皮下脂肪组织微血管内皮细胞的分离和培养
人脂肪基质细胞体外分离与培养的实验研究
・基础论著・文章编号 1007-9564(2006)11-1213-03人脂肪基质细胞体外分离与培养的实验研究063000 河北省唐山市,华北煤炭医学院附属医院神经内科 叶新春 刘 斌 王瑞敏3关键词 人脂肪基质细胞;组织分离;细胞培养摘要 目的 探讨人脂肪基质细胞体外分离与培养,为其将来应用于组织工程提供基础。
方法 通过外科手术获得腹部皮下的脂肪组织,进行体外分离培养脂肪基质细胞,并在相差显微镜下每日观察、记录人脂肪基质细胞的生长状况,并用CCK-8测定其生长生活。
结果 人脂肪基质细胞呈现梭形外观,增殖旺盛,体外容易扩增。
结论 我们建立了一种自人体脂肪组织分离、培养人脂肪基质细胞简便稳定的方法,为其应用于组织工程提供了基础。
ISOLATION AN D CU LTIVATION OF HUMAN ADIPOSE-DERIVE D ADU LT STR OMA L CE LLS IN VITR O Ye X inchun, L i u B in,W ang R uimin.Department of N eurology,T he A f f iliated Hos pital of N orth China Coal Medical College,T an2 gshan063000,ChinaK ey w ords adipose-derived adult stromal cells;tissue isolation;cell cultureAbstract Objective To establish an approach for isolation and cultivation of human adipose-derived adult stromal (ADAS)cells in vitro.Methods The adipose tissue was obtained f rom the omentum of abdominal surgery patients under the aseptic condition,then it was isolated and cultured in vitro.The phase-contrast microscope was used to observe human adipose-derived adult stromal cells every day and the viability of human adipose-derived adult stromal cells was assessed by CC K-8.R esults Human adipose-derived adult stromal cells appeared as a monolayer of spindle-shaped,fibroblastic cells with active proliferation,and they can proliferated easily in vitro.Conclusion A simple and stable method for isolation and cultivation human adipose-derived adult stromal cells is successf ully established,which provides the foundation for fu2 ture usage of human ADAS cells in tissue engneering. 以美容为目的的脂肪组织切除术诞生于100多年前[1]。
改良的心肌微血管内皮细胞分离培养方法
改良的心肌微血管内皮细胞分离培养方法李玉珍;刘秀华;蔡莉蓉【期刊名称】《微循环学杂志》【年(卷),期】2006(016)004【摘要】目的:建立一种细胞获得率高并且操作简单的心肌微血管内皮细胞体外培养体系.方法:无菌条件下分离左心室,0.1%胶原酶消化6 min后,加0.1%胰蛋白酶继续消化4 min,用100 μm滤网过滤消化液,离心收集滤液中血管段进行培养.用内皮细胞的重要标记物VIII因子相关抗原鉴定细胞,并通过3H-TdR掺入法观察培养细胞对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的反应性.结果:细胞的获得率为1.2×106细胞/g心肌组织,显微镜观察培养细胞具有内皮细胞生长特性:单层"卵石样"排列特征;VIII因子免疫细胞化学染色呈阳性;证实获得的是内皮细胞.bFGF刺激后3H-TdR掺入率与对照组比较差异显著(P＜0.05).结论:本研究利用改良的酶消化法,缩短了消化时间,提高了细胞获得率,同时培养的内皮细胞对生长因子具有良好反应性,表明该方法是一种比较理想的体外心肌微血管内皮细胞培养体系.