实验四 细菌
实验四食品中细菌菌落总数的测定
4、若所有稀释度平板菌落数均<30， 则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍 数计算。
5、若所有稀释度平板均无菌落生长， 则应按<1乘以最低稀释倍数计算。
6、若所有稀释度均不在30～300之间， 有的>300，有的又<30，则应以最接近 300或30的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
（四） 菌落计数报告方法
（二） 菌落记录方法 做平板菌落数记录时，可用肉眼观察
，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在 记下各皿的菌落总数后，求出同稀释 度的各平板平均菌落数。
到达规定培养时间，应立即计数。如果 不能立即计数，应将平板放置于0～4℃ ，但不要超过24h。
1、 平皿菌落数的选择 选取菌落数在30～300之间的平板作
例如：
稀释度 1:100（第一稀释度） 1:1000（第二稀释度）
菌落数 232，244
33，35
232+244+33+35 (2+0.1×2) ×10-2
=544/0.022=24727
四舍五入表示为: 2.5 × 104
3、 若所有稀释度的平板菌落数均 >300，则取最高稀释度的平均菌落数乘 以稀释倍数计算。
酱油（GB/T2717-2003）： 细菌菌落总数： ≤30000 CFU/mL 大肠菌群： ≤30MPN/100mL 肠道致病菌： 不得检出
全脂奶粉、脱脂奶粉（GB5410-1999）：
特级 一级 二级
细菌菌落总数：≤20000 ≤30000 ≤50000
（CFU/ml）
大肠菌群
≤40
≤90
≤90
一、 目的
1、 学习并掌握食品中菌落总数测定方 法和原理。 2 、了解菌落总数测定在对被样品进行 卫生学评价中的意义 。
实验四细菌质粒的接合转移
转移子的筛选
• 筛选培养基为：基本培养基+抗生素；
供体和辅助大肠杆菌均营养缺陷型，不能 在基本培养基上生长；
未转化成功的受体菌不能在有抗生素的平 板上生长。
三：实验菌株
• 供体菌：E.coli DH5α(pTR102) (TcR)，含有 mob基因 ；
• 受体菌: 紫云英根瘤菌 ( TcS) ； • 辅助菌: E. coli MM294 (pPK2073)（SpeR），
大肠杆菌：F因子、R1、R100、R6K、RP4…… 天蓝色链霉菌：致育性因子pSCP1、pSCP2……
• 2．非转移型质粒：多为高拷贝的小质粒，如大肠 杆菌的ColE1、RSF1010等。由于缺少转移基因 （tra），不能自主转移，但由于含有与F质粒类似 的bom（或nic）位点或诱动基因mob （mobilization），因而能被带有tra基因的转移性 质粒诱动而发生转移。
二：基本原理
• 在质粒转移过程中，供体菌与受体菌 细胞通过结合作用紧密接触，质粒从 供体细胞向受体转移，同时进行质粒 复制，这就是结合转移的过程。按能 否自主转移，将天然存在的质粒分为 两大类。
• 1．转移型质粒：多为低拷贝的大质粒，含有完整 的转移操纵子基因（tra）和转移起始位点。能在同 种或亲缘关系近的菌体细胞间进行转移。例如：
操作步骤（第一天）
• 用可调定量移液器吸取供体、辅助菌各 0.4ml， 吸受体菌0.6ml，都加入同一eppdorf管内（每个 同学做1管），放入离心机内，10000转/min 离 心1分钟。
• 倒上清，向沉淀加 1ml 的 TY液体，用 tip上下抽 吸，洗涤菌体，再10000转/min离心1分钟，倒上 清，留100μl左右用于悬浮菌体。
实验四细菌革兰氏染色与芽孢染色
实验四细菌的革兰氏染色与芽孢染色一、目的要求1.学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。
2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验材料1.菌种：金黄色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）大肠杆菌（E.coli）2.试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。
三、实验原理革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的。
通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。
革兰氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。
经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革兰氏阴性菌。
大肠杆菌是标准的革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革兰氏阳性菌。
革兰氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。
经结晶紫初染以后，所有的细菌都被染成蓝紫色。
碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。
用蕃红复染时染上红色。
四、操作步骤1.细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。
2.制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。
3.初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。
4.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。
5.脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色时，立即水洗。
实验四：细菌的接种、培养和分离技术
