGGACAG CTACAACCAT CCCTTCAGAC AGGATCAGAA GAACTTAGAT 1021 CATTATATAA TACAGTAGCA ACCCTCTATT GTGTGCATCA AAGGATAGAG ATAAAAGACA 1081 CCAAGGAAGC TTTAGACAAG ATAGAGGAAG AGCAAAACAA AAGTAAGACC ACCGCACAGC 1141 AAGCGGCCGG CCGCTGATCT TCAGACCTGG AGGAGGAGAT ATGAGGGACA ATTGGAGAAG 1201 TGAATTATAT AAATATAAAG TAGTAAAAAT TGAACCATTA GGAGTAGCAC CCACCAAGGC 1261 AAAGAGAAGA GTGGTGCAGA GAGAAAAAAG AGCAGTGGGA ATAGGAGCTT TGTTCCTTGG 1321 GTTCTTGGGA GCAGCAGGAA GCACTATGGG CGCAGCGTCA ATGACGCTGA CGGTACAGGC 1381 CAGACAATTA TTGTCTGGTA TAGTGCAGCA GCAGAACAAT TTGCTGAGGG CTATTGAGGC1441 GCAACAGCAT CTGTTGCAAC TCACAGTCTG GGGCATCAAG CAGCTCCAGG CAAGAATCCT 1501 GGCTGTGGAA AGATACCTAA AGGATCAACA GCTCCTGGGG ATTTGGGGTT GCTCTGGAAA 1561 ACTCATTTGC ACCACTGCTG TGCCTTGGAA TGCTAGTTGG AGTAATAAAT CTCTGGAACA 1621 GATTTGGAAT CACACGACCT GGATGGAGTG GGACAGAGAA ATTAACAATT ACACAAGCTT 1681 AATACACTCC TTAATTGAAG AATCGCAAAA CCAGCAAGAA AAGAATGAAC AAGAATTATT 1741 GGAATTAGAT AAATGGGCAA GTTTGTGGAA TTGGTTTAAC ATAACAAATT GGCTGTGGTA 1801 TATAAAATTA TTCATAATGA TAGTAGGAGG CTTGGTAGGT TTAAGAATAG TTTTTGCTGT 1861 ACTTTCTATA GTGAATAGAG TTAGGCAGGG ATATTCACCA TTATCGTTTC AGACCCACCT 1921 CCCAACCCCG AGGGGACCCG ACAGGCCCGA AGGAATAGAA GAAGAAGGTG GAGAGAGAGA 1981 CAGAGACAGA TCCATTCGAT TAGTGAACGG ATCTCGACGG TATCGCCTTT AAAAGAAAAG 2041 GGGGGATTGG GGGGTACAGT GCAGGGGAAA GAATAGTAGA CATAATAGCA ACAGACATAC 2101 AAACTAAAGA ATTACAAAAA CAAATTACAA AAATTCAAAA TTTTCGGGTT TATTACAGGG 2161 ACAGCAGAGA TCCAGTTTAT CGATGAGTAA TTCATACAAA AGGACTCGCC CCTGCCTTGG 2221 GGAATCCCAG GGACCGTCGT TAAACTCCCA CTAACGTAGA ACCCAGAGAT CGCTGCGTTC 2281 CCGCCCCCTC ACCCGCCCGC TCTCGTCATC ACTGAGGTGG AGAAGAGCAT GCGTGAGGCT 2341 CCGGTGCCCG TCAGTGGGCA GAGCGCACAT CGCCCACAGT CCCCGAGAAG TTGGGGGGAG 2401 GGGTCGGCAA TTGAACCGGT GCCTAGAGAA GGTGGCGCGG GGTAAACTGG GAAAGTGATG 2461 TCGTGTACTG GCTCCGCCTT TTTCCCGAGG GTGGGGGAGA ACCGTATATA AGTGCAGTAG 2521 TCGCCGTGAA CGTTCTTTTT CGCAACGGGT TTGCCGCCAG AACACAGGTA AGTGCCGTGT 2581 GTGGTTCCCG CGGGCCTGGC CTCTTTACGG GTTATGGCCC TTGCGTGCCT TGAATTACTT 2641 CCACGCCCCT GGCTGCAGTA CGTGATTCTT GATCCCGAGC TTCGGGTTGG AAGTGGGTGG 