【总页数】4页(P10-11,14,封二)【作者】李玉珍;刘秀华;蔡莉蓉【作者单位】中国人民解放军总医院基础医学所病理生理研究室,北京,100853;中国人民解放军总医院基础医学所病理生理研究室,北京,100853;中国人民解放军总医院基础医学所病理生理研究室,北京,100853【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.改良的大鼠心肌微血管内皮细胞培养方法 [J], 王志华;张普;朱伟;张庆勇2.改良的成年SD大鼠心室肌细胞分离与培养方法 [J], 韩福平;陈耀旭;苏浩;吕南英;殷春霞;黄礼杰;谭文3.新生大鼠原代小胶质细胞分离培养方法的改良 [J], 钱凯;唐琳俊;王希;杨坤;张开鑫;钱腾达;马涛;石晶;李立新4.大鼠主动脉内皮细胞改良型分离培养方法 [J], 林翠红;刘光辉;杨田野;赵利;王航;史常旋;孟春5.一种改良的原代大鼠乳鼠心肌细胞分离及培养方法 [J], 程俊;曾晓荣;谭晓秋;李鹏云;文静;陈琳琳;杨艳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
脑微血管内皮细胞的培养及鉴定
试剂配制
1. 双抗：用三蒸水将青霉素、链霉素配成双抗 1:10000U，然后过滤分装，－20℃保存。 2.100×L-谷氨酰胺：称量2.923g L-谷氨酰胺，定容 于100ml dd H2O，浓度为200mmol/L。0.22针头 滤器过虑。－20℃保存。 3. 肝素：用PBS将粉剂肝素溶解为500U/ml，过滤后 4℃保存 4. 组织洗涤液：2％FBS，10％双抗（如为无菌手术 标本则为2％），DMEM。4℃保存。 FBS需先56℃灭活过滤、分装。－20℃保存。
• 实验试剂：
DMEM、30％葡聚糖Dextran、10×PBS及PBS（无钙、 镁离子）、RPMI1640、肝素heparin、丙酮酸钠、Ι 型胶原蛋白Collagen Type1、MEM non-essential amino acids、胶原蛋白酶Collagenase/Dispase （以上各试剂4℃保存）、FBS(胎牛血清)、1：1万 单位青、链霉素双抗、NuSerum、ECGS 、L-谷氨酰 胺、MEM vitamins、DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)、胰酶（以 上各试剂－20℃保存）。
试剂配制
5.消化液：用蒸馏水将胶原蛋白酶和Dnasel分别溶解成 100mg/ml。4°c保存。试验进行至消化环节时用DMEM将 Dnasel和胶原蛋白酶配成终浓度分别为为0.1mg/ml DNasel， 1mg/ml胶原蛋白酶的液体 。各种组成混合后0.22过滤灭菌 (100mg/ml的DNasel 2ul,胶原蛋白酶20ul加入到2mlDMEM中 混匀，0.22um过滤，加入15ml离心管中）。 6.培养基（以下各浓度均为终浓度）：RMPI 1640，10％FBS， 10％NuSerum，ECGS 30μg/ml，1％双抗，肝素5 U/ml，L谷氨酰胺2mmol/L，1mmol/L丙酮酸钠，MEM non-essential amino acids，MEM vitamins各1％。各组分过滤后混合。 4°c保存。
内皮细胞增殖实验步骤
一、脐带内皮细胞的分离1. 脐带收集用无菌止血钳夹闭脐带两端，在止血钳外侧剪断脐带，放入盛有4 ℃Cord Buffer 的饭盒内。
脐带在4 ℃放置不应超过24 小时。
2. 脐带内皮细胞分离（1）带无菌手套，取出脐带，在止血钳内侧用碘酒和酒精棉球消毒后，用无菌剪刀将两端脐带剪除。
（2）在脐带一端找到静脉，插入脐带静脉插管，用2 根粗丝线扎牢，用Cord Buffer 抽吸有的30 ml注射器冲洗静脉腔，至将脐血洗净。
（3）赶出静脉腔内残余液体，将脐带另一端用止血钳夹闭，用10 ml注射器连接针头，注入37 ℃预热的0.1 ％胶原酶约6-8 ml，放入37 ℃Cord Buffer中保温6-10 min。
（4）吸出静脉腔内胶原酶所消化的细胞悬液，加入预加有20 ml Cord Buffer的离心管中，冲洗静脉腔，一并加入离心管中。
（5）离心，1500 rpm，10 min弃上清，用5～7 ml 20 ％FCS，RPMT 1640重悬细胞，转入培养瓶，放5 ％CO孵箱。
二、牛下丘脑内皮细胞生长因子粗提物的制备1. 取新鲜牛下丘脑，加1.5倍体积的冰生理盐水用组织匀浆机匀浆，每次0.5 min，共6次。
2. 在4 ℃条件下用震荡器机械震荡约1.5 h。
3. 离心，10000 g，40 min，收取上清液。
4. 按0.5 ％加硫酸链霉素，4 ℃过夜。
5. 离心，20000 g，40 min，收取上清液。
6. 用紫外分光光度测280 nm，260 nm OD值按公式计算蛋白含量。
7. 过滤，分装，-20 ℃保存备用。
