棉花课题组实验操作手册

棉花基本生物技术

操作手册

华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室

棉花课题组

二00三年七月·武汉

目录

1.MS培养基母液配制 (1)

2.棉花胚性愈伤的诱导及植株再生 (2)

3.棉花原生质体操作 (3)

4.根癌农杆菌介导的遗传转化 (6)

5.DNA的提取和检测 (8)

6.RNA的提取和检测 (10)

7.分子标记……………………………………………

8.分子杂交……………………………………………

前言

随着本课题组科研队伍的不断壮大，科研工作的全面开展和深入，各个研究方向开始交流渗透，急需一本规范的实验操作手册为课题组各个成员提供指导.手册是由本课题组多个研究方向的成员参照标准的操作程序结合自身的经验编写而成,因此具有一定的科学性和可操作性。这本手册是在张献龙教授的大力倡导和支持下完成的，课题组各个成员都积极参与了手册的编辑，在此一并致谢。金双侠编写了手册第一，二，八部分；孙玉强编写了第三部分；梁绍光编写了第四部分；朱龙付编写了第五部分；涂礼莉编写了第六部分；贺道华编写了第七部分。杨细燕负责部分文字的输入及编辑工作，涂礼莉负责全文的校对和编辑工作。这本手册的编辑是本课题组第一次有益的尝试，经验不足，难免有许多纰漏，期盼课题组在今后的不断发展中能够不断改进和丰富这本手册。

MS培养基母液配制

一、大量元素（20倍）母液(g/L)

KNO3 38

NH3NO3 33

MgSO4·7H2O(无水MgSO4) 7.4(3.8)

KH2PO4 3.4

CaCl2·2H2O(无水CaCl2) 8.8(6.6)

二、微量元素（100倍）母液(g/L)

CoCl2·6H2O 0.0025

CuSO4·5H2O 0.0025

H3BO3 0.62

KI 0.083

MnSO4·4H2O 2.23

NaMO4·2H2O 0.025

ZnSO4·7H2O 0.86

三、铁盐（100倍）母液(g/L)

FeSO4·7H2O 2.78

Na2EDTA 3.73

四、B5有机物

VB

(硫胺素) 10mg/l

1

（盐酸吡哆醇） 1mg/l

VB

5

（烟酸） 1mg/l

VB

6

肌醇 100mg/l

甘氨酸 2mg/l

五、生长调节剂

生长素（2，4-D、IBA、IAA、NAA等）

细胞分裂素（KT、ZT等）

母液配制注意事项：

1. 配制大量元素时各种药品分别称量，分别充分溶解,逐一加到容量瓶中，一定要最后加入CaCl2否则容易产生沉淀,定容到一升。

2. 配制微量元素时几种极微量药品先可以配成一级母液(浓缩10000倍)，再稀释

成二级母液(浓缩100倍)，母液配制完毕后放置于室温下10小时以上，看是否有沉淀产生，然后才能使用。

3. 配制铁盐时,两种盐用热水分别溶解,然后混合，放置于室温下10小时以上看是否有沉淀产生,然后才能使用。

4. 各种生长激素一般可以用1摩尔/升的NaOH或HCl溶解后，再定容。

5. 配制B5有机物时要用无菌水来配制，一次不要配太大体积，及时用完以防污染

6. 各种母液配制好后应存放在4℃冰箱中,发现有沉淀后，不得使用。

棉花组织培养

一、无菌苗的培养

将棉籽壳去掉，用0.1/100的升汞灭菌十分钟，无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培养基中配方如下：2/1 MS大量元素+葡萄糖15克/l+phytagel

2.5g/l，三至四天暗培养，一至二天光照培养。

二、愈伤组织的诱导

选取无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0.5～0.6cm小段，接种于诱导培养基上配方如下：

