第二章(2)植物组织培养操作技术
第二章植物组织培养基本原理
第二节 植物的脱分化
一、愈伤组织的形成
1、形成条件： ① 外植体的细胞类型不同，形成的愈伤组织也常常异质。 ② 离体培养条件对于愈伤组织的诱导至关重要。两个因素起主要作
用：激素种类、浓度。此外，光照、基本培养基的选择、外植体 的不同生育期等条件也很重要。
诱导愈伤组织产生的主要激素有：生长素和细胞分裂素类。 生长素类主要有：2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）, NAA（α-萘乙酸），IBA（吲
第二章 植物组织培养的基本原理
第二章植物组织培养基本原理
第一节 细胞全能性与细胞分化 一、细胞全能性理论的提出与发展：
植物细胞全能性理论是植物组织培养的核心理论。
1839年, Schwann提出有机体的每一个生活细胞在适宜的外部 环境条件下都有独立发育的潜能。
1901年, Morgan首次提出一个细胞应具有发育出一个完整植 株的能力。
第二章植物组织培养基本原理
分裂期
第二章植物组织培养基本原理
(3)分化期. 细胞体积大小稳定、细胞由平周分裂转为垂周分裂。 在分化末期，细胞的形态和结构上出现形态、功能不同的 区域。
第二章植物组织培养基本原理
5、 愈伤组织的生长过程的特点：
1）体积、重量： 2）生理生化特性：
诱导期、分裂期的细胞中RNA含量增加迅速、分化期含量 减少。 培养条件的改变影响了某些物质的合成。 继代培养时间的加长，愈伤组织可能出现“驯化现象”。 即在没有生长素的培养基上也能生长一段时间。
第二章植物组织培养基本原理
二、细胞分化：
分化： 植物体各个部分出现异质性的现象。 细胞分化
是导致细胞形成不同结构、引起功能改变或潜在的发育方 式改变的过程。 细胞分化 是基因在特定的时间和空间条件下选择性表达的结果。 一个活细胞从植物体内分离出来，脱离开原有的环境，其被抑 制的功能将得以恢复，重新表现出全能性。
植物组织培养操作技术
植物组织培养操作技术摘要植物组织培养的重点在于操作，操作规范与否决定了组培工作的成败，该文就溶液配制、培养基制作、灭菌技术、接种及造成污染的原因进行分析总结，并提出了相应的解决方法，对组培日常工作起到一定的指导作用。
关键词植物组织培养；技能；操作植物组培快繁技术是生物技术领域中的一项新技术，也是高科技技术。
以前大多停留在实验室阶段，如今部分企业已经实行产业化市场运作，直接服务于经济发展。
植物组织培养生产是一个系统工程，从一个外植体（芽、侧芽、叶片、茎段、花梗、花托、根段、根芽等）→启动培养产生中间繁殖体→中间繁殖培养→生根幼苗培养→试管苗驯化移栽→田间定植，这些环节都需要熟练的操作技术，才能保证生产计划的按时完成。
操作技术主要包括熟练地配制培养基，具备娴熟的接种技术，掌握各种灭菌技术，以最大限度地减少污染的发生。
操作人员应具备一定的化学知识，以对实验室基本设备进行日常管理及维护。
1 溶液配制技术组培工作中需要配制一定浓度的培养基母液、灭菌剂，这也是组培工作的首要环节，一定要会使用相关的设备仪器，还要懂得各种化学药品性质，才能掌握各种药品溶液的配制技术。
1.1 准备工作在配制药品前，要准备相应范围的电子天平，仔细核对各种药品，检查与润洗各种玻璃仪器和器皿。
1.2 操作要点1.2.1 电子天平的正确使用及称量。
称量前清洁、检查天平水平、调整零点；称量的最大量不得超过天平的最大负荷；具有腐蚀性的化学药品不得直接放入称盘内；称量值超过所需值时用纸筒慢慢摄取，然后关住天平侧门使其读数稳定，直至观察值达到所需值为准；打开或关闭天平门时动作要轻、慢、稳，以防影响最终读数；读数时必须关好天平门，防止气流影响；称量完毕后归零断开电源。
1.2.2 溶液混合与溶解。
溶液混合时按其化学性质进行溶解，以防止沉淀的产生；溶解时要缓缓加入蒸馏水，不断用玻璃棒搅拌，注意玻璃棒不要碰到烧杯壁，分多次少量洗涤玻璃棒和烧杯并移入容量瓶中，如果是一定浓度的溶液注意刻度线的标线；对需助溶的物质（激素）加入不同助溶剂，微热使其充分溶解。
植物组织培养步骤
植物组织培养概念（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
植物组织培养概念（狭义）指用植物各部分组织，如形成层.薄壁组织.叶肉组织.胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
组织培养的步骤一、培养基配制配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基中所有化学药品，按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂，如MS、B5等。
自己配制可以节约费用，但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦。
就目前国内的情况看，大部分还是自己配制。
为了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程。
