组织构建-血管内皮细胞-改良贴壁法结合内皮细胞培养基培养小鼠肺微血管内皮细胞
一种改进的人脐静脉内皮细胞的培养方法
一种改进的人脐静脉内皮细胞的培养方法作者：李琴山冯赞杰刘洋徐海燕钱民章【关键词】 ,内皮细胞；脐静脉；细胞培养【Abstract】 AIM: To establish a stable method to isolate and culture human umbilical vein endothelial cells (hUVEC) in vitro. METHODS: Endothelial cells of vein from newborn umbilical cord were successfully isolated using a combination of collagenase and trypsin (1∶1). Cells were not digested with trypsin until the cells reached confluence over 80%. The composition of culture medium was simplified by not adding vascular endothelial cell growth factor and heparin. The cultured cells were verified as hUVEC by morphology and immunofluorescence staining. RESULTS: The endothelial cells initially spread on the bottom of the dishes in 4 h, then coalesced and grew to form confluent monolayers of polygonal cells within 7-10 d. The cultured cells had a cobblestone appearance with a strict monolayer growth and contact inhibition. The purity of endothelial cells was more than 95% identified by immunocytochemistry staining for Ⅷ:Ag and KDR. CONCLUSION: Method of injection with mixed Enzyme solution is an optimized protocol which is reliable and of high achievement ratio. Cellsharvested with this protocol can be used as models on research of vascular endothelial cells in vitro.【Keywords】 endothelial cell; umbilical vein; cell culture【摘要】目的：建立稳定的人脐静脉内皮细胞分离和培养的方法. 方法：采用胰蛋白酶/胶原酶（1∶1）混合酶液消化法培养人脐静脉内皮细胞，简化完全培养液组分（不添加血管内皮细胞生长因子、肝素等辅助因子），当原代培养细胞80％以上汇合后用胰蛋白酶消化传代；用形态学、免疫细胞化学法进行鉴定. 结果：种植在培养瓶中的内皮细胞4h贴壁生长，48~96 h生长最快，7~10 d汇合. 内皮细胞呈单层铺路石样外观，Ⅷ因子相关抗原（Ⅷ：Ag）和内皮细胞生长因子受体2（KDR）鉴定内皮细胞纯度达95％以上. 结论：用混合酶液灌注脐静脉消化内皮细胞是获取内皮细胞的一种好方法，可靠性大，成功率高，可以构建体外研究血管内皮细胞的模型.【关键词】内皮细胞；脐静脉；细胞培养0引言血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC)在心血管疾病的发生中占有重要的地位［1］. 采用培养的VEC进行相关机制研究是一种普遍应用的实验方法. 由于人体组织取材限制，很难获取大量原代培养的人VEC.我们以健康胎儿脐静脉血管为材料，建立起一种改良的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, hUVEC）培养方法.1材料和方法1.1材料新生儿脐带由遵义医学院附属医院提供；胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、EDTA（Sigma公司）；M199、胎牛血清（Gibco公司）；台盼蓝(Amresco公司进口分装)；鼠抗人Ⅷ因子抗体、鼠抗人内皮细胞生长因子受体2（KDR）抗体（美国Dako公司）；超净台（苏州苏净集团安泰空气公司）、倒置相差显微镜（日本Nikon公司）, CO2孵箱（美国Thermo Formo公司）、酶标仪（德国Huma Reader公司）. 完全培养液为800 mL/L M199培养液、200 mL/L胎牛血清、2 mmol/L L谷氨酰胺、1×105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素，使用前调节pH至7.0~7.4.1.2方法1.2.1hUVEC的分离和培养在无菌条件下，取健康产妇分娩后6 h内［2］的脐带，长约30 cm,剪去脐带两端钳夹处. 于脐静脉一端插入一针头，用生理盐水反复冲洗至无血迹后，将脐静脉另一端用止血钳夹紧，用空针封闭. 灌入1 g/L胶原酶和2.5 g/L胰蛋白酶（1∶1）（V/V） 15 mL，置37℃水浴箱中孵育8 min，将消化液收集入离心管，用PBS冲洗脐静脉2次，将冲洗液一同收集入离心管，1000 r/min 离心10 min，去上清液，加入完全培养液重悬细胞，取0.1 mL细胞悬液用4 g/L台盼蓝染色后作活细胞计数. 将1.5×107/L细胞接种到24孔板中，每孔加入完全培养液1 mL，置37℃，950 mL/L O2，50 mL/L CO2培养箱内静置培养，次日换培养液，以后每3 d换液1次，7~10 d 融合.1.2.2细胞计数采用台盼蓝排斥法. 取0.1 mL混匀的内皮细胞悬液与4 g/L台盼蓝0.9 mL混匀后，取1滴在显微镜下计数100个细胞. 当细胞悬液中细胞存活率大于95%时可用于进行原代细胞培养.1.2.3hUVEC的鉴定［3-5］用Ⅷ因子抗体（抗von Willebrand 因子抗体）以及KDR抗体免疫细胞化学法鉴定内皮细胞. 将酸化处理的普通盖玻片消毒后放入6孔培养板，将原代或传代的内皮细胞悬液接种于盖玻片上，当细胞生长至近融合状态时用PBS缓冲液冲洗细胞爬片，-20℃丙酮固定10 min；PBS缓冲液洗3次，5 min/次；用30 mL/L H2O2,室温孵育5 min，灭活内源性过氧化物酶；分别滴加适量鼠抗人Ⅷ因子一抗工作液（1∶100）； KDR（1∶200）一抗工作液，37℃作用60 min；PBS缓冲液洗3次，每次5 min；再分别滴加羊抗鼠的IgGFITC 和IgGTR的二抗工作液，37℃作用30 min后，PBS洗涤3次. 立即在荧光显微镜下观察、摄片. GAMFITC绿色荧光显示膜上KDR；GARTR红色荧光显示胞内的Ⅷ因子. 对于Ⅷ因子相关抗原还采用免疫细胞化学SABC法进行检测，显微镜下观察.1.2.4hUVEC的消化传代①取生长融合的细胞吸去培养液，PBS洗2次；②翻转培养瓶，加入1.25 g/L胰蛋白酶, 0.2 g/L EDTA 的细胞消化液；③倒置显微镜下观察细胞消化情况，待细胞与细胞分开、胞体变圆变亮时翻转培养瓶，吸去消化液；④加入完全培养液，小心吹散细胞，计数，接种到新的培养瓶或培养板, 置37℃, 50 mL/L CO2培养箱中培养.1.2.5细胞生长曲线的测定取待测生长状态良好细胞，增长至接近汇合时向培养瓶内加入1 mL 1.25 g/L胰蛋白酶液消化，待细胞接近脱离瓶壁前吸出消化液，加入完全培养液，轻轻吹打制成细胞悬液、计数. 向24孔板的每孔中接种等量细胞，置37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养. 将细胞分成8组，每组3孔，培养8 d. 从接种次日起每24 h分别取3个孔计数，取平均值，以时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制生长曲线.2结果2.1hUVEC的培养与鉴定在倒置显微镜下连续观察，培养的原代内皮细胞在接种4 h之后开始贴壁生长，细胞呈球形、小多角形，单个或小团块存在. 接种第2～3日，细胞即进入对数生长期，细胞生长迅速；第5～8日时铺满培养瓶瓶底，呈现典型的铺路石样形态特征(图1). Ⅷ因子mAb免疫细胞化学结果显示95%以上为阳性血管内皮细胞，细胞胞质为棕黄色，胞核为蓝色(图2). KDR(图3)和Ⅷ因子(图4)免疫荧光双标显示95%以上为阳性血管内皮细胞.