三、内皮细胞的培养与鉴定1. 培养瓶包被明胶培养瓶（25 cm）中加入0.2 ％明胶3 ml，使其铺满瓶底，放4 ℃备用。
用前弃去明胶溶液。
2. 原代培养将从脐带静脉中收集到的内皮细胞移入包被明胶的培养瓶（25 cm），加5～7 ml 20 ％小牛血清199培养基，按终浓度分别为20 μg/ml和100 μg/ml加入内皮细胞生长因子粗提物和肝素。
人脂肪组织基质血管组分的分离培养
人脂肪组织基质血管组分的分离培养作者：庄伟, 谢良地, 黄杰, 许昌声【关键词】脂肪组织; 细胞外基质；细胞,培养的ABSTRACT: Objective To establish a method for the isolation and culture of stromal vascular fraction(SVF) of human adipose tissue in vitro, which has the characteristics of stem cells. Methods Normal human abdominal subcutaneous adipose tissue was digested with collagenase Ⅰand precipitated by centrifuge. The lowest layer cells were suspended and cultured with DMEM F12. Immunofluorescence assay was used to determine the presence of the surface molecule marker CD31 and CD34. Results Immunofluorescence assay showed that about 70％ of the 2nd generation of cultured SVF cells were CD34 positive, but CD31 negative. Conclusion A rapid reproducible method was set up for the isolation and culture of SVF with the characteristics of stem cells from human adiposetissue, which possess clinical and research implication of stem cells.KEY WORDS: adipose tissue; extracellular matrix; cells, cultured传统的干细胞多取材于胚胎、骨髓和脐血,在伦理和供体来源方面受到一定限制。
血管瘤血管内皮细胞体外分离纯化方法的优化
血管瘤血管内皮细胞体外分离纯化方法的优化目的：寻找更高效的婴幼儿血管瘤内皮细胞培养方法，为婴幼儿血管瘤的研究提供基础的科研保证。
方法：选取增生期婴幼儿血管瘤手术标本，采用组织块贴壁法与酶消化法结合进行原代培养；二代细胞进行流式分选，取CD31阳性的细胞继续培养。
分别进行细胞形态学观察、细胞表面标记物免疫荧光鉴定、细胞表面标记物流式鉴定。
结果：培养48～72h清晰可见组织块周围细胞游出，细胞核清晰，细胞呈长梭形及多边形，2周左右部分可形成“血管腔样”结构，20d可铺满平传代；细胞流式测定CD31阳性率达98.4%，VWF与CD31双阳率90.3%，免疫荧光染色CD31、VWF均呈阳性表达。
结论：组织块与消化结合法经流式分选后可获得高纯度的内皮细胞，为下一步研究婴幼儿血管瘤增生消退机制奠定了基础。
Abstract：Objective To explore the endothelial cell culture method of more efficient infant hemangioma ，to provide the basic research guarantee for the research of hemangioma of infants. Methods In order to select the surgical specimens of the hemangioma of the hyperplasia，the primary culture was carried out by means of Tissue block adherent and enzyme digestion. Two generations of cells were selected for flow separation，and CD31 positive cells continued to be cultured.It were respectively carried out to observe the cell of morphology，immunofluorescence identification of cell surface marker，of fluid identification of cell surface marker. Results The cells in the tissue block around the tissue block could be clearly visible from 48-72 hours. The nuclei were clear，the cells were long fusiform and polygons，and the portion could form “blood vessel cavity” structure in about 2 weeks. The positive rate of CD31 was 98.4%，the VWF and CD31 were 90.3%，and the immunofluorescence staining CD31 and VWF were positive. Conclusion The high purity endothelial cells can be obtained after the flow separation of the means of tissue block and digestive association，which lays the foundation for the next study on the mechanism of proliferation and regression of hemangioma of infants.Key words：infant hemangioma；cell culture ；flow separation；tissue block and enzyme digestion method；hemangioma endothelial cells嬰幼儿血管瘤（Infantile hemangioma）是来源于内皮细胞的先天性良性肿瘤，好发于面颈部（60%）[1-2]，可造成皮肤色素沉着，瘢痕甚至畸形等，但其病因和发病机制目前并不清楚[3-4]，组织病理学证实血管瘤增生期可发现大量微血管内皮细胞增生[5-6]。
皮下分离操作技术
皮下分离操作技术
皮下分离操作是一种少见的外科技术，主要是分离被同一组织紧紧围绕着的两个器官。
它是以保护受影响器官的组织层作为基础，将表面的联结错过的手术。
在部分皮下分离的情况下，如特定的脑疾病，表层的连接会被删除，并用一层保护性的层向内部转移。
该手术的优点在于不会破坏原有的组织或器官的结构，通过分离两个器官，可以让医生更容易进行诊断和治疗。
皮下分离手术可以应用于脑部，脊椎，神经系统，心血管系统，消化系统和泌尿系统等疾病的诊断和治疗。
例如，它可以用来诊断脑肿瘤，确定脑血管的位置，识别病变的位置，检查脊椎病变，发现脑膜病变或癫痫，以及在心血管病变，消化系统病变和泌尿系统病变诊断和治疗中起着重要作用。
皮下分离操作手术需要手术室，具备一般手术要求，并由外科医生及器械师进行，首先对操作患者进行充分休息和镇痛，然后外科医生根据图像检查结果确定手术部位，运用局部麻醉进行工作，再运用切口和割支技术，最后进行收口整形局部处理。
皮下分离操作技术具有安全可靠，无污染且疗效显著等特点，可以有效避免器官系统受到损害，还能提高病人的生活质量。
血管内皮细胞培养方法
血管内皮细胞培养方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：血管内皮细胞是一种位于血管内壁的重要细胞，它们在维持血管结构稳定、调控血管张力和血液循环等方面发挥着重要作用。
对血管内皮细胞进行培养研究具有重要的生物学意义和临床应用前景。
下文将介绍一种常见的血管内皮细胞培养方法，希望能为相关研究工作提供一些帮助。
一、血管内皮细胞的来源：血管内皮细胞主要来源于人体的血管组织，通过合适的方法可以从血管中分离和提取。
通常来说，可以选择人体动脉、静脉等血管组织作为细胞来源，从中分离得到血管内皮细胞进行培养。
在实验动物中，也可以选择小鼠、大鼠等动物的血管组织来获取血管内皮细胞。
1. 血管组织的分离和处理：需要将血管组织从人体或动物中取出，并去除周围的结缔组织和肌肉组织。
然后，将血管组织切成小段，并用适当的消化酶进行消化处理，使内皮细胞从血管组织中释放出来。
2. 血管内皮细胞的分离和纯化：经过消化处理后，将获得的细胞悬液进行离心分层，采集含有内皮细胞的上清液。
然后，可以通过负性筛选或CD31抗体磁珠等方法将内皮细胞进行进一步的分离和纯化。
3. 血管内皮细胞的培养和传代：将得到的血管内皮细胞接种到预先涂有明胶或基底膜的培养皿中，加入适当的培养基和生长因子，将细胞放入细胞培养箱中进行培养。
随着细胞的增殖和扩张，可以进行细胞的传代，维持内皮细胞培养的稳定性。