实验四：细菌的接种、培养和分离技术一、实验目的与要求：（1）掌握从环境土壤、水体、活性污泥等中分离培养细菌的方法;从而获得若干种细菌纯培养技能（2）掌握细菌纯种分离的方法：稀释平板分离法和平板划线法..（3）掌握几种接种技术：斜面接种技术、穿刺接种、稀释平板涂布法等..二、实验原理在土壤、水、空气或人及动、植物体中;不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起;当我们希望获得某一种微生物时;就必须从混杂的微生物类群中分离它;以得到只含有这一种微生物的纯培养;这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化..为了获得某种微生物的纯培养..一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同;而供给它适宜的培养条件;或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长;而抑制其他菌生长的环境;从而淘汰其他一些不需要的微生物;再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物;直至得到纯菌株..三、实验器材1、牛肉膏蛋白胨培养基2、盛9ml无菌水的试管;盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶;1ml和5ml无菌吸管;无菌培养皿；3、接种环;土样;酒精灯等..四、操作步骤1、倒平板将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基倒平板;并标明培养基的名称..2、贴标签接种前在试管上贴上标签;注明菌名、接种日期、接种人姓名等..贴在距试管口径2-3厘米的位置..3、点燃酒精灯..4、接种取接种环右手拿接种环如握钢笔一样、在火焰上将环端烧红灭菌;然后将有可能伸入试管的其余部分;均用火烧过灭菌..环冷却将灼烧过的接种环伸入菌种管;先使环接触边壁;使其冷却..取菌种待环冷却后轻轻沾取经稀释10倍的土壤悬液-环;然后将接种环移出菌种管;注意不要使环的部分碰到管壁;取出后不可使环通过火焰..接种在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环在平板上划线..划线的方法很多;但无论哪种方法划线;其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释;使形成单个菌落..常用的划线方法有下列二种：⑴用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环;先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条;再转动培养皿约70°角;并将接种环上剩余物烧掉;待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线;再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线图A..划线完毕后;盖上皿盖;倒置于温室培养..⑵将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线图 B..划线完毕后;盖上皿盖;倒置温室培养..环灭菌将接种环烧红灭菌..5、挑菌将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上;分别置25℃和28℃温室中培养;待菌苔长出后;检查菌苔是否单纯;也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物;若有其他杂菌混杂;就要再一次进行分离、纯化;直到获得纯培养..四、注意事项1、实验操作过程中无菌操作..。
实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养
实验报告课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察学生姓名：专业：环境工程学号：同组学生姓名：指导老师：实验地点：实验日期：2018 年 10月16日一、实验目的和要求1.掌握微生物接种培养技术2.掌握微生物分离纯化技术3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。
二、实验内容和原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。
在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。
为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。
通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。
挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。
1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的混入。
2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
用途一般多用于筛选菌株。
实验四 细菌接种培养法与生长现象观察
实验四细菌的接种培养法与生长现象的观察【目的和要求】1．掌握无菌技术，建立无菌观念；明确无菌操作时注意要点。
2．掌握细菌的接种、分离培养方法和接种环的制作方法。
3．熟悉细菌生长现象的观察方法。
【试剂与器材】1．菌种：葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌等。
2．培养基：固体、半固体、液体培养基。
3．其他：温箱、酒精灯、接种环、接种针、L形玻棒、打火机、记号笔等。
【实验内容】一、细菌的接种工具1．接种环和接种针：其结构包括环（针）、金属柄、绝缘柄三部分（见图4-1）。
其中环（针）部分最佳材料为白金丝，因其受热和散热速度快，硬度适宜，不易生锈且经久耐用，但因为价格昂贵而限制了其应用。
目前实验室常用的是经济实用的300~500W电热镍鉻丝。
一般要求接种环长5~8cm，直径为2~4mm，定量接种环的容量为0.001ml。
图4-1 接种环和接种针接种环（针）在使用之前需检查镍鉻丝是否呈直线，若有弯曲，需用吸管或接种环的另一端将其压直；若环不圆，可将镍鉻丝前端放在吸管尖部缠绕一圈，再将镍鉻丝突出的部分朝内压紧。
接种环用于固体、液体培养基的接种，接种针用于半固体培养基的接种。
2．L形玻棒：由直径2~3mm的玻璃棒弯曲成L形制成。
在使用之前用厚纸包扎后置高压蒸汽灭菌，或沾取无水乙醇后在火焰上烧灼灭菌。
主要用于液体标本涂布接种。
二、细菌的接种方法1．液体培养基的接种该法主要用于细菌的增菌培养或进行细菌的生化反应。
方法：（图4-2）（1）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许细菌。
（2）左手拿试管，右手持接种环，用右手其余手指将试管塞打开，试管口通过火焰烧灼灭菌。
（3）将接种环在贴近液面的管壁上上下碾磨数次，使细菌均匀分布于培养基中。
（4）将试管口灭菌后加塞，接种环烧灼灭菌后放回原处。
（5）在试管上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。
图4-2 液体培养基接种法2．半固体培养基的接种该法可用于保存菌种、观察细菌的动力或进行细菌的生化反应。
实验四四大类微生物菌落及个体形态观察
一、实验目的：
比较四大类微生物菌落特征; 学习自制水浸片观察霉菌的个体形态.