MS无机盐+B5有机物+2,4-D 0.1mg/l+ KT0.1mg/l葡萄糖30g/l+phytagel

2.5g/l

三、非胚性愈伤组织的增殖

MS无机盐(硝酸钾加倍，硝酸铵减半) +B5有机物+2,4-D 0.05mg/l+ KT0.1mg/l葡萄糖30g/l+phytagel 2.5g/，或者是MS无机盐(硝酸钾加倍，硝酸铵减半) +B5有机物+葡萄糖30g/l+phytagel 2.5g/l(针对那些增殖迅速的愈伤)。

四、愈伤组织的分化

愈伤组织经继代几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基（MS + B5有机物+葡萄糖30g/L + phytagel 2.5g/l + KT0.15mg/l

+IBA0.5 mg/l）中，进一步分化成胚状体。

五、胚性愈伤组织的继代

MS无机盐(硝酸钾加倍,硝酸铵减半) +B5有机物+IBA0.5mg/l+ KT0.15mg/l+Gln(谷胺酰胺)1.0mg/l+Asn(天冬酰胺)0.5mg/l+葡萄糖

30g/l+phytagel 2.5g/l

六、成苗生根培养基

MS无机盐(硝酸钾加倍,硝酸铵减半) +B5有机物+IBA0.5mg/l+ NAA0.5mg/l+Gln1.0mg/l+Asn0.5mg/l+葡萄糖30g/l+phytagel 2.5g/l

七、胚性愈伤组织的悬浮培养基

MS无机盐+B5有机物+Gln(谷胺酰胺)0.2mg/l+Asn(天冬酰胺)0.2mg/l+NaCl 1.0g/l +KCl 1.0g/l+葡萄糖30g/l

棉花原生质体操作

一、材料的准备

1. 胚性细胞悬浮系的建立：从固体培养基上取继代两周的胚性愈伤组织于

MS+谷氨酰胺0.2 g/l+ 天门冬酰胺0.2 g/l+葡萄糖30 g/l的液体培养基中

(每瓶40 ml), 120转振荡培养, 每7天继代一次, 4周后可以用于原生质

体分离。

2. 无菌苗的培养：种子去壳消毒播种在1/2MS 培养基上, 10天后叶片充分

伸展开后可分离原生质体。

二、原生质体的分离

1. 悬浮系原生质体的分离：用吸管吸取1 g左右的悬浮培养物于15×60

mm的培养皿中，吸干培养基，加入1.5-3 ml 酶混合液,轻轻摇匀,封口膜

封口, 置于摇床上40转或静置, 28℃黑暗条件下酶解18-22小时。

2. 叶肉原生质体的分离: 把叶片放在15×60mm的培养皿中,并用解剖刀将

叶片切成0.1 cm宽的细条, 后加入1.5 ml 酶混合液,轻轻摇匀,封口膜封

口, 置于摇床上10转或静置, 28 ℃黑暗条件下酶解14-18小时。

三、原生质体的纯化

1. 酶解后的原生质体混合物经40目的不锈钢网去掉渣子,CPW9M 洗涤,

滤液在10ml 的离心管离心10分钟(800rpm), 使原生质体沉于管底。

2. 沉淀物用3 ml CPW25S 悬浮, 在其上加入1ml 的CPW9M 离心2-6分

钟(700rpm), 原生质体在两液面形成一条带, 其他的杂质及少量的原生

质体沉于管底。

3. 将原生质体轻轻地吸出, 转入另一试管, 用电融合液离心洗涤5-6 分

钟(700rpm), 去掉上清夜, 用电融合液悬浮至2-10×105/ml 备用。

四、原生质体活性检测

FDA 溶液(5 mg/ml)按25 μl FDA/ml 原生质体的比例加入FDA, 5分钟后, 在荧光显微镜下检测原生质体的活性(暗视野下发荧光的原生质体数/明视野下原生质体总数)。

五、原生质体融合 (电融合)

1.将悬浮好的双亲的原生质体等体积混合。

2.用吸管取大约1.6 ml 悬浮液于环形融合小槽(FTC-4), Parafilm 封口。

3.静置5-10分钟,等大量的原生质体沉淀后, 在选择好融合参数下诱导融

合, 可以在倒置显微镜下观察。

4.融合后静置10-20分钟, 以便融合的原生质体球形化。