图1培养6 d的原代脐静脉内皮细胞（略）图2脐静脉内皮细胞Ⅷ因子免疫组化检测（略）图3脐静脉内皮细胞内皮细胞生长因子受体2免疫荧光检测（略）2.2hUVEC生长曲线测定通过细胞计数,接种后第1日，细胞较接种时无明显变化，此时细胞仍处于滞留期，第2日则明显增加，第3~5日增长迅速,达到其生长高峰，此时细胞处于对数生长期，第6~8日细胞生长稳定,处于生长平台期(图5).图4脐静脉内皮细胞Ⅷ因子免疫荧光检测（略）图5原代人脐静脉内皮细胞生长曲线（略）3讨论我们以人脐静脉作为培养血管内皮细胞的来源，是因为它具有取材及操作方便，获得细胞数多，在某些方面尚具有与动脉生物学特征相似的优点.获取内皮细胞的方法有机械刮取［6］、组织块移植和酶消化法3种. 前两种易混杂其它血管壁细胞，近几年来已逐渐被酶消化法取代. 从分离细胞数量、保持细胞活性和结构完整性来看，胶原酶是理想的血管内皮细胞分离酶，自成功分离hUVEC以来，已得到广泛应用，但其价格昂贵. 用胰蛋白酶代替胶原酶分离血管内皮细胞已有文献报道. 我们比较了全胶原酶和胰蛋白酶加胶原酶混合两种酶液的消化能力，结果表明，采用胰蛋白酶加胶原酶混合消化的方法，hUVEC 收获量基本接近全胶原酶血管内皮细胞的收获量. 在混合酶液中，胶原酶仅占1/2，这种方法既经济，效果又好. 而且用胰蛋白酶处理可以降低非内皮细胞的贴壁能力，内皮细胞的贴壁能力比平滑肌细胞和成纤维细胞早，所以在接种后6 h可以去除未贴牢的细胞，这些非内皮细胞的污染如不去除，将抑制内皮细胞的增殖.hUVEC较动物内皮细胞的培养困难，只有在培养液中加入刺激细胞生长的物质，方能长期传代培养. 董玉兰等［7］和Relou等［8］报道，培养液中加入人血清、血管内皮细胞生长因子、肝素及培养瓶（皿）用明胶覆盖是hUVEC长期培养的重要条件. 但这些促进内皮细胞贴壁及生长的物质的加入可能成为影响实验结果的混杂因素，限制内皮细胞的实验应用范围. 有人［9-11］研究发现，血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等有助于培养的胚胎干细胞分化为内皮细胞. 胚胎干细胞有望成为新的种子细胞来源. 我们在改进内皮细胞分离和传代方式的基础上选择M199培养基，补充200 mL/L胎牛血清和2 mmol/L L谷氨酰胺，在维持内皮细胞正常生长和形态结构的前提下尽可能减少完全培养液的组分，能将hUVEC传5～6代. 总之，我们改进的hUVEC培养方法可获取足够数量高纯度可传代的内皮细胞，对内皮细胞生物学特性和心脑血管相关疾病的研究有重要意义.【参考文献】［1］ Li XD, Lu kH, Guo SZ, et al. Culture of vascular endothelial cell ［J］. Chin J Aesthetic Med, 2001,10(3):18-20.［2］王建民，刘荫秋，赖西南. 正常脐静脉离体后不同时间内皮某些物质含量的变化［J］. 第三军医大学学报，1995，17（1）：86.［3］ Jonathan B. Rosenberg, Judith S, et al. Genetic induction of a releasable pool of factor Ⅷ in human endothelial cells ［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2000, 20 (12)：2689-2695.［4］李孟彬，王为忠，张宏伟，等. 猪血管内皮细胞的培养与表型鉴定［J］. 第四军医大学学报，2004，25（24）：45.［5］ Mario P, Afazal J, Daniel P, et al. Expression of VEGFR2 and AC133 by circulating human CD34+ cells identifies a population of functional endothelial precursors ［J］. Blood, 2000,95（3）：952-958.［6］ Quattrone S, Chiappini L, Scapagnini G, et al. Relaxin potentiates the expression of inducible nitric oxide synthase by endothelial cells from human umbilical vein in in vitro culture ［J］. Mol Hum Reprod, 2004,10(5): 325-330.［7］董玉兰，陈铁镇，王铁吉,等. 人脐静脉内皮细胞的继代培养［J］. 中国医科大学学报，1989，18（2）：81-85.［8］ Relou IAM, Damen CA, Van der Schaft. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness ［J］. Tissue Cell, 1998,30(5):525-530.［9］ Evans GR, Brandt K, Klatz S, et al. Bioactive poly(Llactic acid) conduits seeded with Schwann cells for peripheral nerve regeneration［J］. Biomaterials, 2002,23(1):841.［10］ Liang PF, Zhang PH, Yang XH, et al. Experimental study on inductionof endothelial apoptosis by burn serum and subeschar tissue fluid ［J］.中华烧伤杂志,2004,20(5):275-277.［11］ Savore C, Zhang C, Muir C, et al. Perlecanknockdown in metastatic prostate cancer cells reduces heparinbinding growth factor responses in vitro and tumor growth in vivo ［J］. Clin Exp Metastasis,2005,22(5):377-390.。
血管内皮细胞和临床
(2)纤溶酶原激活克制物(PAI):VEC能合成与分泌PAI-1和PAI-2， 但以PAI-1为主。内毒素、IL-1、TNFα、凝血酶及类固醇激素等 可刺激VEC合成PAI-1，分泌于血液和内皮细胞外基质中，与外 连素结合而得到稳定。
(3)凝血酶活化纤溶克制物(TAFI)：新近发觉VEC表面旳凝血酶 调制蛋白与凝血酶形成复合物后，经过酰解，使羧肽酶原B激活， 强烈克制体内纤溶活性，所以羧肽酶原B又称TAFI。
(二)VEC合成与释放旳缩血管物质
1982年DeMey与Vanhoutte发觉，VEC还可产生使血管平滑肌 细 胞 收 缩 旳 物 质 ， 即 血 管 内 皮 衍 生 旳 收 缩 因 子 (endothelium derived contracting factor，EDCF)。此类血管收缩物质比舒张 物质愈加复杂多样，至少有下列几种。
AngⅡ经过旁分泌作用于临近旳血管平滑肌细胞，引起血管 收缩；作用于支配血管旳交感神经突触前膜AngⅡ受体，增进 去甲肾上腺素(NA)旳释放，增强血管收缩作用。AngⅡ也能以 自分泌旳方式作用于内皮细胞旳本身受体，释放PGI2、EDRF ／NO等舒血管因子，产生舒张血管旳作用，反馈性调整血管紧 张性。AngⅡ还有生长因子旳作用，诱导原癌基因c-fos与c-myc 旳体现，增进平滑细胞旳增生，增长蛋白质旳合成，使血管壁 增厚，增长血管阻力。另外，AngⅡ可诱导内皮细胞ET基因体 现增强，并增长血管旳反应性。
2、VEC旳抗凝血特征
(1)抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)：AT-Ⅲ及其辅助因子肝素是血浆中最 主要旳抗凝物质。AT-Ⅲ克制丝氨酸蛋白酶类，涉及凝血酶、 因子ⅩБайду номын сангаас、ⅩⅢa、Ⅺa、Ⅸa等，也能克制纤溶酶原、尿激酶、 激肽释放酶等。肝素是AT-Ⅲ旳辅助因子，可增强AT-Ⅲ与凝 血酶旳亲和力。
血管内皮细胞—平滑肌细胞共培养体系研究进展
血管内皮细胞—平滑肌细胞共培养体系研究进展血管内皮细胞（endothelial cells，EC）和血管平滑肌细胞（smooth musclecells，VSMC）的相互作用、相互影响维持血管生理功能和多种疾病的发生发展，EC-SMC联合培养模型是目前研究这2种细胞间相互影响的最佳方式。