二、实验原理
1、菌落观察
微生物菌落即微生物聚集在一起的群体结构。 在自然界中，我们肉眼所见到的微生物都是以菌 落状态存在，不同种类的微生物有其特定的群体 结构。因此，根据群体结构（菌落特征），我们 可以初步把它们“分门别类”作粗略鉴定。本实 验通过对细菌、放线菌、酵母菌，霉菌等四大类 微生物菌落特征的观察，学习以菌落特征来区分 四大类微生物的基本方法。
③ 培养：将平板倒置，于28℃培养3-5天；
④ 镜检：用镊子小心取出盖玻片，用纸擦去背面培 养物，有菌面朝上放在载玻片上，通过显微镜直接 用低倍镜和高倍镜镜检观察（在盖玻片菌体附着部 位低价0.1%吕氏碱性美蓝染色后观察效果更好）。
（三）霉菌观察方法
制水浸制片观察法：在载玻片上滴加一滴蒸馏水， 用解剖针从生长有霉菌的平板中挑取少量带有孢 子的霉菌菌丝，放入载玻片上的水滴中,盖上盖 玻片（勿使产生气泡，且不要再移动盖玻片）. 标本片制好后，先用低倍镜观察，必要时再换高 倍镜。注意观察菌丝有无隔膜，有无假根、足细 胞等特殊形态的菌丝。注意其无性繁殖器官的形 状和构造，孢子着生的方式和孢子的形态、大小 等。
根霉（Rhizopus)
曲霉(Aspergillus)
青霉（Penicillium)
五、实验作业
（1）参考书本63页表描述细菌、放线菌 和霉菌的菌落形态.
（2）绘出根霉、青霉、曲霉的个体形态 图，并注明各部位名称。
第四组值日生值日
2、放线菌观察
放线菌自然生长的个体形态的观察常用盖 玻片插片培养法。 采用盖玻片插片培养法，能使放线菌生长 在盖玻片上，然后将长菌的盖玻片用镊子 取出，贴放在载玻片上，用显微镜镜检可 见到放线菌自然生长的个体形态。
实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养
实验报告课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察学生姓名：专业：环境工程学号：同组学生姓名：指导老师：实验地点：实验日期：2018 年 10月16日一、实验目的和要求1.掌握微生物接种培养技术2.掌握微生物分离纯化技术3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。
二、实验内容和原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。
在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。
为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。
通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。
挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。
1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的混入。
2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
用途一般多用于筛选菌株。
实验四细菌质粒的接合转移
在选择性培养基上，统计接合子的数 量。通过比较供体菌和受体菌的接合 子数量，可以计算出接合转移的效率 。
质粒转移频率计算
质粒转移频率是指每个供体菌细胞所 能产生的接合子的数量。通过比较供 体菌和接合子的数量，可以计算出质 粒转移的频率。
影响因素分析
供体菌和受体菌的浓度
培养基成分
接合时间
实验结果的可靠性分析
在实验过程中，可能存在一些误差和不确定性因素，如操作误差、仪器误差等。因此， 需要对实验结果进行可靠性分析，以评估实验结果的准确性和可信度。
05
实验注意事项与技巧
实验安全规范
01
02
03
实验室防护
实验人员需穿戴实验服、 手套、口罩等防护用品， 确保实验室环境干净、整 洁。
废弃物处理
在本实验中，通常选择含有某种特定质粒的细菌作为供体菌，而选择不含该质粒的细菌作 为受体菌。通过接合转移，观察受体菌是否获得供体菌的质粒并表达相应的性状。
02
实验材料
菌株与质粒
供体菌
质粒
含有待转移质粒的大肠杆菌菌株，如 DH5α或JM109等。
待转移的质粒，应包含所需的基因和 选择性标记，如抗生素抗性基因。
接合混合物的制备
将供体菌、受体菌及连接产物混合， 加入适量的接合剂，形成接合混合物 。
接合反应
将接合混合物涂布于选择性培养基上 ，倒置培养过夜，使供体菌与受体菌 发生接合反应。
接合子的筛选与鉴定
挑取选择性培养基上的接合子进行扩 大培养，并提取质粒进行酶切分析和 测序鉴定。
04
实验结果与分析
接合转移效率的计算
在无菌条件下进行接合转移操作，避免污染。同时， 控制接合时间和温度等条件，以提高接合效率。
实验四 荧光显微镜细菌计数
四、实验步骤
1、滤器装配 放置滤膜（光滑面朝上）装好滤器及抽滤装置。
2、细菌染色 加5ml蒸馏水于滤器中，移入适量样品（控
制在每个视野出现菌体50个左右），再滴入10％ 的吖啶橙，混匀，染色2min。 3、抽洗滤膜
用蒸馏水淋洗滤器内壁2-3次，并抽滤至滤 膜刚好呈湿润状态。 4、制片 加一滴荧光显微镜油于载玻片上，贴上载菌体的 滤膜，再向滤膜加一滴油，盖上盖玻片（滤膜两面均 不能有气泡）。
而死细胞呈绿色荧光。
三、实验材料
1、细菌水样
2、试剂： 1）吖啶橙（AO） 吖啶橙（AO）染色液：将0.1g吖啶橙染
色剂溶于100ml蒸馏水，经0.22μm滤膜过滤。可 于冰箱4度中存放两周。
2）甲醛溶液
经0.22μm滤膜过滤的40%（V/V）甲醛溶 液。
3） 无菌水、低荧光浸润油等。 3、主要仪器设备
Hale Waihona Puke 五、实验结果1. 显微计数：在荧光显微镜镜下，随机取20个视 野，计算呈亮绿色和桔红色的个体数。
2. 计算样品含菌数。
N=X*Na*S/(St*V) N: 样品含菌数, 个/ml Na：各视野平均菌数，
个 X: 样品稀释倍数 S: 滤膜滤水面积, cm2 St: 视野面积, cm2 V: 过滤样品量, ml
实验四 荧光显微镜细菌计数
一、实验目的 1.了解水样细菌的荧光显微镜计数原理; 2. 掌握水样细菌的荧光显微镜计数方法。
二、实验原理
吖啶橙(Acridine Orange)是吖啶的衍生物之一。 它是一种荧光染料，激发峰492nm，荧光发射峰 530nm(DNA)，640nm(RNA)，它与双链DNA的结合方式 是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引 堆积在其磷酸根上。在蓝光(给502nm)激发下，DNA 发出绿色荧光(约530nm)，RNA发桔红色荧光(＞ 580nm)。吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多 糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合， 从而主要显示DNA、RNA两种核酸。细菌经吖啶橙染 色后，在荧光显微镜下观察，活细胞呈橙色荧光，
实验四 细菌在培养基中的生长表现与生化实验讲解
普 通 平 板
实验四 细菌在培养基中的生长表现及细菌的生化试验
二、细菌的常用生化反应 糖发酵试验 V P 试验 甲基红试验 枸橼酸盐试验 吲哚试验 硫化氢试验 尿素酶试验
糖发酵试验 不同细菌分解糖类的能力和代谢产物不 同。例如大肠埃希菌能发酵葡萄糖和乳糖；而伤寒沙门菌可 发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖。
在液体培养基中生长情况：大多数细菌在液体培养基生 长繁胞杆菌、结核分枝杆菌等专性需氧菌呈表面生长，常 形成菌膜。
在固体培养基中生长情况：各种细菌在固体培养基上 形成的菌落，在大小、形状、颜色、气味、透明度、表面 光滑或粗糙、湿润或干燥、边缘整齐与否，以及在血琼脂 平板上的溶血情况等均有不同表现，这些有助于识别和鉴 定细菌。
甲基红（methyl red）试验 产气杆菌分解葡萄糖产生丙 酮酸，后者经脱羧后生成中性的乙酰甲基甲醇，故培养液 pH>5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，是为甲基红试验阴性。大 肠埃希菌分解葡萄糖产生丙酮酸，培养液pH ≤4.5，甲基红 指示剂呈红色，则为甲基红试验阳性。
枸橼酸盐利用试验 当某些细菌（如产气杆菌）利用铵 盐作为唯一氮源，并利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，可在 枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，并分 解铵盐生成氨，使培养基变为碱性，是为该试验阳性。大 肠埃希菌不能利用枸橼酸盐为唯一碳源，故在该培养基上 不能生长，是为枸橼酸盐试验阴性。
在半固体培养基中生长情况半固体培养基粘度低，有鞭毛 的细菌在其中仍可自由游动，沿穿刺线呈羽毛状或云雾状混浊 生长。无鞭毛细菌只能沿穿刺线呈明显的线状生长。
细菌在血液培养基的溶血现象
鉴别培养基中的生长特性
E。Coli 鉴别： 麦康凯培养基上形成红色菌落； 伊红美蓝平板：黑色带有金属光泽菌落 远腾琼脂平板：红色带有光泽菌落。
实验四食品中细菌总数及大肠菌群的检测
1、掌握食品中微生物学基本指标的检测 方法。了解食品质量与细菌和大肠菌群数 量的重要关系 2、通过实验，初步掌握食品中污染的活 细菌计数方法，以判别食品的卫生质量
二、实验原理
1、菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应 用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进 行卫生学评价时提供依据。
2、大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌 氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌属、 枸橼酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价 食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。
三、实验材料
一、待测样品： 奶粉还原液、豆腐等。 二、培养基
将所有产气的LST发酵管分别转接在BGLB肉汤管中，置 361℃温箱内，培养48h 2 小时,然后取出，观察产气情况。 产气者，计为大肠菌群阳性管 3．报告
根据复发酵试验的阳性管数，查大肠菌群最可能数(MPN)检 索表。得出每1m1(g)食品中存在的大肠菌群数的近似值。
检样25g或25ml＋225ml稀释液，均质
(3) 另取枪头，按上述操作进行10系列稀释成不同浓度的稀释液，如此每递增 稀释一次，即换用1支无菌枪头。
(4) 根据对标本污染情况的估计，选择2-3个稀释度，分别在作10倍递增稀释的 同时，即吸取该稀释度的稀释液1ml于灭菌培养平皿内，每个稀释度作两个 平皿。
(5) 稀释液吸入平皿后，将融化并冷却至45℃的平板计数琼脂培养基注入平皿 约15ml，并转动平皿使其混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml灭 菌生理盐水的灭菌平皿作空白对照。
(6) 待琼脂凝固后，翻转平板，置36+1℃恒温箱内培养482小时后取出，计算 平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克样品所含25g(或25ml)样品＋225ml稀释液，均质
实验四 细菌细胞的特殊染色
三 实验器材
• 1.活材料：培养2天的枯草芽孢杆菌，培养 18-30小时的大肠杆菌和变形杆菌； • 2.染色液和试剂 ：Tyler法染色液：复红染 色液、香柏油、二甲苯、蒸馏水、5%孔雀 绿水溶液、0.05%碱性复红、0.1%美蓝染 色液等； • 3.器材： 载玻片、 擦镜纸、显微镜、接种 环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒 精灯、镊子等
（三）运动性的观察
1 制片：在干净的载玻片上滴一滴生理盐水， 取一环菌液与之混合，加0.01%美蓝与之 混合均匀，盖上盖玻片； 2 镜检：先用低倍镜找到目标，在用高背镜观 察，可用油镜观察，但注意盖玻片的厚度。
结果作业
一）结果 1绘出所用材料的芽胞和菌体的形态图 2 给出鞭毛菌的形态图 二）思考 1 在芽孢染色涂片上为什么有时会出现大量 游离的芽孢？ 2 芽孢和鞭毛染色中对菌龄要求有何特点？ 为什么？
螺杆菌
实验六 细菌的特殊染色（芽孢、鞭毛）
荚膜
肺炎链球菌荚膜
肉毒梭菌
炭疽芽胞杆菌
破伤风梭菌
丛毛菌
单毛菌
双毛菌
周毛菌
一 实验目的
• 掌握细菌的芽孢、鞭毛染色原理及 方法； • 辨认细菌鞭毛和孢子的形态； • 巩固无菌操作技术。
二 实验原理 • 芽孢染色 由于芽孢壁厚、透性低、不易着色，应 当用石碳酸复红、结晶紫等进行染色菌体和芽孢 囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的 颜色，游离的芽孢呈淡红色或浅蓝紫色的圆或椭 圆形的圈。用着色强的染色剂孔雀绿或石碳酸复 红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也 可进入芽孢内，进入菌体的燃料经水洗后被染色， 而芽孢一经染色难以被水洗脱，当用对比度大的 复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌 体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体 便于区分。 • 鞭毛染色 在染色前用媒染剂进行处理，使它沉积 在鞭毛上，使鞭毛的直径加粗，然后在进行染色。
实验四细菌在培养基中的生长表现与生化实验
可以采用更先进的基因组学和蛋白质组学技术，对细菌的基 因和蛋白质表达进行分析，以更深入地了解细菌的生长机制 。
THANKS
感谢观看
学习并掌握生化实验的基本操作
学习并掌握生化实验的基本操作，如 细菌接种、培养基制备、菌落计数等 。
了解生化实验中常用的试剂和仪器， 并掌握其使用方法。
02
CATALOGUE
实验材料
细菌菌种
大肠杆菌
一种常见肠道细菌，可用于研究 肠道微生物生态和抗生素敏感性
。
金黄色葡萄球菌
一种常见皮肤和呼吸道细菌，可用 于研究其致病性和药物敏感性。
生长。
培养细菌
将接种后的培养基放入恒温培 养箱中，设定适宜的温度和湿
度，进行细菌培养。
观察记录
定时观察细菌的生长情况，记 录生长曲线、菌落形态等信息
。
生化实验操作
试剂准备
根据实验需求，准备所需 的生化试剂和器材。
实验操作
按照实验步骤进行生化实 验，记录实验过程中的现 象和数据。
结果分析
根据实验结果，分析细菌 的生化特性，如酶活性、 代谢产物等。
总结词
生长动力学参数
详细描述
通过生长曲线的分析，可以计算出细菌的生长速率、最大 生长量和倍增时间等生长动力学参数。这些参数对于评估 细菌的生长特性和优化培养条件具有重要意义。
总结词
生长曲线比较
详细描述
比较不同菌株或不同培养条件下细菌的生长曲线，可以分 析它们之间的差异和特点。通过比较，可以深入了解不同 菌株的生长特性和适应性，为菌株筛选和优化提供依据。
生化实验结果分析
总结词
糖发酵实验
详细描述
通过糖发酵实验，可以观察到细菌对不同糖类的利用能力 和代谢特点。分析实验结果，可以初步判断细菌的生化特 性，为菌种鉴定和分类提供依据。
实验四 细菌的划线分离与培养
实验四细菌的划线分离与培养一、实验前要说明的几点问题点名,查看学生出勤情况。
总结上次作业，提出作业中出现的问题并讲解。
二、板书部分（一）目的要求1.掌握需氧菌分离培养的基本要领。
2.了解厌氧菌的分离培养原则及方法。
（二）实验内容1.用普通琼脂平板做一次划线分离培养。
2.用普通肉汤做一管大肠杆菌的移植培养。
3.用普通琼脂斜面做一管金黄葡萄球菌的移植培养。
4.用划线法进行真菌的分离培养（示教）（三）作业1.为什么要进行细菌的分离培养？2.进行分离培养应注意哪些事项？3.细菌分离培养的方法有哪些？（重点叙述平板划线法）4.叙述真菌的划线分离方法。
三、实验内容主要内容有分离培养及目的、注意事项、分离培养的方法、真菌的培养方法、患病动物病料中分离培养、钓菌、移植。
1.什么是分离培养及目的：分离培养是细菌学检验的基本技术之一。
分离培养之目的，在于从被检材料中由多种细菌里分离出一种细菌。
2.注意事项：1）分离培养前应考虑所分离的细菌的特性，选择适合其生长需要的培养基（需氧还是厌氧、营养的要求高还是不高、培养温度等）等。
例如：链球菌在普通琼脂不长，要加血清或血液。
大肠杆菌和葡萄球菌要求较低，普通的培养基即可生长。
2）防止污染。
分离培养的整个过程要严格无菌操作。
培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。