2701 GAGAGTTCGA GGCCTTGCGC TTAAGGAGCC CCTTCGCCTC GTGCTTGAGT TGAGGCCTGG 2761 CTTGGGCGCT GGGGCCGCCG CGTGCGAATC TGGTGGCACC TTCGCGCCTG TCTCGCTGCT 2821 TTCGATAAGT CTCTAGCCAT TTAAAATTTT TGATGACCTG CTGCGACGCT TTTTTTCTGG 2881 CAAGATAGTC TTGTAAATGC GGGCCAAGAT CTGCACACTG GTATTTCGGT TTTTGGGGCC 2941 GCGGGCGGCG ACGGGGCCCG TGCGTCCCAG CGCACATGTT CGGCGAGGCG GGGCCTGCGA 3001 GCGCGGCCAC CGAGAATCGG ACGGGGGTAG TCTCAAGCTG GCCGGCCTGC TCTGGTGCCT 3061 GGCCTCGCGC CGCCGTGTAT CGCCCCGCCC TGGGCGGCAA GGCTGGCCCG GTCGGCACCA 3121 GTTGCGTGAG CGGAAAGATG GCCGCTTCCC GGCCCTGCTG CAGGGAGCTC AAAATGGAGG 3181 ACGCGGCGCT CGGGAGAGCG GGCGGGTGAG TCACCCACAC AAAGGAAAAG GGCCTTTCCG 3241 TCCTCAGCCG TCGCTTCATG TGACTCCACG GAGTACCGGG CGCCGTCCAG GCACCTCGAT 3301 TAGTTCTCGA GCTTTTGGAG TACGTCGTCT TTAGGTTGGG GGGAGGGGTT TTATGCGATG 3361 GAGTTTCCCC ACACTGAGTG GGTGGAGACT GAAGTTAGGC CAGCTTGGCA CTTGATGTAA 3421 TTCTCCTTGG AATTTGCCCT TTTTGAGTTT GGATCTTGGT TCATTCTCAA GCCTCAGACA 3481 GTGGTTCAAA GTTTTTTTCT TCCATTTCAG GTGTCGTGAG GATCTATTTC CGGTGAATTC 3541 CTCGAGACTA GTTCTAGAGC GGCCGCGGAT CCCGCCCCTC TCCCTCCCCC CCCCCTAACG 3601 TTACTGGCCG AAGCCGCTTG GAATAAGGCC GGTGTGCGTT TGTCTATATG TTATTTTCCA 3661 CCATATTGCC GTCTTTTGGC AATGTGAGGG CCCGGAAACC TGGCCCTGTC TTCTTGACGA 3721 GCATTCCTAG GGGTCTTTCC CCTCTCGCCA AAGGAATGCA AGGTCTGTTG AATGTCGTGA 3781 AGGAAGCAGT TCCTCTGGAA GCTTCTTGAA GACAAACAAC GTCTGTAGCG ACCCTTTGCA 3841 GGCAGCGGAA CCCCCCACCT GGCGACAGGT GCCTCTGCGG CCAAAAGCCA CGTGTATAAG 3901 ATACACCTGC AAAGGCGGCA CAACCCCAGT GCCACGTTGT GAGTTGGATA GTTGTGGAAA 3961 GAGTCAAATG GCTCTCCTCA AGCGTATTCA ACAAGGGGCT GAAGGATGCC CAGAAGGTAC 4021 CCCATTGTAT GGGATCTGAT CTGGGGCCTC GGTGCACATG CTTTACATGT GTTTAGTCGA4081 GGTTAAAAAA ACGTCTAGGC CCCCCGAACC ACGGGGACGT GGTTTTCCTT TGAAAAACAC 4141 GATGATAAGC TTGCCACAAC CCACAAGGAG ACGACCTTCC ATGACCGAGT ACAAGCCCAC 4201 GGTGCGCCTC GCCACCCGCG ACGACGTCCC CCGGGCCGTA CGCACCCTCG CCGCCGCGTT 4261 CGCCGACTAC CCCGCCACGC GCCACACCGT CGACCCGGAC CGCCACATCG AGCGGGTCAC 4321 CGAGCTGCAA GAACTCTTCC TCACGCGCGT CGGGCTCGAC ATCGGCAAGG TGTGGGTCGC 4381 GGACGACGGC GCCGCGGTGG CGGTCTGGAC CACGCCGGAG