作者对现有的EC-SMC共培养模型及共培养对这2种细胞结构和功能的影响进行综述，为在微观上深入研究二者的相互关系提供依据，也为建立更接近机体生理/病理状态的EC-SMC体外共培养体系提供参考。
标签：内皮细胞；平滑肌细胞；共培养；相互作用血管内皮细胞（endothelial cells，EC）和血管平滑肌细胞（smooth muscle cells，VSMC）是构成血管壁的主要细胞成分，2种细胞间的相互作用、相互影响是维持血管生理功能和血管壁自身结构稳定的关键，在病理条件下EC和SMC的相互作用同样可影响多种疾病的发生发展。
EC-SMC联合培养模型是目前研究这2种细胞间相互影响的最佳方式，对研究动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）发病机制、血管壁生理及炎症反应等有重要意义。
本文就目前EC-SMC共培养模型和共培养模式下2种细胞的互相影响做一综述，为在微观上深入研究二者的相互关系提供依据。
1 EC-SMC共培养模型1.1 直接接触的共培养模式早在20世纪80年代，国外学者就开始尝试建立EC-SMC共培养的方法。
早期研究简单地将EC和SMC按一定的比例混合，种植在同一体系中，2种细胞能够混合生长，且相邻的EC和SMC之间形成连接[1]。
此模型较为原始，细胞混杂，EC和SMC没有形成生理状态下的结构层次，且2种细胞之间干扰较大。
在此基础之上，Davies等[2]引进了微载体技术，即将2种细胞分别种植于微载体上，然后将微载体混合于同一体系，实验中相邻的微载体上同型或异型细胞间都形成接触连接。
这种方法很好地将2种细胞分离培养，使其能独立存在，从而为单独研究联合培养体系中某一种细胞提供了方便，但仍然不能反映生理状态下细胞的生长结构层次关系。
成纤维细胞因子和血管生成
成纤维细胞因子和血管生成：血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)以及碱性成纤维细胞生长因子(Basic[ibrob—last growth factor．bFGF)碱性成纤维细胞生长因子和血管再生摘要关键词移植皮瓣坏死是整形外科常见的手术并发症之一，至今其发病机理仍不十分清楚。
但普遍认为血供不足和缺血再灌注损伤是其中的两个重要原因，我们推测将bFGF应用于缺血皮瓣，可能有利于皮瓣下新生血管形成，减轻再灌注损伤，促进皮瓣成活bFGF广泛存在于细胞外间质中，具有广泛的生物活性，能调节中胚层及神经外胚层来源的多种细胞的分裂，其中对血管内皮细胞有显著的增殖效应，是有效的血管生成因子(angiogenic factor)之一。
，但三种剂量组之间差异不显著，9∪g bFGF是皮瓣滴注的最佳剂量。
—般来说，大鼠皮瓣移植后6天～7天，从受床基底重建的有效血供已能够维持整个皮瓣的成活。
术后7天，确定皮瓣坏死率以及SDH含量和氧耗量，反映皮瓣的功能状况较为合适bFGF对大鼠缺血皮瓣琥珀酸脱氢酶含量和氧耗量的影响[1]孙同柱* 傅小兵许明火·王亚平·杨银辉中国重建修复外科杂志1997年11卷5期264-265bFGF可逆转缺氧导致的内皮细胞增殖能力下降】。
通常情况下，由内皮细胞合成的bFGF由于缺少传统的分泌性信号肽，主要存储在细胞质和基质分隔腔，不能以传统的形式分泌。
缺氧时，bFGF可从损伤细胞中释放，途径可能是浆膜破坏释放或内皮细胞膜通透性增加，bFGF从细胞胶质中释放。
这实质是细胞对缺氧的急性应答反应。
此外，缺氧时bFGF在细胞中的分布发生变化，以参与内皮细胞对缺氧的应答】。
常氧下bFGF散在、均匀地分布在胞质和基质分隔腔，缺氧后bFGF分布最明显的变化是核周环的出现和临近核细胞着色增强。
Miehiells 6 证实：外源性的bFGF(5 ng／m1)可刺激缺氧培养的内皮细胞生长，并表现对缺氧的修复能力。
血管内皮抑制素
血管内皮抑制素(Endostatin)和衍生物(中国商品名:恩度)(一)血管内皮抑制素的发现1997年，Folkman等首先报道从小鼠血管内皮细胞瘤中得到一种具有抑制血管生成的因子，经N端氨基酸序列测定表明，该物质为ⅩⅧ型胶原C-末端的184个氨基酸片段，被命名为血管内皮抑制素(Endostatin，ES)。
人体血液循环中有极微量Endostatin存在。
O’Reilly等(1997年)利用重组后并纯化的Endostatin进行体外试验，证明Endostatin对牛毛细血管内皮细胞、牛肺主动脉内皮细胞有特异的抑制增殖作用，而对非血管内皮细胞系细胞、平滑肌细胞等则无增殖抑制作用。
随后又进行了体内药效学试验，证明Endostatin可抑制鸡胚绒毛尿囊膜毛细血管的生长，对接种Lewis 肺癌、T 241纤维肉瘤和B16F10黑素瘤的小鼠具有明显的肿瘤抑制作用。
免疫组化的实践表明，Endostatin能阻断血管生成。
Michael等(1997年)实验显示，血管内皮抑制素是通过抑制肿瘤新生血管的形成从而对原发和转移瘤均表现极强的特异的抑瘤活性;并且动物实验中发现反复使用内皮抑制素也不会产生耐药性。
Entre Med公司于1998年10月至2000年7月在美国的3个癌症中心进行了重组人血管内皮抑制素的Ⅰ期临床试验。
我国山东先声麦得津生物工程有限公司首家开发了Endostatin(Jia等，2006年)，商品名为“恩度”。
与国外产品不同的是，Entre Med公司采用的是酵母菌作为表达载体，而恩度是采用大肠埃希菌，且在ES母体上添加了9个氨基酸的新型Endostatin，不仅使ES稳定性提高，半衰期延长，而且生物活性增加，纯度> 99.9%，蛋白性质稳定，可以在室温放置1年仍然保持活性，而国外的同类产品则需-80℃冷冻保存。
(二)血管内皮抑制素的作用原理Hajitou等(2002年)研究显示，Endostatin能下调VEGF mRNA和蛋白表达，作用于VEGF的受体KDR/Flk-1，从而抑制VEGF介导的内皮细胞迁移和血管生成。
微循环讲解及实操
微循环讲解及实操血液循环一、定义：血液由心室流经动脉、毛细血管、静脉又返回心房，这种周而复始的循环流动，称为血液循环。
二、组成：血液循环系统由心脏和血管两部分组成。
心脏位于胸腔内，在隔以上居二肺之间，约有2/3在中线左侧，1/3在中线右侧，其大小相当于本人拳头。
心脏是人体内泵血的肌性动力器官（肌性泵）推动血液流动。
血管是血液流动的管道，包括大动脉、中小动脉、毛细血管、微小静脉、中静脉、上下腔静脉，心脏和血管构成一个密闭的管道系统，血液在其中流动。
三、循环路线：血液循环又分为相互连接的两部分即：体循环，（又称大循环）肺循环，（又称小循环）体循环和肺循环式同时进行的，是血液不可分割的两部分。
（连接心房的血管称静脉，故连接左心房的肺静脉装的是动脉血，连接心室的血管称动脉，故连接右心室的肺动脉装的静脉血）。
详见附录：人体血液微循环图微循环微循环是一门新兴的边缘学科，主要由微循环的基础研究、临床应用及血液流变学三大部分组成。
它是利用微循环的理论与技术直接观测人体微循环的变化。
一、微循环定义微循环是循环系统最末梢的部分，又是脏器的组成部分，是指血液由微动脉流经广泛的毛细血管网，再汇合流入微静脉的循环。
由于这部分血管口径很小，肉眼看不到，只有在显微镜下才能看到，因此称为微循环。
二、微循环生理特点1、管径很细，直径只有一根头发丝的二十分之一；2、血管很长，一个成人的微血管连结起来约为9.6万公里，可以绕赤道周径二周半；3、血流很慢，由于压力低所以血流慢0.4——1毫米/秒；4、管壁很薄，只有一层内皮细胞和外面的基膜，约为一白纸的1%厚度；5、数量众多，全身约有100多亿根。
三、微循环的功能微循环是生命的基本特征之一，其主要功能是向组织送氧气和养料，同时也带走细胞产生的二氧化碳和其他代谢产物，是直接进行物质交换的重要场所；微循环还具有信息传递和能量传递的功能。
人体血液从心脏输出后要经过漫长的路途才能到达组织细胞，因此仅靠心脏的收缩力是远远不够得，还必须依靠微血管自身的自律性活动才能将血液灌注进细胞，同时因为微血管的自律运动与心跳并不同步，它有自己的规律，驱动着微血管内的血流，起到第二次调节供血的作用，因此微循环又称为“人体的第二心脏”。
小鼠视网膜微血管内皮细胞使用说明
小鼠视网膜微血管内皮细胞小鼠视网膜微血管内皮细胞产品说明：为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的小鼠视网膜微血管内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。
研发的小鼠视网膜微血管内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
注意事项：1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。
3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。