1、配制几种母液（1）配制MS大量元素母液一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。
分别称取NH4NO3 165g KH2PO4 17gKNO3 190g CaCl2·2H2O 44gMgSO4·7H2O 37g各自配成1L的母液。
倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。
（2）配制MS微量元素母液一般将微量元素配制成100倍母液。
依次称取KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025gH3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025gMnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O 0.0025gZnSO4·7H2O 0.86g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。
CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。
分别称取CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2O 0.05g各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。
2019-2020沪科版生物选修3第1单元 第2章 第2节 植物组织培养
第二节植物组织培养1．理解植物细胞全能性的含义。
2．简述植物组织培养的过程。
(重点)3．说出植物组织培养技术的应用。
(难点)知识点一| 植物细胞的全能性与植物组织培养技术1．植物细胞的全能性(1)含义植物体的每一个活细胞都具有形成完整植物体的遗传潜能。
(2)物质基础植物体的全部体细胞都具有发育为完整个体所必需的全套遗传物质。
(3)现实表现①在植物体内，细胞分化成为不同的组织和器官。
②原因：基因在特定的时间和空间条件下选择性表达的结果。
(4)体现全能性的必需条件①脱离原来组织器官的束缚，成为游离状态。
②一定的营养条件和植物激素的诱导。
2．植物组织培养技术(1)植物组织培养的概念①培养对象：外植体(即离体的植物器官、组织或细胞)。
②条件：a.无菌，b.含有营养物质的培养基，c.适宜的光照、温度、湿度等环境条件。
③结果：形成完整植株。
④核心：诱导脱分化和再分化。
(2)原理植物细胞的全能性。
(3)过程[合作探讨]探讨1：植物的种子能发育成完整的植株，是否体现了细胞的全能性？为什么？提示：没有，因为种子中的胚已完成了早期发育，相当于新植物体的幼体，发育成完整植株的过程，相当于植物的长大。
探讨2：美国科学家将分离得到的成熟胡萝卜根的韧皮部细胞进行培养，由单个细胞发育成了完整植株，培养过程如下图所示。
此实验说明了什么问题？提示：分化的植物细胞仍具有全能性。
探讨3：在菊花的组织培养操作完成了3～4天后，观察同一温室中的外植体，发现有的瓶内外植体正常生长，有的瓶内外植体死亡，你认为外植体死亡的原因可能有哪些？提示：接种时培养基灭菌不彻底；接种工具灼烧后未待冷却就接种外植体；培养过程中保持温度、pH 的适宜，但没有及时调整各种营养物质和激素的比例。
[思维升华]1．植物细胞全能性表达所需条件(1)体细胞未表现全能性的原因：基因的选择性表达。
(2)体现细胞全能性的条件：(1)无菌：植物组织培养成功的关键是避免微生物的污染，所有实验用具要严格灭菌，接种过程进行严格的无菌操作。
植物组织培养技术
植物组织培养技术第一章绪论第二章植物组织培养实验室组成、仪器设备及无菌操作技术第三章植物组织培养基本原理第四章器官培养技术第五章植物胚胎培养第六章花粉及花药培养第七章细胞及原生质体培养第八章组培培养技术在中药学上的应用第一章绪论一、植物组织培养的概念1. 概念植物组织培养（Plant tissue culture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。
2.主要特征（1）在培养容器中进行；（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。
（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。
二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。
1、根据培养材料不同分为：（1）完整植株培养（Plant Culture）：对幼苗和较大植株等的培养。
（2）胚胎培养（Embryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。
（3）器官培养（Organ Culture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。