AGCGTCGAAG CGGGGGCGGT 4441 GTTCGCCGAG ATCGGCCCGC GCATGGCCGA GTTGAGCGGT TCCCGGCTGG CCGCGCAGCA 4501 ACAGATGGAA GGCCTCCTGG CGCCGCACCG GCCCAAGGAG CCCGCGTGGT TCCTGGCCAC 4561 CGTCGGCGTC TCGCCCGACC ACCAGGGCAA GGGTCTGGGC AGCGCCGTCG TGCTCCCCGG 4621 AGTGGAGGCG GCCGAGCGCG CCGGGGTGCC CGCCTTCCTG GAGACCTCCG CGCCCCGCAA 4681 CCTCCCCTTC TACGAGCGGC TCGGCTTCAC CGTCACCGCC GACGTCGAGG TGCCCGAAGG 4741 ACCGCGCACC TGGTGCATGA CCCGCAAGCC CGGTGCCTAG ACGCGTCTGG AACAATCAAC 4801 CTCTGGATTA CAAAATTTGT GAAAGATTGA CTGGTATTCT TAACTATGTT GCTCCTTTTA 4861 CGCTATGTGG ATACGCTGCT TTAATGCCTT TGTATCATGC TATTGCTTCC CGTATGGCTT 4921 TCATTTTCTC CTCCTTGTAT AAATCCTGGT TGCTGTCTCT TTATGAGGAG TTGTGGCCCG 4981 TTGTCAGGCA ACGTGGCGTG GTGTGCACTG TGTTTGCTGA CGCAACCCCC ACTGGTTGGG 5041 GCATTGCCAC CACCTGTCAG CTCCTTTCCG GGACTTTCGC TTTCCCCCTC CCTATTGCCA 5101 CGGCGGAACT CATCGCCGCC TGCCTTGCCC GCTGCTGGAC AGGGGCTCGG CTGTTGGGCA 5161 CTGACAATTC CGTGGTGTTG TCGGGGAAGC TGACGTCCTT TCCATGGCTG CTCGCCTGTG 5221 TTGCCACCTG GATTCTGCGC GGGACGTCCT TCTGCTACGT CCCTTCGGCC CTCAATCCAG 5281 CGGACCTTCC TTCCCGCGGC CTGCTGCCGG CTCTGCGGCC TCTTCCGCGT CTTCGCCTTC 5341 GCCCTCAGAC GAGTCGGATC TCCCTTTGGG CCGCCTCCCC GCCTGGAATT AATTCTGCAG 5401 TCGAGACCTA GAAAAACATG GAGCAATCAC AAGTAGCAAT ACAGCAGCTA CCAATGCTGA 5461 TTGTGCCTGG CTAGAAGCAC AAGAGGAGGA GGAGGTGGGT TTTCCAGTCA CACCTCAGGT 5521 ACCTTTAAGA CCAATGACTT ACAAGGCAGC TGTAGATCTT AGCCACTTTT TAAAAGAAAA 5581 GAGGGGACTG GAAGGGCTAA TTCACTCCCA ACGAAGACAA GATATCCTTG ATCTGTGGAT 5641 CTACCACACA CAAGGCTACT TCCCTGATTA GCAGAACTAC ACACCAGGGC CAGGGGTCAG 5701 ATATCCACTG ACCTTTGGAT GGTGCTACAA GCTAGTACCA GTTGAGCCAG ATAAGGTAGA 5761 AGAGGCCAAT AAAGGAGAGA ACACCAGCTT GTTACACCCT GTGAGCCTGC ATGGGATGGA 5821 TGACCCGGAG AGAGAAGTGT TAGAGTGGAG GTTTGACAGC CGCCTAGCAT TTCATCACGT 5881 GGCCCGAGAG CTGCATCCGG AGTACTTCAA GAACTGCTGA TATCGAGCTT GCTACAAGGG 5941 ACTTTCCGCT GGGGACTTTC CAGGGAGGCG TGGCCTGGGC GGGACTGGGG AGTGGCGAGC 6001 CCTCAGATCC TGCATATAAG CAGCTGCTTT TTGCCTGTAC TGGGTCTCTC TGGTTAGACC 6061 AGATCTGAGC CTGGGAGCTC TCTGGCTAAC TAGGGAACCC ACTGCTTAAG CCTCAATAAA 6121 GCTTGCCTTG AGTGCTTCAA