4. 血管内皮细胞的鉴定与应用：在进行内皮细胞培养的过程中，需要对细胞进行鉴定，确认其具有内皮细胞的特征和功能。
通过免疫组化染色、PCR检测等方法，可以检测内皮细胞表面标记物和相关基因的表达情况。
血管内皮细胞在动脉粥样硬化、血管疾病等方面的研究应用也具有广泛的前景。
1. 培养环境的控制：血管内皮细胞对培养环境的要求比较严格，需要在无菌条件下进行培养，并保持适当的温度、湿度和CO2浓度等参数。
2. 培养基的选择：选择适合血管内皮细胞生长和扩张的培养基是培养过程中的关键。
关于小鼠动脉血管内皮细胞的原代培养和鉴定
关于小鼠动脉血管内皮细胞的原代培养和鉴定【摘要】目的探讨小鼠动脉血管内皮细胞分离、培养的方法，为进一步实验研究提供相应的技术手段。
方法手术显微镜辅助下取小鼠主动脉，去除外膜及脂肪组织，将血管剪成1 mm×1 mm大小的组织块，用植块法在含20% 胎牛血清的DMEM培养液中培养。
倒置相差显微镜观察细胞形态和生长特征，免疫细胞化学方法进行血管内皮细胞Ⅷ因子相关抗原（von Willebrand factor，vWF）鉴定。
结果60 h后，相差显微镜下可观察到内皮细胞从组织块边缘游出，12天左右细胞开始融合成片，免疫染色相关抗原检测呈阳性。
结论用组织块培养方法可以获取较为满意的小鼠血管内皮细胞。
【关键词】小鼠血管内皮细胞原代培养Abstract： Objective To develope an efficient protocol for the isolation and culture of vascular endothelial cells from mouse aorta. Methods The aorta was removed from mice under an operation microscope，with the periadventitial fat and connective tissue cleared of carefully. The vessel was opened longitudinally and cut into small 1 mm×1 mm cubes. The cubes were placed on six-well plates with the intima side down and covered with a little DMEM containing 20% fetal bovine serum. The cell growth was evidenced by revealing the morphological characteristics and immunological marker VIII factor (or von Willebrand factor， vWF). Results Endothelial cells were found migrate out of the aortic cubeafter 60 h， forming confluent monolayer of a cobblestone pattern when observed under inverted phase-difference microscope about 12 days later. Immunohistochemical labeling showed the characteristic positive reaction to vWF in the cytoplasm of the new cells. Conclusion A reliable methodis described to isolate and propagate vascular endothelial cells from mouse aorta by cultivating small tissue cubes.Key words: mice；vascular endothelial cells； culture在异种器官移植中，移植物血管内皮细胞是受体血流首先接触的组织，也是受体抗体攻击的主要靶细胞［1］。
原代内皮细胞的分离与培养
原代内皮细胞的分离与培养材料1. PBS3. DMEM/F12.5. 青霉素G (5000 U/mL) +链霉素(5000 μg/mL).6. 内皮细胞生长添加剂（ECGS）.7. 肝素.8. 热处理FBS。
56°C，30 min (see Note 1).9. HUVEC培养基(Table 1).使用前加温到室温或37°C 。
建议分装到50-mL 管，4°C储存，直至使用。
避免重复加温和冷却。
10. 胶原酶A(Sigma). 13mg/100mL 溶解到无血清的DMEM/F-12，含青霉素和链霉素分别50 U/mL 和50 μg/mL。
0.2-μm filter过滤。
应该现用现配。