（4）组织培养（Tissue Culture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。
（5）细胞培养（Cell Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。
（6）原生质体培养（Protoplast Culture）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。
2、根据再生途径分为：（1）器官发生途径（Organogenesis）：直接器官发生途径：植物器官可以直接由外植体上诱导。
如茎尖培养。
间接器官发生途径：成熟细胞经过脱分化（dedifferentiation）及再分化（redifferentiation）过程而形成新的组织和器官的过程。
植物组织培养(全)
胚培养是器官培养的一种。选用的外植体是成熟或未成熟的胚进行离体无菌培养。其具体方法是将取出放在液体或固体培养基上培养，由于胚包含在胚珠和子房里，因而进行胚胎培养时，常常是将胚珠和子房放在培养基上培养。
胚培养用途：1.拯救胚2.研究胚的发育营养研究3.一些特殊的领域的研究。
(4)细胞和原生质体培养
二是要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。
全能性体现的两个过程
一个已分化的细胞要表现它的全能性，必须经历两个过程，即首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。
再分化的过程有两种方式：
一是器官发生方式 二是胚胎发生方式
2.激素（植物生长调节剂）调控
后来证明，激素可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于在不同组织中这些激素的内生水平不同，因而对于某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源激素的水平也会有所不同。
⑤1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。
当把茎尖接种在含有细胞分裂素的培养基上以后，将可使侧芽解除休眠状态，而且，能够从顶端优势下解脱出来的不只是那些既存于原来茎尖上的腋芽，此外，还有由原来的茎尖在培养中长成的侧枝上的腋芽，结果就会形成一个郁郁葱葱的结构，里面包含了数目很多的小枝条，其中每个小枝条又可取出来重复上述过程，于是在相当短的时间内，就可以得到成千上万的小枝条。当把这些小枝条转够到另外一种培养基上诱导生根以后，即可移植于土壤中。
奠基阶段（从20世纪30年代中至20世纪50年代末）
30年代中期，植物组织培养领域两个重要的发现，其一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素--一种天然的生长调节物质。
植物组织培养技术
初代培养（ culture） 初代培养（primary culture）：指在组织 培养过程中，最初建立的外植体无菌培 养阶段。由于首批外植体来源复杂，携 带较多细菌，要对培养条件进行适应， 因此，初代培养一般比较困难。 继代培养（ subculture） 继代培养 （ subculture ） ： 在组织培养过 程中，当外植体被接种一段时间后，将 已经形成愈伤组织或已经分化根、茎、 叶、花等的培养物重新切割，转接到其 它培养基上以进一步扩大培养的过程称 为继代培养。
另一为药物和生物制品的工业生产，探索 天然药物生产工业化的途径是当前药物生产 的一个新方向，有可能用组织培养法来代替 全植物提取有效成分。组织培养应用在药学 方面的工作虽然历史不长，但发展很迅速， 它具有如下一些优点： 1．利用组织培养代替原植物的栽培以获得 所需的有效成分，达到产量高，成本低的目 的，还可节约土地。 2．除了应用于产生次生物质外，还可应用 于生物转化。例如烟草组织培养中蒂巴因去 甲基后可能生成吗啡。
目前中国已成功地将麦角菌、灵芝、猴 头菇等真菌进行工业化生产，高等植物组织 培养在工业化中的应用也正在研究。 总之，植物组织培养这一新技术在中草药 方面应用的前途是无限广阔的，它不仅有利 于探讨和阐明药用植物生理、遗传和成分生 物合成等一系列理论问题，而且一旦工业化 生产问题得到解决，将可以为防病治病做出 很大的贡献。
2 培养基的种类 MS培养基、B5培养基、White培养基、N6培养基等等。 3 培养基的配制 （1）混和培养基中的各成分 （2）融化琼脂 （3）调整pH为5.8 （4）分装 （5）灭菌 （6）放置备用
二组织培养操作的一般流程
1 2 3 4 5 6 器皿的洗涤 培养基的配制和灭菌 接种室及用具消毒 材料灭菌：70％酒精、氯化汞 接种 无菌培养
植物组织培养
植物组织培养植物组织培养：在无菌的条件下，将离体的植物材料包括器官，组织，细胞以及原生质体在人工培养基上进行培养，使其再生发育成完整植株的过程，又称植物离体培养。
细胞全能性：植物体的任何一个细胞都携带该物种的全部遗传信息，离体细胞在一定的条件下具有发育成完整植株的潜在能力。
外植体：植物组织培养中离体的植物材料，包括植物器官，胚胎、组织、细胞和原生质体。
细胞分化：导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。
脱分化：已分化成熟的植物组织或器官回复到分生状态，细胞开始分裂形成无组织结构的细胞团或愈伤组织的过程。
再分化：是指在一定条件下，脱分化形成的愈伤组织转变成为具有一定结构、执行一定生理功能的细胞团和组织、并进一步形成完整植株的过程，即从愈伤组织再生形成完整植株的过程。
愈伤组织：植物体受伤后的伤口处或在植物组织培养中外植体切口处产生的一团不定型的薄壁组织。
离体无性繁殖：根据植物细胞全能性原理，在无菌条件先短时间内形成大量植株。
玻璃化苗：在植物组培中，茎叶形成透明矮小肿胀的形态，生根能力差。
问答题：1、无菌操作是贯穿于整个组织培养过程的一门关键技术，请根据自己的体会论述如何在植物组织培养过程中做到无菌？1）取少菌的材料（春夏，中午的幼芽）2）严格灭菌3）合理安排操作程序4）无菌保存5）操作规范2、组培在生产上的应用有哪些？学好植物组培的意义？1）植物快速繁殖：增殖速度快，成本低，易于批量生成和管理。
比如利用一小块叶片或一个茎尖，一年内可繁殖出1000-100000株幼苗2）脱除病毒：植物在生长过程中几乎都要蒙受到病毒的危害，采用茎尖培养方法可以除去植物体内的病毒。
脱毒苗恢复了原有的优良种性，生长势明显增强，整齐一致。
3）培养新品种：克服远缘杂交不亲合性；克服远缘杂交的不孕性；选择细胞突变体；单倍体育种；转基因育种。
4）植物次生代谢产物生产：利用植物组织后细胞的大规模培养，可以生产一些天然有机化合物，这些次生代谢产物，往往具有一些特定的功能，对人类有重要的影响和作用。
植物组织培养第二章
（三）Байду номын сангаас细胞胚胎发生的基因表达机理（略）
二、植物体细胞胚胎发生途径
（一）体细胞胚胎发生的方式 由外植体诱导体细胞胚胎发生的途径有两种： 直接途径和间接途径。 直接途径：从外植体某些部位的胚性细胞直接 诱导分化出体细胞胚胎。这种“胚性细胞”是在胚 胎发生之前就已决定了的。 间接途径：外植体先脱分化形成愈伤组织， 在从愈伤组织的某些细胞，即重新决定为胚性细胞 的细胞分化出体细胞胚胎，多数体细胞胚胎的形成 是通过间接途径产生的。
植物愈伤组织的培养
愈伤组织培养是指将母体植株上的各个部分切下，形成 外植体，接种到无菌的培养基上，进行愈伤组织诱导、生长 和发育的一门技术。 一般情况下，植物组织均能诱发形成愈伤组织，由外植 体形成愈伤组织，标志着植物离体培养的开始。
差异：（1） 受精卵的全能性最高 （2） 受精卵分化 后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。 潜在全能性的原因：基因表达的选择性
科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一 定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就 可能表现出全能性，发育成完整的植株。 人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。
三、植物体细胞胚胎发生的极性和生理隔离
体细胞胚胎具有两个明显特点： 1、双极性 2、与母体组织或外植体的维管束系统无直接联系，处于较为 孤立的状态，即存在生理隔离。
（一）体细胞胚胎发生的极性
单个胚性细胞与合子胚一样，具有明显的极性，第一次 分裂多为不均等分裂，顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，基 细胞进行少数几次分裂形成胚柄。 （二）体细胞胚胎发生的生理隔离
第二章
植物组织培养的基本原理
植物细胞全能性理论是植物组织培养的核 心理论。 离体细胞具有生命的特征属性，在全能性的 基础上，提供合适的营养和环境条件，离体细 胞经历脱分化和再分化过程
植物组织培养
②影响细胞再分化因素： 从理论上讲，在离体培养条件下经过再分化可获 得各种
类型的细胞、组织、器官以及再生植株。但是目前，还不 能使所有植物的活细胞都再生植株。主要原因是： （1）不同植物种类再分化的能力差异较大（遗传背景）； （2）对某些植物再生条件还没有完全掌握。
有不同的培养反应。 （6）植物种类的差异。 一般双子叶植物比单子叶植物
及裸子植物容易。
4、愈伤组织（Callus）培养
①愈伤组织生长过程
在脱分化的过程中，多形成Callus, 其细胞结构无明 显极性。
• （1）诱导期：细胞准备进行分裂， 细胞大小几乎不变，
生理生化变化大，迅速合成蛋白质和核酸。
• （2）分裂期：外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成
小芯。细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。在原培养 基上，细胞会发生分化，及时转移，其可无限制地进行细 胞分裂，维持不分化状态。
• （3）分化期：细胞发生生理代谢变化，出现形态和功能
各异的细胞。
②愈伤组织的生长特性
（1）生长：诱导期后，外植体外层细胞分裂，在受伤 组织表面形成一层愈伤组织， Callus的细胞数目迅速增 多，表层细胞平均重量下降，体积变小；降低温度，可 以使细胞生长速度减慢，平均大小可增加。
1952年：Morel和Martin首次报道茎尖分生组织的离体培养，获 得无病毒大丽花植株。
1954年：Muir将烟草愈伤组织置于固体培养基上，在其上放一 片滤纸，再在滤纸片上放上一 个烟草体细胞，单细胞培养成功。
1956年：Miller分离出Kinetin，Kinetin/激动素
组织培养的奠基人
细胞分化是组织分化和器官分化的基础，是植株离 体再生的基础。
组织培养 植物组织培养基本操作
一、培养基的成分 培养基一般包括无机盐、有机化合物和生长调
节剂三大基本组成成分。 1、无机盐类 功能 离体组织生长发育的基本成分
根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两 类：
2020/3/24
大量元素—植物所需元素的使用量一般在每升几十 -几千毫克，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。
盐酸硫胺素-VB1、盐酸吡哆醇-VB6、烟酸-Vpp、 生物素-VH、维生素C-Vc。
⑶肌醇 功能 促进糖的转化、维生素和激素的利用，对 胚状体和芽的形成有良好影响。 用量一般50-100mg/L。
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⑷腺嘌呤 合成各种细胞分裂素的前体物质之一，利于细 胞分裂，促进芽的形成和生长。 ⑸氨基酸 蛋白质的成分，是有机氮化合物，常用甘氨酸 和多种氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白。 ⑹其它复合成分 成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、 酵母提取液、番茄汁、麦芽糖等。
休眠以及诱导单性结实等。 与生长素协调作用对形成层分化有影响，刺激体细胞
胚进一步发育成植株。 有20多种，目前主要是赤霉酸GA3。
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4、水 离体培养中，既是培养基营养成分的溶剂，又
是培养基的重要组成部分，占培养基成分的95%。 原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般
应用双蒸水或超纯水 大批量快速繁殖培养，可用一般蒸馏水或纯净
水。
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5、其它附加成分 ⑴琼脂
功能 来自海藻的多糖类物质，组织培养中 最常用作凝固剂，是最方便、最好的凝固剂和支 持物。
常用量0.6%-1.0%，不是培养基必需成分。 卡拉胶 海藻提取物，含杂质少纯度更高， 凝固后培养基透明，利于材料观察。
2020/3/24
植物组织培养实验室的组成、仪器设备及基本操作(精要)
有时添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，为牛乳经酶法加工的 水解产物，含有20种氨基酸的混合物，用量10－ 1000mg/L, 通常用于原生质体等培养。
此外肌醇是另外一种重要的有机成分，在维持离子平衡， 糖类的转化中起重要作用，此外还参与磷脂代谢及等生理作 用。它可以促进愈伤组织的形成，不定芽、不定胚的分化。
（一）矿质营养：
矿质营养又称无机营养，是指植物生 长发育所需要的各种化学元素。
矿质元素的生理作用：
（1）组成各种化合物，成为结构物质；
（2）许多酶和附酶的组成部分，参与 代谢；
（3）维持离子平衡、胶体稳定及电荷 平衡等电化学作用；
（4）影响形态发生和组织、器官的建 成等。
根据植物对元素的吸收量，可以把植物必 需元素分为大量元素和微量元素。
c.不少培养基颜色加深。
d.体积和浓度有所变化。
e.营养成分有时受到破坏。
3、不耐高温材料的灭菌：
采用过滤灭菌，如IAA、ZT、天然有机 添加物等。
4、外植体的表面灭菌：
采用70－75％乙醇（10-30秒）、有效 氯1％的次氯酸钠（5-30分钟）、0.1－ 0.2%的氯化汞（2-15分钟）等杀菌剂中加 入几滴吐温－20或80（Tween－20或80） 效果较好。
（二）接种室（无菌操作室）：
1、功能：
接种材料的灭菌、接种以及培养物的 继代转接等。
接种室要求保持洁净，与化学实验室 之间应设置缓冲室。
2、仪器设备及用品：
超净工作台、紫外灯、小推车、搁架、 磁盘、接种工具（各种镊子、解剖刀、手 术剪、普通剪刀接种针、酒精灯、手持喷 雾器、细菌过滤器等）等。
植物组织培养技术
植物组织培养技术植物组织培养（Plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官（根、茎、叶、花等）、组织（如形成层、花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞），以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株，统称为植物组织培养。
植物组织培养的过程可概括为：外植体脱分化或完整植株胚状体茎尖、胚及子房等器官做外植体可不经脱分化直接形成试管苗。
植物组织培养技术是生物技术的重要组成部分，在生产实践及基因工程、遗传转化等研究中有重要应用前景。
植物脱毒及离体快繁，花药培养与单倍体育种、幼胚培养与试管受精，抗性突变体的筛选与体细胞无性系变异，植物产品的工厂化生产等方面的研究和应用，均必须借助植物组织培养技术的基本程序和方法。
通过本实验，要求同学掌握植物组织培养操作技术；了解外植体脱分化及再生的过程；理解植物细胞全能性。
一、试材与用具1．植物材料：花生、烟草、苹果、大白菜、玉米等。
2．实验室：准备室、接种室、培养室等。
3．仪器设备：高压灭菌锅（器）、光照培养箱、振荡培养箱、天秤、酸度计、超净工作台等。
4．器械及用具：镊子、手术刀、接种针、细菌过滤器、记号笔等。
5．玻动器皿：三角瓶、培养瓶、培养皿、量筒、容量瓶等。
二、方法步骤（一）培养基的制备1．母液的配制在植物组织培养中，不同的植物，不同的器官和组织，不同的研究目的，使用不同的培养基，培养基尽管千差万别，按其性质和含量来分主要由以下几部分组成：①无机营养，包括大量元素和微量元素；②有机物质；③铁盐；④碳水化合物；⑤天然复合物；⑥激素；⑦琼脂（固体培养基）；⑧其他添加物。
在培养基的配制中，对各组分的成分，常先要按其需用量扩大一定倍数，配制成母液（表2－1）。
配制母液时应注意以下两个方面：（1）配制大量元素母液时，为了避免产生沉淀，各种化学物质必须充分溶解后才能混合，同时混合时要注意先后顺序，把钙离子（Ca2+）、锰离子（Mn2+）、钡离子（Ba2+）和硫酸根（SO42-）、磷酸根（PO43-）错开，以免形成硫酸钙、磷酸钙等沉淀，并且各种成分要慢慢混合，边混合边搅拌。
《植物组织培养》电子教案
《植物组织培养》电子教案第一章：植物组织培养概述1.1 植物组织培养的定义1.2 植物组织培养的历史与发展1.3 植物组织培养的应用领域第二章：植物组织培养的原理与技术2.1 植物组织培养的基本原理2.2 植物组织培养的操作技术2.3 植物组织培养的注意事项第三章：植物组织培养的实验操作3.1 实验材料的选择与准备3.2 实验设备的准备与使用3.3 实验操作步骤与技巧第四章：植物组织培养的实践案例4.1 植物繁殖的新途径4.2 植物品种改良与创新4.3 植物组织的应用前景第五章：植物组织培养的争议与伦理问题5.1 植物组织培养与生物安全5.2 植物组织培养与环境保护5.3 植物组织培养的伦理问题探讨第六章：植物组织培养的生物学基础6.1 植物细胞全能性的概念6.2 植物激素在组织培养中的作用6.3 植物基因表达调控在组织培养中的角色第七章：植物组织培养技术的进阶应用7.1 愈伤组织诱导与胚胎发生7.2 植物繁殖的新技术：微型繁殖与种子生产7.3 植物基因转化与遗传改良第八章：植物组织培养在农业领域的应用8.1 作物遗传资源的保存与利用8.2 抗病虫害作物的培育与应用8.3 逆境生物学与耐旱抗寒植物的培养第九章：植物组织培养在生物产业的应用9.1 植物制药与生物活性成分的生产9.2 植物生物反应器的研究与应用9.3 植物组织培养与生物降解材料的开发第十章：植物组织培养的未来发展趋势10.1 合成生物学在植物组织培养中的应用10.2 植物组织培养与数字农业的融合10.3 植物组织培养在可持续农业中的角色与挑战重点和难点解析一、植物组织培养概述难点解析：理解植物组织培养的概念及其在植物繁殖和生物技术中的应用。
二、植物组织培养的原理与技术难点解析：掌握植物组织培养的操作步骤和技术要点，以及实验过程中的注意事项。
三、植物组织培养的实验操作难点解析：实验操作的细节处理，如无菌技术的应用、外植体选择的重要性等。
植物组织培养技术
植物组织培养技术植物组织培养是70年代快速发展并趋成熟的现代生物技术，是在含有营养物质及植物生长调节物质的培养基中离体培养植物组织(器官或细胞)的技术。
它的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每一个细胞都有分化成一个完整植株的潜在能力。
该技术在品种选育、名特优品种的快速繁殖、自然资源的保护、品种质量的提高、濒危植物种质保存等诸方面都表现出巨大的应用前景，取得了明显的经济效益。
组织培养前景广阔植物组织培养技术一诞生就表现了强大的生命力和美好的前景。
它在细胞学、遗传学、农学、生理学、生物化学等学科的基础理论研究中，成了一种常用的生物学技术;在实际应用中也发挥了巨大作用，取得了显著的经济效益和社会效益。
育种：通过组织培养技术，结合诱变育种技术，成功地培育出许多优良品种。
如抗黄化叶病的大麦品种;培育出脱病毒的马铃薯、甘蔗品种，使马铃薯产量增加十多倍;选育出早熟(比母本提早15天)、优质(含糖量9.5%)、高产(单果平均重106克)的京早三号桃(中科院植物所培育)等等，这些例子不胜枚举。
快速繁殖：应用组织培养技术可使某一个优良品种得到快速繁殖，可在一年内从一个芽或一张叶片，培养与繁殖成几十万或上百万株小苗，使得该优良品种很快得以推广。
如浙江省金华婺东葡萄良品场，1990年将日本引进的葡萄品种栽培成功后，我们通过快速繁殖，使每月的增殖系数达到6～9，可使一个芽在一年之内产生100万个芽。
快繁技术在花卉、果树等经济植物的优良品种繁育中，取得了良好的经济效益。
名、特、优、稀植物品种的保存与繁殖：许多名贵植物(如兰花)由于繁殖慢或困难，数量不多;而众多的野生植物(如花卉、药材)由于人们过度的采伐，变成濒危植物。
这些品种的保存与繁殖越来越显得重要与紧迫。
应用组织培养技术，不仅可以在实验室条件下保存种质，还可以进行工业化生产，大量繁殖来满足人类生活的需求。
无土栽培：现代正在快速推广的无土栽培技术，就是建立在组织培养的基础理论之上的，特别是无土栽培中的营养液成分，与组织培养的培养基配制基本相似。
【安徽】中职农业生物技术(主编曹春英、丁雪珍第二版 高教版)教案：第二章 植物组织培养技术04
第三节植物组织培养操作技术（2）一、授课章节第三节植物组织培养操作技术（2）。
二、学时安排2学时。
三、教学目标1．掌握培养基的作用。
2．掌握培养基中生长调控物质的作用。
3．了解培养基的类型。
四、教学重点、难点分析重点：培养基的基本成分。
难点：培养基中生长调节物质的作用。
五、教具电化教学设备。
六、教学方法讲授法，演示法。
七、教学过程Ⅰ.导入培养基是进行植物组织培养的基质，进行植物组织培养必须掌握培养基的基本知识，今天我们就学习培养基的种类和基本成分。
II.新课三、培养基制备技术（一）配制培养基的目的配制培养基的目的是人为提供离体培养材料的营养源。
配制的不同培养基，是为满足不同类型植物材料对营养的不同需要。
没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一种合适的培养基，培养才有可能成功。
（二）培养基的种类1.培养基的种类划分2.常用培养基的配方和特点 目前已公开报道的基本培养基有许多种类，各有不同的特点和适用范围，在植物组织培养生产中应根据不同的植物种类和培养部位及不同的培养目的选用不同的培养基。
常用的培养基配方：表1 常用培养基配方只含有无机盐、蔗糖、维生素和水等最基本成分的合继代培养中促进培养物快速增殖的培养基，也称扩繁培养基。
培养基主要有水、无机盐、有机物、植物生长调节物质、培养基的支持材料五大类组成。
1.水水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。
它是生命活动过程中不可缺少的物质。
配制培养基母液时要用蒸馏水，以确保母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质，大规模生产时可用自来水。
但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。
2.无机元素(1)大量元素指浓度大于0.5 mmol／L的元素，有N，P，K，Ca，Mg，S等。
常由KN03、NH4NO3、KH2P04、NaH2P04、KCl、MgS04·7H20、CaCl2·2H20等化合物来提供。
植物组织培养技术手册
植物组织培养技术手册金陵中学河西分校瞿大枞第一部分植物组织培养理论简介实验原理植物组织培养是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化并形成完整植株的过程。
其理论依据是植物细胞具有全能性。
组织培养的特点取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制。
应用领域1、快速繁殖2、种苗脱毒3、远缘杂交8、植物性药物和生物制品的生产7、基因工程6、种质保存4、突变育种5、单倍体育种胚状体发生途径外植体脱分化愈伤组织胚状体再生植株再分化器官发生途径外植体愈伤组织芽根再生植株脱分化再分化高生长素(1,2-D)高(生长素/细胞分裂素)低(生长素/细胞分裂素)胡萝卜离体根培养条件光照强度：1000lx ——1500lx黑暗条件：利于细胞、愈伤组织的诱导增殖光照条件：利于器官的分化光周期：常用的周期是16h 的光照8h 的黑暗温度：25℃湿度pH器材和药品高压灭菌锅超净工作台光照培养架1. 大型仪器和器材1.超净工作台：用于培养物的无菌操作（由鼓风机、滤板、操作台、紫外灯和照明灯组成）。
2. 高压灭菌锅：用于进行培养基和器械用具的灭菌。
小规模实验室可选用小型手提式高压灭菌锅。
3.光照培养架：用于植物材料的培养，其内有温度感受器，控制箱内温度到所调指标。
生化培养箱还配有光照装置。
4.电子分析天平：电子分析天平，用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品精确度为0.0001g1.镊子类常应用医疗上的镊子。
根据操作需要有各种类型2.剪刀类可采用医疗五官科用的中型剪刀。
主要用于切断茎段、叶片等。
也可以用弯形剪刀，由于其头部弯曲，可以深入到瓶口中进行剪切。
3.解剖刀切割较小材料和分离茎尖分生组织时，可用解剖刀。
刀片要经常调换，使之保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。
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第二章(2)植物组织培养操作技术
1 灭菌
用物理或化学方法，杀死物体表面和孔隙内一切微生物或生物体，即所有生命的物质全部杀死。
2 灭菌方法
2.1培养基灭菌
一般高压湿热灭菌，某些激素、维生素采用过滤灭菌。
2.2玻璃器皿灭菌
干热灭菌：160～180℃,1.5～2.0h；湿热灭菌：121℃, 20～40min。
接种前用酒精棉球擦试，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。
2.3接种工具灭菌
用前干热灭菌：160～180℃,1.5～2.0h；用前湿热灭菌：121℃, 20～30min。
接种前用酒精棉球擦试，浸入95%酒精液中，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。
2.4实验服、口罩、滤纸灭菌
湿热灭菌：121℃,20～30min。
实验服灭菌后置于缓冲间或密封好。
2.5接种室灭菌
紫外灯照射(接种室、超净台、接种箱)：波长260nm，距离小于1.2m，20～30min。
臭氧灭菌机：1～2h；
熏蒸灭菌：5～8ml/m3甲醛+5g/ m3高锰酸钾；冰醋酸；1～3%高锰酸钾或3%来苏儿。
接种台喷雾消毒：75%酒精。
2.6接种材料灭菌
灭菌步骤：
①流水冲洗或洗衣粉漂洗
②用化学灭菌剂浸润灭菌，最好加吐温-80等表面活性剂(灭菌液的0.5%)，一般70%酒
精30S，0.1～1%升汞5～8 min。
③无菌水冲洗3～5次。
2.7物体表面灭菌
2.7.1灭菌方式：喷雾、涂抹杀菌
2.7.2范围：桌面、墙面、双手、材料表面
2.7.3消毒剂：70%酒精；1～2%来苏水；0.25～1%新洁尔灭；洗衣粉；吐温-80
2.8培养室灭菌
新建培养室用前一定要彻底熏蒸1次。
隔2～5天用洗衣粉水或来苏水拖地1次，用高锰酸钾擦架1次。
3无菌操作
3.1作好接种前准备
3.1.1接种室的灭菌
3.1.2超净工作台的灭菌
3.1.2.1 开风机前将紫外灯打开30min以上
3.1.2.2 之后开风机15min
3.1.2.3 用95%酒精洗工作台面
3.1.3接种器皿、用具的灭菌
用具先用95%酒精浸泡，后于酒精灯外焰灼烧。
3.1.4工作人员接种前应做的准备工作
3.1.5材料的灭菌
3.2 一个典型的灭菌流程
材料的预处理(剪切、清洗)→75%酒精(20s)→0.1%升汞(15min)→无菌水冲洗→沥干
→接种
4 培养
4.1 培养含义
将植物材料置于培养室，提供光照、温度条件，使之生长，分裂分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。
4.2 培养方法
4.2.1固体培养
养分分布不均，生长速度不均，常有褐化、中毒发生。
4.2.2液体培养
养分分布均一，生长速度均一，振荡培养能保证氧气供应。
4.3 培养步骤
4.3.1初代培养
目的：获得无菌材料和无性繁殖系。
培养基：诱导或分化培养基。
培养基中CTK多，IAA少。
类型(根据发育方向）：丛生芽的发育；不定芽的发育；胚状体的发育；原球茎的发育。
4.3.2继代培养
目的：扩繁无根苗，最后达到边繁殖边生根。
扩繁方法：以几何级数增加，可切割茎段、分离芽丛、胚状体、原球茎。
培养基：基本培养基或分化培养基。
4.3.3 生根培养
4.3.3.1 对易生根植物，将嫩枝在基质中直接生根
4.3.3.2 在生根培养基中培养
4.4 外植体成苗途径
5 移栽
5.1培养瓶壮苗
加入生长控制剂，如多效唑，B9，CCC，其作用是使苗粗壮，叶绿素增加。
5.2炼苗
将瓶盖打开，打破无菌环境，湿度逐渐下降，光照逐渐加强，使之形成新的功能强的根和叶片。
一般炼苗时间为10～30d。
5.3 移栽时应注意的问题
5.3.1防止菌类滋生
①苗底部培养基要洗干净
②杀菌剂处理苗的根部
③定时用杀菌剂处理种植基质
常用杀菌剂：KMnO4,百菌清、多菌灵、托不津，使用浓度0.1％
5.3.2保持小苗水分供给平衡
5.3.3移栽时选择合理的种植基质
基质要疏松透气，有适宜的保水性，易于灭菌处理，不利于杂菌滋生。
常用珍珠岩、椰糠、蛭石、细沙和泥炭。
5.3.4注意一定光照，温度条件
一般强度较高的慢射光较好
6 试管苗增殖率的估算
Y=X N
Y:年增殖率；x:每周期增殖倍数；N：全年增殖周期数N=365/每周期天数。
7组培快繁计划安排
7.1要确定（或限制）增殖瓶数；
7.2考虑每天增殖与生根的比例；
7.3快速繁殖由提高增殖倍数、缩短增殖周期，周年生产三因素决定；
7.4实行有效的管理办法，达到人力物力的协调，从而提高生产效率。
本节小结：
这一节课，我们主要学习了关于植物组培有关操作技术，我们要掌握有关操作技术，为实际的操作奠定良好的基础。
思考题：
1 简述实验室灭菌技术。
2 如何进行试管苗的移栽？。