GTAGTGTGTG CCCGTCTGTT GTGTGACTCT GGTAACTAGA 6181 GATCCCTCAG ACCCTTTTAG TCAGTGTGGA AAATCTCTAG CAGTAGTAGT TCATGTCATC 6241 TTATTATTCA GTATTTATAA CTTGCAAAGA AATGAATATC AGAGAGTGAG AGGCCTTGAC 6301 ATTGCTAGCG TTTACCGTCG ACCTCTAGCT AGAGCTTGGC GTAATCATGG TCATAGCTGT 6361 TTCCTGTGTG AAATTGTTAT CCGCTCACAA TTCCACACAA CATACGAGCC GGAAGCATAA 6421 AGTGTAAAGC CTGGGGTGCC TAATGAGTGA GCTAACTCAC ATTAATTGCG TTGCGCTCAC 6481 TGCCCGCTTT CCAGTCGGGA AACCTGTCGT GCCAGCTGCA TTAATGAATC GGCCAACGCG 6541 CGGGGAGAGG CGGTTTGCGT ATTGGGCGCT CTTCCGCTTC CTCGCTCACT GACTCGCTGC 6601 GCTCGGTCGT TCGGCTGCGG CGAGCGGTAT CAGCTCACTC AAAGGCGGTA ATACGGTTAT 6661 CCACAGAATC AGGGGATAAC GCAGGAAAGA ACATGTGAGC AAAAGGCCAG CAAAAGGCCA6721 GGAACCGTAA AAAGGCCGCG TTGCTGGCGT TTTTCCATAG GCTCCGCCCC CCTGACGAGC6781 ATCACAAAAA TCGACGCTCA AGTCAGAGGT GGCGAAACCC GACAGGACTA TAAAGATACC6841 AGGCGTTTCC CCCTGGAAGC TCCCTCGTGC GCTCTCCTGT TCCGACCCTG CCGCTTACCG6901 GATACCTGTC CGCCTTTCTC CCTTCGGGAA GCGTGGCGCT TTCTCATAGC TCACGCTGTA6961 GGTATCTCAG TTCGGTGTAG GTCGTTCGCT CCAAGCTGGG CTGTGTGCAC GAACCCCCCG7021 TTCAGCCCGA CCGCTGCGCC TTATCCGGTA ACTATCGTCT TGAGTCCAAC CCGGTAAGAC7081 ACGACTTATC GCCACTGGCA GCAGCCACTG GTAACAGGAT TAGCAGAGCG AGGTATGTAG7141 GCGGTGCTAC AGAGTTCTTG AAGTGGTGGC CTAACTACGG CTACACTAGA AGAACAGTAT7201 TTGGTATCTG CGCTCTGCTG AAGCCAGTTA CCTTCGGAAA AAGAGTTGGT AGCTCTTGAT7261 CCGGCAAACA AACCACCGCT GGTAGCGGTG GTTTTTTTGT TTGCAAGCAG CAGATTACGC7321 GCAGAAAAAA AGGATCTCAA GAAGATCCTT TGATCTTTTC TACGGGGTCT GACGCTCAGT7381 GGAACGAAAA CTCACGTTAA GGGATTTTGG TCATGAGATT ATCAAAAAGG ATCTTCACCT7441 AGATCCTTTT AAATTAAAAA TGAAGTTTTA AATCAATCTA AAGTATATAT GAGTAAACTT7501 GGTCTGACAG TTACCAATGC TTAATCAGTG AGGCACCTAT CTCAGCGATC TGTCTATTTC7561 GTTCATCCAT AGTTGCCTGA CTCCCCGTCG TGTAGATAAC TACGATACGG GAGGGCTTAC7621 CATCTGGCCC CAGTGCTGCA ATGATACCGC GAGACCCACG CTCACCGGCT CCAGATTTAT7681 CAGCAATAAA CCAGCCAGCC GGAAGGGCCG AGCGCAGAAG TGGTCCTGCA ACTTTATCCG7741 CCTCCATCCA GTCTATTAAT TGTTGCCGGG AAGCTAGAGT AAGTAGTTCG CCAGTTAATA7801 GTTTGCGCAA CGTTGTTGCC ATTGCTACAG GCATCGTGGT GTCACGCTCG TCGTTTGGTA7861 TGGCTTCATT