细菌转化实验原理和操作步骤

细菌转化实验原理和操作步骤

转化（ transformation ）是指一段同源或异源的 DNA 转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程，是现代分子生物学研究和基因工程不可缺少的重要技术。

关键词：细菌转化细菌转化

一．实验目的

1 ．以 pGLO 质粒转化大肠杆菌为例，学习转化的基本原理及方法。

2 ．验证 DNA 是遗传物质，加深对中心法则的理解。

二．实验原理

转化（ transformation ）是指一段同源或异源的 DNA 转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程，是现代分子生物学研究和基因工程不可缺少的重要技术。目前常用的转化方法有 CaCl 2 法 ( 化学转化法 ) 和电转化法。本实验是用 pGLO 细菌转化试剂盒中提供的 pGLO 质粒来转化大肠杆菌，所用方法为 CaCl 2 转化法。

pGLO 质粒：

pGLO 质粒上主要含有两个基因，一个为编码绿色荧光蛋白 (GFP) 的基因，一个为抗生素氨苄青霉素抗性基因。此外，该质粒还整合有一个特殊的参与受体细胞中绿色荧光蛋白表达的基因调控体系，转化细胞中的绿色荧光蛋白基因只有在培养基中存在阿拉伯糖时才能启动表达。转化子细胞将在不含阿拉伯糖的培养基上呈白色而在含阿拉伯糖的培养基上显绿色荧光，这种荧光在长波紫外灯下即可观察到。

三．实验材料

受体菌：K12 HB101

质粒： pGLO plasmid

转化液（ CaCl2 ）

氨苄青霉素（ amp ）

阿拉伯糖（ ara ）

培养基：固体 LB 、液体 LB

接种环、移液器等

四．实验步骤

1. 准备平板：每组： 1 块 LB 平板， 2 块 LB/amp 平板， 1 块 LB/amp/ara 平板

2. 准备感受态细胞：用250 μ l 无菌水或转化液悬浮试剂盒中提供的大肠杆菌菌粉，此即感受态细胞。

3. 活化受体细胞：挑取 1 环K12 HB101 菌液，于 LB 培养基上 37 ℃活化16-24h 。

4. 转化：

1）在两只无菌离心管

上分别标

记 +DNA, -DNA 。

2）在上述两管中分别

加入

250 μ l 转化液。

3) 迅速置于冰上。

4）各挑取活化好的受

体菌的一

个单菌落，悬浮于两管

转化液中。

5）在标有 +DNA 的管

中加入一

环质粒 DNA ，而标有

-DNA 的管中不加。

6）将上述两管于冰上

放置 10min 。

7）在准备好的培养基底部如左图。

8 ）两只小管放入42 ℃水浴中处理 50 秒，再迅速放于冰上 2 min 。

9 ）在两只小管中分别加入250 μ l LB- 肉汤。

10 ）从 +DNA 小管中分别吸取100 μ l 滴加在两个标有 +DNA 的平板上，从-DNA 小管中分别吸取 100 μ l 滴加在两个标有 -DNA 的平板上。

11 ）用无菌接种环将滴加的液体均匀涂布在平板上。

12 ）将上述四只平板固定，并于 42 ℃培养箱中培养 2 天。

13 ）在长波紫外灯下观察结果，记录各平板上的菌落数