3）防止接种器械过热，很容易杀死分离培养的细菌，如接种环在烧灼灭菌后，不能立即钓取细菌材料，应在酒精灯旁凉凉；另外还应注意防止已钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。
4）初代分离时发现有多种细菌，观察找到目的菌落，再拿一肉汤培养基纯化培养。
然后在接种实验动物，作成凝集抗原，做血清学鉴定，。
还可以反过来做抹片染色观察。
3.分离培养的方法：主要分需氧菌的分离培养方法、厌氧菌的分离培养方法和需要CO菌的培养分离方法。
1）需氧菌的分离培养法（1）平板划线法：划线后有单个菌落，便于观察菌落的形态、溶血性等。
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实验四细菌、放线菌、霉菌和酵母菌的细胞形态与菌落形态观察
实验四细菌、放线菌、霉菌和酵母菌的细胞形态与菌落形态观察
一、实验目的
1．观察细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的代表种类的菌落形态特征。
2．放线菌、酵母菌和霉菌的细胞形态观察。
二、实验原理
菌落形态是指某种微生物在一定的培养基上由单个菌体形成的群体形态。
细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，每一类微生物在一定培养条件下形成的菌落各具有某些相对的特征，利用观察这些特征，来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物，方法简便快速，在科研和生产实践中常被采用。
三、实验材料和用具
圆褐固氮菌，枯草芽孢杆菌，灰色链霉菌，酿酒酵母，青霉的单个菌落平板，白色葡萄球菌（Staphyloccus albus）；Bouin氏固定液，
0．01％结晶紫溶液，酒精等。
显微镜、载玻片、擦镜纸、盖玻片、接种环。
四、操作步骤
（一）四大菌落的形态观察
观察圆褐固氮菌、枯草芽孢杆菌、灰色链霉菌、酿酒酵母、青霉的单个菌落特征，并按实验菌落特征描述的方法记录结果。
（二）放线菌的形态观察
用镊子小心取出用插片法培养的放线菌培养皿中的一张盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦净。
然后将长有菌的一面向上放在洁净的载玻片上，用低倍镜、高倍镜观察。
找出3类菌丝及其分生孢子，并绘图。
注意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。
（三）霉菌的形态观察
1．粘片观察：
取一滴棉蓝染色液置于载玻片中央，取一段透明胶带，打开霉菌平板培养物，粘取菌体，粘面朝下，放在染液上。
镜检。
2．假根观察：
将培养根霉假根的平皿打开，取出皿盖内的载玻片标本，在附着菌丝体的一面盖上盖玻片，置显微镜下观察。
只要用低倍镜就能观察到假根及从根节上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和两个假根间的匍匐菌丝，观察时注意调节焦距以看清各种构造。
（四）酵母菌的形态观察
酵母菌的话体染色观察及死亡率的测定
1．以无菌水洗下PDA斜面培养的酿酒酵母菌苔，制成菌悬液。
2.取
0.05%美蓝染色液1滴，置载玻片中央，并用接种环取酵母菌悬液与染色液混匀，染色2～3min，加盖玻片，在高倍镜下观察酵母菌个体形态，区分其母细胞与芽体，区分死细胞(蓝色)与活细胞(不着色)。
3.在一个视野里计数死细胞和活细胞，共计数5～6个视野。
酵母菌死亡率一般用百分数来表示，以下式来计算：
死亡率=死细胞总数／死活细胞总数×100%
五、注意事项
1．用于活化酵母菌的麦芽汁培养基要新鲜、表面湿润；在产孢培养基上加大移种量，可提高子囊形成率；通过微加热增加酵母的死亡率，易于观察死亡细胞。
2．培养放线菌中要注意，放线菌的生长速度较慢，培养期较长，在操作中应特别注意无菌操作，严防杂菌污染。
3．玻璃纸法培养接种时注意玻璃纸与平板琼脂培养基间不宜有气泡，以免影响其表面放线菌的生长，
六、实验报告
1.将观察到的微生物菌落特征填入下表中。
2.计算酵母菌的死亡率
3．根霉和青霉形态图，示各部。
七、问题和思考
1.试比较细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落形态的差异？
2．酵母菌的假菌丝是怎样形成的?与霉菌的真菌丝有何区别?
3．在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝?
一、实验目的
1．观察细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的代表种类的菌落形态特征。
2．放线菌、酵母菌和霉菌的细胞形态观察。
二、实验原理
菌落形态是指某种微生物在一定的培养基上由单个菌体形成的群体形态。
细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，每一类微生物在一定培养条件下形成的菌落各具有某些相对的特征，利用观察这些特征，来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物，方法简便快速，在科研和生产实践中常被采用。
三、实验材料和用具
圆褐固氮菌，枯草芽孢杆菌，灰色链霉菌，酿酒酵母，青霉的单个菌落平板，白色葡萄球菌（Staphyloccus albus）；Bouin氏固定液，
0．01％结晶紫溶液，酒精等。
显微镜、载玻片、擦镜纸、盖玻片、接种环。
四、操作步骤
（一）四大菌落的形态观察
观察圆褐固氮菌、枯草芽孢杆菌、灰色链霉菌、酿酒酵母、青霉的单个菌落特征，并按实验菌落特征描述的方法记录结果。
（二）放线菌的形态观察
用镊子小心取出用插片法培养的放线菌培养皿中的一张盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦净。
然后将长有菌的一面向上放在洁净的载玻片上，用低倍镜、高倍镜观察。
找出3类菌丝及其分生孢子，并绘图。
注意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。
（三）霉菌的形态观察
1．粘片观察：
取一滴棉蓝染色液置于载玻片中央，取一段透明胶带，打开霉菌平板培养物，粘取菌体，粘面朝下，放在染液上。
镜检。
2．假根观察：
将培养根霉假根的平皿打开，取出皿盖内的载玻片标本，在附着菌丝体的一面盖上盖玻片，置显微镜下观察。
只要用低倍镜就能观察到假根及从根节上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和两个假根间的匍匐菌丝，观察时注意调节焦距以看清各种构造。
（四）酵母菌的形态观察
酵母菌的话体染色观察及死亡率的测定
1．以无菌水洗下PDA斜面培养的酿酒酵母菌苔，制成菌悬液。
2.取
0.05%美蓝染色液1滴，置载玻片中央，并用接种环取酵母菌悬液与染色液混匀，染色2～3min，加盖玻片，在高倍镜下观察酵母菌个体形态，区分其母细胞与芽体，区分死细胞(蓝色)与活细胞(不着色)。
3.在一个视野里计数死细胞和活细胞，共计数5～6个视野。
酵母菌死亡率一般用百分数来表示，以下式来计算：
死亡率=死细胞总数／死活细胞总数×100%
五、注意事项
1．用于活化酵母菌的麦芽汁培养基要新鲜、表面湿润；在产孢培养基上加大移种量，可提高子囊形成率；通过微加热增加酵母的死亡率，易于观察死亡细胞。
2．培养放线菌中要注意，放线菌的生长速度较慢，培养期较长，在操作中应特别注意无菌操作，严防杂菌污染。
3．玻璃纸法培养接种时注意玻璃纸与平板琼脂培养基间不宜有气泡，以免影响其表面放线菌的生长，
六、实验报告
1.将观察到的微生物菌落特征填入下表中。
2.计算酵母菌的死亡率
3．根霉和青霉形态图，示各部。
七、问题和思考
1.试比较细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落形态的差异？2．酵母菌的假菌丝是怎样形成的?与霉菌的真菌丝有何区别? 3．在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝?。