CAGCTCCGGT TCCCAACGAT CAAGGCGAGT TACATGATCC CCCATGTTGT7921 GCAAAAAAGC GGTTAGCTCC TTCGGTCCTC CGATCGTTGT CAGAAGTAAG TTGGCCGCAG7981 TGTTATCACT CATGGTTATG GCAGCACTGC ATAATTCTCT TACTGTCATG CCATCCGTAA8041 GATGCTTTTC TGTGACTGGT GAGTACTCAA CCAAGTCATT CTGAGAATAG TGTATGCGGC8101 GACCGAGTTG CTCTTGCCCG GCGTCAATAC GGGATAATAC CGCGCCACAT AGCAGAACTT8161 TAAAAGTGCT CATCATTGGA AAACGTTCTT CGGGGCGAAA ACTCTCAAGG ATCTTACCGC8221 TGTTGAGATC CAGTTCGATG TAACCCACTC GTGCACCCAA CTGATCTTCA GCATCTTTTA8281 CTTTCACCAG CGTTTCTGGG TGAGCAAAAA CAGGAAGGCA AAATGCCGCA AAAAAGGGAA8341 TAAGGGCGAC ACGGAAATGT TGAATACTCA TACTCTTCCT TTTTCAATAT TATTGAAGCA8401 TTTATCAGGG TTATTGTCTC ATGAGCGGAT ACATATTTGA ATGTATTTAG AAAAATAAAC8461 AAATAGGGGT TCCGCGCACA TTTCCCCGAA AAGTGCCACC TGACGTCGAC GGATCGGGAG8521 ATCAACTTGT TTATTGCAGC TTATAATGGT TACAAATAAA GCAATAGCAT CACAAATTTC8581 ACAAATAAAG CATTTTTTTC ACTGCATTCT AGTTGTGGTT TGTCCAAACT CATCAATGTA8641 TCTTATCATG TCTGGATCAA CTGGATAACT CAAGCTAACC AAAATCATCC CAAACTTCCC8701 ACCCCATACC CTATTACCAC TGCCAATTAC CTGTGGTTTC ATTTACTCTA AACCTGTGAT8761 TCCTCTGAAT TATTTTCATT TTAAAGAAAT TGTATTTGTT AAATATGTAC TACAAACTTA8821 GTAGT//pLVX-EF1α-IRES-Puro其他相关慢病毒载体：Tet-pLKO-neo Tet-pLKO-puro pPACKH1-GAG pMD2.G pCMV-dR8.2-dvpr pLKO.1-GFP-shRNA pLKO.1-TRC control pLKO.1-hygro pLKO.1-TRC pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro FUW-tetO-hOKMS FUW-tetO-hOCT4 FUW-tetO-hSOX2 FUW-tetO-hKLF4FUW pLVX-AcGFP1-N1 pLVX-AcGFP1-C1pLVX-AmCyan1-N1 pLVX-DsRed-Express2-C1 pLVX-DsRed-Express2-N1 pLVX-DsRed-Monomer-N1 pLVX-PAmCherry-C1 pLVX-PAmCherry-N1pLVX-ZsGreen1-N1 pLVX-IRES-ZsGreen1 pLVX-IRES-mCherrypLVX-mCherry-C1 pLVX-mCherry-N1 pLVX-tdTomato-C1pLKO.1-puro pLentilox 3.7 pLVX-Tet-On-Advanced pLVX-IRES-Puro pLVX-IRES-Neo pLVX-IRES-HygpLVX-EF1α-DsRed-Monomer-C1 pLVX-EF1α-AcGFP1-N1 pLVX-EF1α-AcGFP1-C1 pLVX-EF1α-mCherry-C1 pLVX-EF1α-IRES-mCherry pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1 pLVX-MetLuc Control pLVX-MetLuc pLVX-Hom-Mem1pLVX-Het-2 pLVX-DD-AcGFP1-Actin pPRIME-TET-GFP-FF3pSIH1-H1-CopGFP pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro pCDF1-MCS2-EF1-copGFP pLOX-CWBmi1 pLOX-CW-CREpRSV-rev pMDLg-pRRE pLL3.7pLVX-DD-AmCyan1 Control pLVX-DD-AmCyan1 Reporter pLVX-DD-tdTomato Reporter pLVX-DD-tdTomato Control pLVX-PTuner-Green pLVX-CherryPicker2pLVX-TetOne-Puro-Luc pLVX-TetOne pLVX-TetOne-PuropLVX-TetOne-Luc pLVX-rHom-Nuc1 pLVX-rHom-Sec1pLVX-rHom-1 pLVX-Hom-Nuc1 pLVX-Het-Nuc1pLVX-PTuner pLVX-PTuner2 pLVX-DD-ZsGreen1 Reporter pLVX-Het-1 pLVX-CherryPicker Control pLVX-Tet3GpCDH-CMV-MCS-EF1-RFP-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-Hygro pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo pCDH-MCS-T2A-Puro-MSCV pCDH1-MCS2-EF1-copGFP pCDF1-MCS2-EF1-Puro pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP pWPXL pLVX-TRE3G-ZsGreen1 pLVX-TRE3G-mCherry pLenti6.3-EmGFP-BveI miR pLenti6/V5-GW/lacZpLenti6.3/V5-GW/EmGFP pLenti6.3-MCS pLenti6.3-DsRed2-BveI miR pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP pLVX-shRNA2 psPAX2VSV-G pSico PGK Puro pcDNA6.2-DsRed2-MCS1 miR pcDNA6.3-EmGFP-NC- II pcDNA6.2-EmGFP-NC- I pcDNA6.2-EmGFP-BsaI miR pLenti6.3-BveI miR pLenti6.3-MCS-IRES2-DsRed2 pLEX-MCSpGIPZ pLP2 pLP1FUGW pFUGW pLOX-Ttag-iresTKpMDLg/pRRE pLentG-KOSM pCMV-dR8.91pLVX-TRE3G-Luc Control pLVX-TRE3G-IRES pCgpvpSico pSicoR pLVTHMpGensil-1 pLVX-EF1α-IRES-Puro pCDF1-MCS2-EF1-copGFP pPACKH1-REV pLVX-Het-Mem1 pLVX-shRNA1pLKO.1-puro-GFP-siRNA pPRIME-TREX-GFP-FF3 pcDNA6.2-DsRed2-BsmBI miR pCDH-MSCV-MCS-EF1-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP pLVX-TRE3GFUW-tetO-hMYC pLOX-TERT-iresTK pLP/VSVGFUW-M2rtTA pCDH-EF1-MCS-(PGK-Puro) pcDNA6.2-EmGFP-MCS1 miR pLVX-AmCyan1-C1 pLVX-Hom-1 pcDNA6.2-BsaI miRpLVX-DsRed-Monomer-C1 pLVX-mCherry-Actin pTRIPZpLVX-ZsGreen1-C1 pLVX-CherryPicker1 LeGO-iC2pLVX-IRES-tdTomato pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro pLKO.3GpLVX-tdTomato-N1 pLVX-PTuner2-C pLVX-Puro pLVX-Tight-Puro pLVX-DD-ZsGreen1 Control pSicoR PGK Puro pLVX-EF1α-DsRed-Monomer-N1 pCDH-UbC-MCS-EF1-Hygro pLVTHpLVX-EF1α-mCherry-N1 pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP。