Kupffer细胞分离培养

用镊子划碎肝组织
装入试管消化
肝脏消化吹打后细胞悬液
细胞悬液过滤
洗涤与肝细胞沉淀
梯度离心
• Percoll原液9份加入1份PBS（10倍浓度）配成100%的SIP。 • 取4支无菌离心管，沿着管壁加入2 mL 50％的SIP，然后倾斜（60o）
试管，轻轻的沿着管加2mL25％的SIP细胞悬液（小鼠2管，大鼠4 管）。 • 500×g，离心15 min，4oC， 50％的SIP和25％的SIP层面之间有一 层白色物，吸管轻轻的吸取之，置离心管中，用PBS离心清洗2遍， 弃上清(300×g，5min)。
非肝细胞SIP离心准备
SIP离心后细胞层与洗涤
细胞贴壁
• 把细胞按5x105/ml浓度种植于培养板中，培养2h。 取出培养板，用37℃的PBS液轻轻冲洗3次，去 除未贴壁细胞，贴壁细胞即为实验所用的KCs。
刚分离出的细胞
KCs的培养方法培养
• 5％CO2、37℃、95％湿度。换液间隔时间为2d。
• 取下肝脏加入20ml 0.05％胶原酶，37 oC孵育40 min，经200目细胞 筛过滤。
• PBS稀释至50ml, 300×g 5 min，4oC，离心洗涤2次，取沉淀PBS稀 释至50ml，用50g×g 3min, 4oC离心，弃沉淀，将上清液以300×g， 5min, 4oC离心，取沉淀。
KCs 吞墨图像与台盼蓝拒 然图片
F4/80的免疫荧光和CD163 免疫细胞化学(x400)
致谢
• 感谢连峥嵘，徐宇飞，柴跃龙，宗开灿，廖汪洋， 陈琦，等同学。
• 感谢其它关心和帮助我们的老师和同学。
培养基配方为DMEM（H）+双抗+10%胎牛血清 （HyClone）。
2天及3天KCs
2周及3周KCs
KCs的鉴定活力判定
• 通过形态学观察及吞噬功能鉴定活力：在体外培养的24
孔板细胞换液时，加入已消毒碳素墨水的培养基(1/250)， 2 h后倒置显微镜观察，记数200个细胞，观察具有吞噬功 能的细胞数量。0.2%台盼蓝拒染色判断细胞活力。 • F4/80免疫荧光鉴定KCs（小鼠）， CD163免疫组化鉴定 KCs（大鼠）,阳性为KCs。
肝脏巨噬细胞(KCs)的分离Βιβλιοθήκη Baidu与培养
研究生：魏思东 戴卓娅 导师： 龚建平
2010-05-04
肝脏细胞悬液制备
• 门静脉穿刺，以10ml／min流量经门静脉灌注PBS ，直至肝脏呈黄白 色，总量约20ml。再用20ml 0.05％的Ⅳ型胶原酶溶液(sigma ，PBS 液稀释)门静脉灌注(小鼠不用此步骤）。