培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。
4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。
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小鼠视网膜微血管内皮细胞产品简介：1、产品名称：小鼠视网膜微血管内皮细胞（Mouse Retinal Microvascular EndothelialCells）2、组织来源：小鼠视网膜组织3、产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶小鼠视网膜微血管内皮细胞简介：小鼠视网膜微血管内皮细胞（Rat Retinal Microvascular Endothelial Cells）来源于成年小鼠视网膜组织，其是组成血管腔面单层扁平上皮样细胞，它所产生和分泌的生物活性物质对维持血管张力，调节血压，抗血栓形成等有重要作用，在视网膜血管疾病的发病机制中有重要病理生理学意义。
miRNA-27a在心血管疾病中的作用机制
ｍｉＲＮＡ ２７ａ在心血管疾病中的作用机制何泽银１ 邓皓元１ 李汇华２，△（１大连医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学，大连１１６０４４；２大连医科大学附属第一医院心血管病研究所，大连１１６０１１）摘要 心血管疾病作为常见的临床慢性疾病是导致死亡的主要原因。
微小核苷酸（ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ，ｍｉＲＮＡｓ）作为一类长度约为１９～２５ｎｔ的内源性非编码ＲＮＡ，在心血管疾病的发生和发展中起着重要作用。
ｍｉＲＮＡ ２７ａ通过调控免疫、炎症反应以及多种病理生理过程，从而参与心血管疾病的发病过程。
本文对ｍｉＲＮＡ ２７ａ在心血管疾病中的作用机制以及研究进展进行简要综述，为心血管疾病的防治提供新思路。
关键词 ＭｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）；ｍｉＲＮＡ ２７ａ；免疫；炎症；心血管疾病中图分类号 Ｒ５４３ ＭｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡｓ）是在真核生物中发现的一类长度约为１９～２５ｎｔ的内源性非编码ＲＮＡ，其通过与靶基因的３＇端非翻译区（３＇ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎ，３＇ ＵＴＲ）结合从而降解或抑制靶基因ｍＲＮＡ转录后翻译进而调控基因表达［１］。
ｍｉＲＮＡｓ在细胞增殖、凋亡和分化等生物学过程中发挥重要调控作用［２］，并已被证实参与卵巢癌、胶质瘤、口腔鳞状细胞癌、胃癌、肝细胞癌等大量疾病的发病机制中［３～５］。
心血管疾病作为常见的临床慢性疾病，具有高患病率、高致残率以及高死亡率等特点。
我国心血管患病人数约为２．９亿，且患病率和死亡率仍处于上升阶段［６］。
ｍｉＲＮＡｓ异常表达参与多种心血管疾病的发生与发展［７］。
研究表明ｍｉＲＮＡ ２７ａ作为典型的多功能基因位于１９号染色体，其成熟序列为５＇ ｕｕｃａｃａｇｕｇｇｃ ｕａａｇｕｕｃｃｇｃ ３＇。
ｍｉＲＮＡ ２７ａ在多种免疫炎症细胞中表达丰富，包括单核／巨噬细胞、Ｔ细胞以及树突状细胞等。
研究表明ｍｉＲＮＡ ２７ａ在调控炎症、免疫以及心血管疾病病理生理过程具有重要作用。
血管内皮生长因子在肺癌中的临床应用价值
800
VEGF（pg/mL）
600
400
200
0 肺癌组Leabharlann 肺部疾病 正常对照组 对照组
图1 血清VEGF水平在肺癌及其对照组中的分布散点图
二、肺癌组各种病理类型患者的血清VEGF 水平比较
肺癌组中鳞癌、腺癌和小细胞癌患者血清
检验医学 2016 年 9 月第 31 卷第 9 期 Laboratory Medicine，September 2016，Vol. 31，No. 9
International Cancer Control，UICC）2002年制定 的TNM分期表对研究对象进行分期。
二、方法 1.样本处理 所有研究对象抽取肘静脉血 5 mL置于真空采血管中，以2 454×g离心5 min， 分离血清于灭菌后的Eppendorf管，做好标记后 置-80 ℃保存用于VEGF检测。 2.主要试剂与仪器 VEGF试剂盒[酶联 免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）]由北京健平金星生物科技公司 生产，2～8 ℃保存。Stat Fax-2100酶标仪由美国 Awareness公司生产。 三、统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，正态分 布数据采用x±s表示，非正态分布数据采用中位 数（四分位数）[M（P25，P75）]表示。采用t检 验和Mann-Whitney U检验进行分析，采用受试 者工作特征（receiver operating characteristic， ROC）曲线评价VEGF对肺癌的诊断价值，以 P<0.05为差异有统计学意义。
Abstract：Objective To investigate the significance of serum vascular endothelial growth factor（VEGF） in lung cancer. Methods The levels of serum VEGF were determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） in 142 patients with lung cancer，30 patients with lung diseases and 25 healthy subjects. Meanwhile，their tumor stages and serum VEGF expression changes before and after chemotherapy and surgery were compared. The receiver operating characteristic（ROC） curve was used to evaluate the significance of serum VEGF in lung cancer. SPSS 13.0 software was used for statistical analysis. Results Serum VEGF level in lung cancer group was 154.09（86.81，260.01） pg/ mL，which was higher than that in healthy control group [59.06（27.66，77.81）pg/mL，P<0.01]. Serum VEGF level had no statistical significance for different pathological types of lung cancer group（P=0.493）. Serum VEGF levels before and after chemotherapy had no statistical significance（P>0.05）. Serum VEGF levels with different M stages and tumor stages in non-small cell lung cancer had statistical significance（P<0.05），and there was no statistical significance between localized and extensive stages（P>0.05）. The area under ROC curve of serum VEGF in the diagnosis of lung cancer was 0.664，and that for non-small cell lung cancer distant metastasis was 0.666. Conclusions The expression of serum VEGF is abnormal in lung cancer group，and it is related to the clinical stages of lung cancer. It is of significance in the diagnosis and metastasis of lung cancer.
2023血管生成与肺纤维化的发生发展完整版
2023血管生成与肺纤维化的发生发展(完整版)特发性肺纤维化(idiopathicpu1monaryfibrosisJPF)是一种持续进展性肺纤维化疾病，以肺功能进行性、不可逆性下降为特征，最终导致呼吸衰竭。
IPF是间质性肺疾病(interstitia11ungdisease,I1D)中最常见的一种，如不治疗，中位生存期仅为3~5年。
IPF存活率低反映了对其发病机制认识不足，缺乏有效的治疗方法来减缓甚至逆转疾病进程。
IPF的病理过程为：肺泡上皮损伤后，各种细胞因子和细胞外基质共同激活多种修复途径，导致炎症细胞招募、成纤维细胞增殖和细胞外基质不断累积，肺组织广泛纤维化形成。
近年来血管生成对IPF形成的影响逐步得到重视。
有作者认为,IPF 还是一种微血管重塑紊乱的慢性进行性肺部疾病，血管生成也可能是促成IPF的始动因素之一。
包括提供养分放大成纤维细胞增殖，提供部分成纤维细胞来源，分泌促纤维化因子，内皮细胞外泌体中的1OX2可以增加胶原蛋白和弹性蛋白的数量与刚性，以及内皮-间质转化(endothe1ium-mesenchyma1transition f EndoMT)等。
肺组织广泛损伤后，异常血管生成可能是触发纤维化性修复的关键因素。
一、肺血管生成及相关肺部疾病组织的血管形成含有血管发生和血管生成两个部分。
成血干细胞分化形成初始血管结构称作血管发生，而原有血管出芽形成新血管的过程称作血管生成。
血管生成一般只见于再生、发育、创伤修复等，是一种严格受控的生理过程。
缺氧、肺组织广泛损伤、活化癌基因、细胞因子等因素都可以刺激血管增生。
肺部广泛损伤后，炎性物渗出阻碍了气体交换，并释放大量促血管生成因子促进血管生成。
炎性细胞活化还可以引起局部相对氧含量不足，触发缺氧诱发因子促进促血管生成因子释放，引起毛细血管代偿性增生来适应组织代谢的需求。
血管生成和炎性反应无论生理抑或病理状态，两者经常相伴存在。
血管生成与多种肺部疾病发生发展有关，如肺癌中血管生成促进肿瘤增殖与播散，慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）中缺氧导致血管管壁增厚、肺微血管再生，以代偿生理所需；肺动脉高压中血管生成和重塑促进了动脉高压；肺急性损伤中毛细血管增生及通透性增加导致弥漫性肺泡水肿及透明膜的形成。
组织学与胚胎学-组织学知识点总结
组胚复习题一、名词解释1.间皮（endothelium）：分布在胸膜、腹膜和心包膜表面的单层扁平上皮。
2.内皮（mesothelium）：衬贴在心、血管和淋巴管腔面的单层扁平上皮。
3.微绒毛（microvillus）：上皮细胞游离面的细胞膜和细胞质伸出的微细指状突起。
功能：使细胞的表面积显著增大，有利于扩大细胞的吸收面积。
4.纤毛（cilium）：上皮细胞游离面的细胞膜和细胞质伸出的较长突起，并具有向一定方向节律性摆动的能力。
5.连接复合体（junctional complex）：紧密连接、中间连接、桥粒和缝隙连接中两个或两个以上同时存在时则称为连接复合体。
6.缝隙连接（了解）：呈斑状，位于柱状上皮深部。
功能：可供细胞相互间交换某些小分子物质和离子，借以传递化学信息，调节细胞的分化和增殖。
7.质膜内褶（了解）：是上皮细胞基底面的细胞膜折向细胞质所形成的许多内褶。
内褶与细胞基底面垂直，光镜下称为基底纵纹。
电镜下，内褶间含有与其平行的长线粒体。
功能：扩大细胞基底部的表面积，有利于水和电解质的迅速转运。
8.组织液：是指从毛细血管动脉端渗出到基质中的液体。
9.同源细胞群（isogenous group）：在软骨组织中部，由同一个幼稚软骨细胞分裂增殖形成的一群软骨细胞，通常为2~8个，称同源细胞群。
10.骨单位（osteon）：位于内、外环骨板之间，以中央管为中心，同心圆状排列的数十层骨板组成，是长骨骨干内起支持作用的主要结构单位。
11.血象：血细胞的形态、数量、比例和血红蛋白的含量的测定结果。
12.骨髓象：临床上将骨髓涂片的细胞学检查，即观察各系血细胞在不同阶段的形态结构特征并分类计数，称为骨髓象。
13.闰盘（intercalated disc）：连接心肌纤维的结构。
光镜下为深染的粗线，电镜下，横向有中间连接和桥粒，纵向有缝隙连接。
14.肌节（sarcomere）：相邻两条Z线之间的一段肌原纤维，由1/2 I带+A带+1/2 I带组成。
VEGFR1-positiveh...
VEGRR1 阳性的骨髓造血祖细胞形成转移前壁龛（微生态）摘要：肿瘤细胞向某一确定的目标位置转移的细胞及分子机制很不清楚。
本课题证明，在肿瘤细胞转移之前，骨髓来源的、表达VEGFR1（血管内皮生长因子受体1，亦被称为Flt1）的造血祖细胞已经来到肿瘤特定的转移前位置，并形成细胞集群。
通过抗体或者将VEGFR1+细胞从野生小鼠骨髓中去除而抑制VEFR1功能，可以防止转移前细胞集群的形成及肿瘤的转移；反之，在Id3（分化抑制剂3）敲除的小鼠体内重建具有Id3功能的VEGFR+细胞，可以建立细胞集群并形成肿瘤转移。
我们也发现，VEDFR+细胞表达VLA-4（一种整合蛋白a4b1），而转移处的纤维母细胞中则有VLA-4的配基----一种上调肿瘤特异生长因子的纤连蛋白；它们共同提供了允许肿瘤细胞到来的环境。
该环境根据具有独特转移传播模式的不同肿瘤类型而重新调整纤连蛋白的表达以及细胞集群的形成，从而改变转移的表现。
这些发现证明，VEGFR1+造血祖细胞对转移调节过程是必不可少的；同时提示，纤连蛋白及VEGFR1+、VLA-4+集群的类型决定肿瘤扩散的器官特异性。
骨髓来源细胞（BMDCs）对恶性变、肿瘤血管生成以及瘤性细胞迁移均有促进作用。
之前我们在骨髓特定的某种壁龛中鉴定出表达VEGFR1的造血祖细胞（HPCs）。
在血管生成过程中，这些细胞增殖并与表达VEGFR2（也称Flk1）的骨髓来源上皮细胞祖细胞一起移动至血流中，对原位肿瘤的血管生成及生长有促进作用。
这些骨髓单核的VEGFR1+的细胞定位于血管周围的位置，从而增强稳定肿瘤血管。
这些细胞及其他肿瘤相关细胞增强了原发肿瘤的血管生成及生长，但它们对于转移的促进作用很不清楚。
该研究即着眼于明确VEGFR1+de HPCs 在转移形成过程的即时功能。
BMDCs在肿瘤细胞之前克隆形成转移前位点原位肿瘤皮下接种至小鼠体内以后，观察分析β-乳糖阳性（β-gal+）和绿色荧光蛋白阳性（GFP+）的BMDCs的变化。
建立血管内皮细胞敲除DEPTOR基因小鼠模型及鉴定
《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research文章编号:2095-4344(2019)23-03698-073698www.CRTER .org·研究原著·丁燕，女，1990年生，湖南省怀化市人，汉族，南方医科大学在读博士，医师，主要从事心血管、内分泌、基因敲除鼠的研究。
通讯作者：向光大，博士，主任医师，南方医科大学中国人民解放军中部战区总医院，湖北省武汉市 430700文献标识码:B稿件接受：2019-01-30Ding Yan, Doctoral candidate, Physician, General Hospital of Middle Theater Command of Chinese PLA of Southern Medical University, Wuhan 430700, Hubei Province, ChinaCorresponding author: Xiang Guangda, MD, Chief physician, General Hospital of Middle Theater Command of Chinese PLA of Southern Medical University, Wuhan 430700, Hubei Province, China建立血管内皮细胞敲除DEPTOR 基因小鼠模型及鉴定丁 燕，孟碧莹，向光大(南方医科大学中国人民解放军中部战区总医院，湖北省武汉市 430700) DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1316 ORCID: 0000-0002-2356-9924(丁燕)文章快速阅读：文题释义：DEPTOR ：含有DEP 结构域的mTOR 相互作用蛋白(DEPTOR)，也称为含有DEP 结构域的蛋白6(DEPDC6)，是人类中由DEPTOR 基因编码的蛋白质。
血管内皮细胞培养方法
血管内皮细胞培养方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：血管内皮细胞是一种位于血管内壁的重要细胞，它们在维持血管结构稳定、调控血管张力和血液循环等方面发挥着重要作用。
对血管内皮细胞进行培养研究具有重要的生物学意义和临床应用前景。
下文将介绍一种常见的血管内皮细胞培养方法，希望能为相关研究工作提供一些帮助。
一、血管内皮细胞的来源：血管内皮细胞主要来源于人体的血管组织，通过合适的方法可以从血管中分离和提取。
通常来说，可以选择人体动脉、静脉等血管组织作为细胞来源，从中分离得到血管内皮细胞进行培养。
在实验动物中，也可以选择小鼠、大鼠等动物的血管组织来获取血管内皮细胞。
1. 血管组织的分离和处理：需要将血管组织从人体或动物中取出，并去除周围的结缔组织和肌肉组织。
然后，将血管组织切成小段，并用适当的消化酶进行消化处理，使内皮细胞从血管组织中释放出来。
2. 血管内皮细胞的分离和纯化：经过消化处理后，将获得的细胞悬液进行离心分层，采集含有内皮细胞的上清液。
然后，可以通过负性筛选或CD31抗体磁珠等方法将内皮细胞进行进一步的分离和纯化。
3. 血管内皮细胞的培养和传代：将得到的血管内皮细胞接种到预先涂有明胶或基底膜的培养皿中，加入适当的培养基和生长因子，将细胞放入细胞培养箱中进行培养。
随着细胞的增殖和扩张，可以进行细胞的传代，维持内皮细胞培养的稳定性。
4. 血管内皮细胞的鉴定与应用：在进行内皮细胞培养的过程中，需要对细胞进行鉴定，确认其具有内皮细胞的特征和功能。
通过免疫组化染色、PCR检测等方法，可以检测内皮细胞表面标记物和相关基因的表达情况。
血管内皮细胞在动脉粥样硬化、血管疾病等方面的研究应用也具有广泛的前景。
1. 培养环境的控制：血管内皮细胞对培养环境的要求比较严格，需要在无菌条件下进行培养，并保持适当的温度、湿度和CO2浓度等参数。
2. 培养基的选择：选择适合血管内皮细胞生长和扩张的培养基是培养过程中的关键。
MAPKs家族在中暑小鼠肺微血管内皮细胞凋亡中的作用及机制研究
MAPKs家族在中暑小鼠肺微血管内皮细胞凋亡中的作用及机制研究刘亚楠;徐秋林;郭晓华;周耿标;王郑莲;童华生;陆杰富;邱俊铭;苏磊【摘要】Objective To investigate the effect of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) activation on the heat stressinduced apoptosis of pulmonary microvascular endothelial cells (PMVECs).Methods A mouse model of severe heat stroke was made and TUNEL and immunohistochemistry were employed to detect lung tissuedamage.MACS separation was used for isolation of neonatal PMVECs,and TUNEL was utilized to detect the apoptosis of PMVECs.Western blotting was used for determining the MAPKs activation during heat stress recovery (0,2,6h).The monolayer permeability of endothelial cells was detected in terms of transmembrane resistance (TEER) and horseradish peroxidase (HRP).Cells were pretreated with MAPKs activation inhibitors to examine the effect of heat stress on the monolayer cell permeability and apoptosis.Results In mice with severe heat stroke,extensive apoptosis of PMVECs was found in their pulmonary tissues.TUNEL revealed that the number of apoptotic cells increased over time during heat stress recovery period and heat stress could activate MAPKs in pared with heat stress group,in the cells pretreated with p38 or ERK activation inhibitor PD98059 and SB203580,the monolayer permeability and apoptosis increased while in cells pretreated withJNK inhibitorSP600125,the cellular permeability and apoptosis decreased.Conclusion Inmice with severe heat stoke,PMVECs might experience apoptosis and p38 and ERK could inhibit apoptosis while JNK could promote apoptosis.%目的研究丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)活化对热打击致小鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)凋亡的影响.方法建立重症中暑小鼠模型,采用TUNEL染色及免疫组化检测肺组织损伤情况.二次磁珠分选法分离乳鼠PMVECs,TUNEL染色检测PMVECs凋亡情况,Western blotting检测热打击恢复期(0、2、6h)MAPKs家族活化情况.通过检测单层内皮细胞跨膜电阻(TEER)及辣根过氧化物酶(HRP)值观察不同热打击温度对单层细胞通透性的影响,同时使用MAPKs家族抑制剂检测热打击对单层细胞通透性及凋亡的影响.结果在重症中暑小鼠恢复期肺组织中可观察到PMVECs发生凋亡.TUNEL染色发现随着恢复期时间的延长,PMVECs凋亡数目增多,热打击可使PMVECs MAPKs家族活化且微血管通透性增加,给予p38活化抑制剂SB203580及ERK活化抑制剂PD98059预处理后细胞通透性增加,凋亡数目增多,而给予JNK抑制剂SP600125预处理后细胞则出现相反的变化.结论重症中暑小鼠PMVECs可发生凋亡,p38及ERK起着抗凋亡的作用,JNK起着促凋亡的作用.【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2017(042)004【总页数】6页(P279-284)【关键词】中暑;肺微血管内皮细胞;丝裂原活性蛋白激酶类;细胞凋亡;细胞通透性【作者】刘亚楠;徐秋林;郭晓华;周耿标;王郑莲;童华生;陆杰富;邱俊铭;苏磊【作者单位】510010广州广州军区广州总医院重症医学科;510515广州南方医科大学南方医院重症医学科;510010广州广州军区广州总医院重症医学科;510515广州南方医科大学南方医院重症医学科;510405广州广州中医药大学研究生院;510405广州广州中医药大学研究生院;510010广州广州军区广州总医院重症医学科;510515广州南方医科大学南方医院重症医学科;510010广州广州军区广州总医院重症医学科;510010广州广州军区广州总医院重症医学科【正文语种】中文【中图分类】R594.1+2[Key words]heat stroke; pulmonary microvascular endothelial cells; mitogen-activated protein kinases; apoptosis; cell permeability重症中暑可导致多脏器功能衰竭，其发病机制目前尚不完全清楚[1-4]。
血管内皮细胞培养
血管内皮细胞（endothelial cell, EC）体外培养1．概述血管内皮细胞（endothelial cell, EC）是衬于心，血管和淋巴管腔内表面的一种单层扁平上皮细胞。
EC极薄，厚度约为0.1～1μm，长约25～50μm，宽约10～15μm，在体内呈梭形，相邻细胞之间借少量粘合质彼此嵌合，细胞长轴与血流方向平行。
其超微结构特点是在胞质中含有的特殊颗粒，称Weibel-palade小体（内含有与凝血有关的第Ⅷ因子相关抗原）；细胞间有紧密连接的缝隙相连。
EC除了能保持血管壁内表面的光滑和通透性外，还有多种生物学功能：维持正常的血液流动性，分泌多种生物活性物质，在调节细胞生长，改变脂质代谢，维持血管壁的完整性，调节血管张力和选择性通透性以及免疫调节方面起到重要作用。
EC功能的异常，与血栓形成、动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病及肿瘤扩散，免疫疾病都有密切关系。
体外培养中的EC形态呈“鹅卵石样”镶嵌排列，细胞长满后呈接触抑制现象。
2．培养方法EC生长在血管内表面，由于其所处的独特位置不利于观察和研究，所以体外培养EC显得特别重要，目前已有多种种属（人、牛、猪、兔、大鼠等），多种组织（脐带动脉、静脉、肺动脉、主动脉、脑毛细血管、心脏毛细血管等）的EC能在体外培养成功。
人们将培养器皿预先用明胶或纤连蛋白或胶原等粘附蛋白包被后，形成人工的EC下基质层，可促进EC的粘附与生长。
2.1 方法原理用酶消化法，酶消化＋机械刮脱法或单纯刮脱法将EC分离下来，在适宜的条件下可贴壁并长成致密单层。
2.2 介绍几种主要EC的分离2.2.1 酶消化法大血管内皮细胞的分离2.2.1.1 人脐带动、静脉（或其它大血管）a．在37℃水浴中，预热培养用的所有无菌溶液，备用。
b．在无菌条件下，取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（25cm左右，不超过6h），选择无夹痕、无扭曲、无凝血阻塞的部分，放入含有100 U/ml的青霉素和100 μg/ml链霉素的D-Hanks液中，在脐静脉或脐动脉的两端插入磨平的注射器针头用丝线扎紧，用注射器从一端注入D-Hanks液冲洗血管，直到流出的液体无血迹。
血管内皮生长因子促多囊肾大鼠胆管上皮细胞活力及胆管囊性扩张的机制研究
血管内皮生长因子促多囊肾大鼠胆管上皮细胞活力及胆管囊性扩张的机制研究栾明月;闫文帝;刘特思;吕游;佐藤保则;朴英实;任香善【摘要】目的:探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)促进多囊肾(polycystic kid-ney,PCK)大鼠胆管上皮细胞活力及胆管囊性扩张的机制.方法:免疫组织化学染色法检测正常和PCK大鼠肝组织中VEGF(n=6)和CD31(n=10)的表达情况.RT-qPCR法和酶联免疫吸附实验分别检测胆管上皮细胞和培养上清液中的VEGF表达水平.WST-1比色法检测VEGF对大鼠胆管上皮细胞活力和胆管上皮细胞上清液对内皮细胞活力的影响.细胞迁移实验和管腔形成实验检测胆管上皮细胞上清液对大鼠血管内皮细胞迁移和管腔形成能力的影响.结果:免疫组织化学染色结果表明,VEGF在PCK大鼠的胆管上皮细胞中呈高表达;肝汇管区新生微血管数量明显多于正常大鼠(P<0.01);RT-qPCR法和酶联免疫吸附法检测结果表明,PCK大鼠胆管上皮细胞中VEGF mRNA和蛋白表达显著高于正常大鼠(P<0.01);WST-1结果显示,VEGF可增强PCK大鼠胆管上皮细胞活力(P<0.01);PCK大鼠胆管上皮细胞培养上清液能提高内皮细胞活力(P<0.01);VEGF siRNA和VEGF受体抑制剂可降低胆管上皮细胞活力(P<0.01);细胞迁移实验和管腔形成实验结果表明,PCK大鼠胆管上皮细胞培养上清液可提高内皮细胞迁移能力和管腔形成能力(P<0.01).结论:PCK大鼠的胆管囊性扩张与胆管上皮细胞过度分泌VEGF存在联系.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2019(035)006【总页数】6页(P1106-1111)【关键词】血管内皮生长因子;细胞活力;Caroli病;多囊肾【作者】栾明月;闫文帝;刘特思;吕游;佐藤保则;朴英实;任香善【作者单位】延边大学肿瘤研究中心,吉林延吉 133002;延边大学肿瘤研究中心,吉林延吉 133002;延边大学肿瘤研究中心,吉林延吉 133002;延边大学肿瘤研究中心,吉林延吉 133002;金泽大学医学部形态机能病理学教研室,日本金泽 9208640;延边大学肿瘤研究中心,吉林延吉 133002;延边大学肿瘤研究中心,吉林延吉 133002【正文语种】中文【中图分类】R363.2;R692.1+2Caroli病(Caroli disease)是胆管末梢以进行性、多发性囊状扩张为特征的疾患，常合并先天性肝纤维化(congenital hepatic fibrosis，CHF)，是常染色体隐性遗传性多囊肾(autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD)的肝胆管病变[1-2]，其确切发病机制至今仍未阐明，目前主要有胆管板畸形(ductal plate malformation，DPM)学说和基因突变学说，其中基因突变学说认为，在胚胎发育过程中，胆管形成时期上皮细胞过度增殖，其远端因长期受阻而逐渐扩张呈囊状，近端受阻程度不同，形成大小不一的囊肿[3]。
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中国组织工程研究 第16卷 第15期 2012–04–08出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research April 8, 2012 Vol.16, No.15ISSN 1673-8225 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH2691Eye Center ofRenmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, ChinaHuang Cai-xuan ☆, Studying for doctorate, Eye Center of Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China michelle_hcx@ Correspondingauthor: Xing Yi-qiao, Doctor, Chief physician, Eye Center of Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China xyqdr07@yahoo. Supported by: Young Scientists Fund of the National Natural Science Foundation of China,No.81000393*Received: 2011-10-29 Accepted: 2011-12-31武汉大学人民医院眼科中心，湖北省武汉市 430060黄偲璇☆，女，1986年生，湖北省武汉市人，汉族，武汉大学在读博士，主要从事眼部新生血管的研究。
michelle_hcx@ 通讯作者：邢怡桥，博士，主任医师，武汉大学人民医院眼科中心，湖北省武汉市xyqdr07@中图分类号:R318 文献标识码:A文章编号:1673-8225 (2012)15-02691-04收稿日期：2011-10-29 修回日期：2011-12-31 (20110929014/M ·C)改良贴壁法结合内皮细胞培养基培养小鼠肺微血管内皮细胞*☆黄偲璇，贺 涛，邢怡桥Primary cultivation of mouse pulmonary microvascular endothelial cells by improved adherence method combined with endothelial cell culture mediumHuang Cai-xuan, He T ao, Xing Yi-qiao AbstractBACKGROUND: Pulmonary microvascular endothelial cells (PMVECs) are one of the most important endothelial cell models for microcirculation. During many training methods, simple adherence method is relatively simple, but the time-consuming and more impurity cells are the biggest obstacle for cells culture.OBJECTIVE: To optimize the cultivation method for mouse PMVECs in vitro , and to observe the growth condition and to identify the property.METHODS: The pulmonary tissue particles were isolated from 5-day-old C57BL/6J mice pups by scissoring peripheral lung lobes accurately under sterile conditions, and cultured with endothelial cell medium. The morphology and growing characters of the cells were observed by inverted microscope. Cultured cells were identified by immunohistochemistry and immunofluorescence staining of factor related antigen. ⅧRESULTS AND CONCLUSION: A few spindle-shaped cells were found along the edge of tissue particles after cultured for 24 hours. After subculturing, cells spread even faster and took on a homogeneous cobblestone-like appearance, with the purityexceeding 98%. Morphological observations and detections of related antigen results conformed that these cultured cells were Ⅷendothelial cells. It is a convenient and effective approach to gain a large scale of PMVECs from neonatal mice by tissue-anchoring method and endothelial cell medium.Huang CX, He T, Xing YQ. Primary cultivation of mouse pulmonary microvascular endothelial cells by improved adherence method combined with endothelial cell culture medium. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2012;16(15): 2691-2694. [ ]摘要背景：肺微血管内皮细胞是研究微循环的重要内皮细胞模型之一，众多培养方法中单纯贴壁法操作相对简便，但耗时长，杂质细胞多，是批量培养细胞的最大障碍。
目的：建立优化的小鼠肺微血管内皮细胞体外培养方案，观察细胞生长状态并鉴定细胞性质。
方法：无菌状态下快速剪碎5日龄C57BL/6J 小鼠的肺叶外周组织，肺组织颗粒贴壁法获得肺微血管内皮细胞，并用内皮细胞培养基培养。
倒置显微镜观察培养细胞生长和行为状态，Ⅷ因子相关抗原免疫组化和免疫荧光进行细胞鉴定。
结果与结论：肺组织块培养24 h 内可见梭形细胞爬出，传代后细胞生长迅速，形态规则呈鹅卵石状，纯度高达98%以上，结合Ⅷ因子相关抗原检测证实其为内皮细胞。
结果可见联合运用肺组织颗粒贴壁和内皮细胞培养基可高效获得原代小鼠肺微血管内皮细胞。
关键词：肺微血管内皮细胞；细胞培养；优化；鉴定；小鼠；血管组织工程缩略语注释：PMVECs: pulmonary microvascular endothelial cells ，肺微血管内皮细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.15.007黄偲璇，贺涛，邢怡桥. 改良贴壁法结合内皮细胞培养基培养小鼠肺微血管内皮细胞[J].中国组织工程研究，2012，16(15): 2691-2694. [ ]0 引言微血管内皮细胞的稳态是机体微循环处于正常生理状态的关键。
近年来研究人员发现微血管内皮细胞不仅起到微血管屏障作用[1]，还能分泌一些细胞因子影响周围细胞和组织的生物学功能，在新生血管性等疾病发生发展中起重要作用[2]。
建立稳定的血管内皮细胞培养体系能对这些疾病发病机制有更深入的认识。
但血管内皮细胞培养条件苛刻，通过原代培养获得大量纯种细胞困难，耗时较长。
采用酶原消化法和磁珠筛选法的不足在于对细胞损害大，过程复杂，研究成本较高[3]。
组织块贴壁法是一种简单传统的培养方法，常见问题是培养过程中杂细胞的混入，而小鼠肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells, PMVECs)如果受到其他细胞的干扰可发生变化，会影响实验结果。
因此，本实验依据小鼠PMVECs 的特性建立合理、可行性高的综合培养方案。
1 材料和方法设计：细胞学体外观察实验。
时间及地点：实验于2010-06/2011-01在武汉大学人民医院眼科研究所完成。
材料：实验动物：选取2只健康5日龄SPF 级C57BL/黄偲璇，等. 改良贴壁法结合内皮细胞培养基培养小鼠肺微血管内皮细胞P .O. Box 1200, Shenyang 110004 2692www.CRTER .org6J 小鼠，体质量(9±3) g ，由武汉大学人民医院动物实验中心提供。
主要试剂和仪器：方法：小鼠PMVECs 培养：2只健康5日龄SPF 级C57BL/6J小鼠，皮下注射苯巴比妥100 mg/kg ，5 min 后颈动脉放血处死，体积分数为75%乙醇浸泡2 min 。
取出后，无菌条件下剪开胸腔暴露心肺，剪取肺叶放置在无菌培养皿内。
超净台中剪除肺叶脏层胸膜，取胸膜下肺组织，用显微剪将肺组织块剪碎呈近匀浆状态，加入青链霉素低糖DMEM 培养液10 mL 摇匀，再用吸管将其转至200目不锈钢筛网，DMEM 培养液反复冲洗，翻转筛网，收集网上的细小团块样组织，均匀植入0.1%明胶包被过夜的培养皿内，加入内皮细胞培养液没过组织块(尽量避免过多液体而使颗粒漂浮)，静置于体积分数为5% CO 2 37 ℃细胞培养箱，6 h 后追加内皮细胞培养液2 mL 静置培养，每24 h 半量换液，60 h 后用显微镊小心剔除组织块，加内皮细胞培养液2 mL 继续培养。
7 d 左右细胞汇合成单层时进行1∶2传代，即用双抗PBS 缓冲液漂洗1次，1 mL 0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA 常温消化2.0~3.0 min ，显微镜下观察细胞间连接疏松则立即倒出消化液，加入内皮细胞培养基3 mL 终止消化，用吸管吹打使细胞脱落并充分混匀，以(2.0~3.0)×108 L -1的接种浓度，每25 cm 2培养瓶接种3 mL 细胞悬液，置培养箱中继续培养。