11. 胰蛋白酶EDTA.A5X储备液（Table2）.0.2-μm filter过滤消毒。
以10-mL 分装入50-mL 管，-20°C储存。
使用前加40 mL无菌去离子水稀释到1X。
4°C保存可达到4 周。
12. 纱布(高压灭菌).13. 套管。
14. 双向开关活塞。
15. 止血钳。
16. 尼龙绳。
17. 手术刀片。
18. 烧杯。
19. 酒精。
20. O.2-μm 滤膜。
21. 漂白粉。
22. 30-mL 注射器。
23. 0.2%明胶。
，2% 明胶储备液1 mL 稀释到9 mL PBS制成0.2%明胶工作液10 mL。
24. 50-mL管。
25.100-mm 组织培养板(Falcon).26. Ficoll-Paque (Amersham).29. HUVEC冷培养基。
需要容量的45% FBS、45% HUVEC培养基和10%二甲基亚砜(DMSO)混合，需要时现配。
使用前必须是冰冷的。
30. 抗体：兔抗人vWF) (Dako), 羊抗人VE-cadherin (Santa Cruz).31. 4%多聚甲醛(Fisher)。
在通风橱内，加热到65°e，每100mL PBS溶解4g多聚甲醛。
一种大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法[发明专利]
![一种大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/e616962ffbd6195f312b3169a45177232e60e445.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610556064.9(22)申请日 2016.06.30(71)申请人 江苏齐氏生物科技有限公司地址 214434 江苏省江阴市东盛西路6号A7楼1单元（扬子江生物医药加速器）(72)发明人 田瑞 张亚洲 蒋敏 齐来俊 (51)Int.Cl.C12N 5/071(2010.01)(54)发明名称一种大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法(57)摘要本发明提供一种大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法，包括步骤：(a )大鼠颈椎脱臼处死，消毒并断头置于玻璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑；(b )在无菌条件下，剥离解剖去除小脑、间脑以及去除软脑膜和脑膜大血管等，保留大脑皮质；(c)通过机械酶消化法，并结合连续密度梯度离心法获得纯度较高的脑微血管片段；(d)将纯化的脑微血管片段铺置特制的细胞培养皿，并使用两种不同的培养基分离培养脑微血管内皮细胞。
本发明提供的大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法可获得产量高、纯度高且生存时间较长的大鼠脑微血管内皮细胞。
权利要求书1页 说明书3页 附图1页CN 107557329 A 2018.01.09C N 107557329A1.一种大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法，其特征在于，包括步骤：(a )大鼠颈椎脱臼处死，消毒并断头置于玻璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑；(b)在无菌条件下，剥离解剖去除小脑、间脑以及去除软脑膜和脑膜大血管等，保留大脑皮质；(c)通过机械酶消化法，并结合连续密度梯度离心法获得纯度较高的脑微血管片段；(d )将纯化的脑微血管片段铺置特制的细胞培养皿，并使用两种不同的培养基分离培养脑微血管内皮细胞。
2.根据权利要求1所述的大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述的大鼠为25-50g，2-3周龄的SD大鼠。
3.根据权利要求1所述的大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤c中机械酶消化法是将剥离干净的大脑皮质剪碎成约1mm 3大小，加入混合酶液I，混匀，37℃水浴消化1-1.5h；1000×g室温离心8min，去上清液；沉淀中加入一定浓度的BSA重悬浮，充分混匀，1000×g 4℃离心20min，去上清；沉淀加入4ml混合酶液II重悬浮，混匀，37℃水浴消化0.5-1h；700×g室温离心6min，去上清液；所述的混合酶液I是0.05-0.1％II型胶原酶，0.025-0.05％IV型胶原酶，200-400U DNaseI，所述的BSA浓度为15-30％，所述的混合酶液II是0.05-0.1％的胶原酶/分散酶，0.05-0.1％I型胶原酶，100-300UDNaseI。