蛋白质氨基酸测定

注意问题：
① 加入样品不要沾附在凯氏烧瓶瓶颈；
② 消化开始时不要用强火，要控制好热源，并 注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将 附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全； ③ 样品中若含脂肪或糖较多，在消化前应加入 少量辛醇或液体石蜡或硅油作消泡剂，以防消 化过程中产生大量泡沫； ④ 消化完全后要冷至室温才能稀释或定容。所 用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。
思考：
1、样品中加入浓硫酸后，溶液的颜色立即发生什么 变化？ 2、如何判断消化的终点？
② 蒸馏与吸收：
按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生
瓶内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及 硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃 珠。 在吸收瓶中加入10mL 40g/L硼酸及2滴混合指示 剂，将冷凝管下端插入液面以下。 准确吸取消化液10mL于反应管内，经漏斗再加 入10mL氢氧化钠溶液，用少量蒸馏水冲洗漏斗， 夹好漏斗夹并水封，加热煮沸水蒸气发生瓶内 的水进行蒸馏。 指示剂变绿色后继续蒸馏10 min，将冷凝管尖 端提离液面继续蒸1min
（4）蛋白质系数
不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种 不同的蛋白质其含氮量也不同，蛋白质的量与氮含量 的关系用蛋白质系数表示： 蛋白质系数——每份氮素相当于的蛋白质的份数。一般 蛋白质含氮为16%，所以1份氮素相当于6.25份蛋白质。 此数值（6.25）称为蛋白质系数，用F表示。不同种类 食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆， 鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其 制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。
加入硫酸铜的作用
催化作用：加速有机物的氧化分解 C＋ 2CuSO4 → Cu2SO4 ＋ SO2↑＋ CO2↑ Cu2SO4 ＋ 2H2SO4 → 2CuSO4 ＋ 2H2O ＋ SO2↑ 此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫 酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。 消化完全指示：蓝绿色；
三聚氰胺的分子式是C3H6N6，即氮含量为
2/3，按GB/T 5009.5-2003，食品中蛋白
质的测定（凯氏定氮法），乳制品的蛋白
氮换算系数为6.38，即1％的蛋白氮含量，
折算蛋白质含量为6.38％，这样加入3％
三聚氰胺就蛋白含量“达标”了。
（5）蛋白质主要测定方法有：
双缩脲法 染料结合法 酚试剂法 紫外分光光度法 水杨酸比色法 折光法 旋光法
蒸馏、吸收注意问题：
（1）整套装置不能漏气，要注意各蒸汽控制夹 子的操作，以防蒸汽受阻爆炸或吸收液倒吸。
（2）在蒸汽发生瓶中要加入硫酸和甲基橙使呈 酸性以防氨蒸出。
（3）加碱量要足，应使消化液呈深蓝色或产生 黑色沉淀。操作要迅速，漏斗要采用水封防氨 逸出。
（4）冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能
近红外光谱法
目前蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法
凯氏定氮法
是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白
质系数而求出蛋白质的含量
此法的结果称为粗蛋白质含量：由于样品中含有
少量非蛋白质含氮化合物，如核酸、生物碱、含 氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化 合物
凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作
较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食 品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定 多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典 分析方法，至今仍 被作为标准检验方法。 凯氏定氮法：常量法、微量法及改良凯氏定氮 法

凯氏定氮法的 原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋 白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸 出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫 酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后 再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗 量可计算出蛋白质的含量。 包括消化、蒸馏、吸收、滴定四个步骤。
(2) 食品中的蛋白质含量及测定意义
在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说来动
物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，例如牛肉中蛋白 质含量为20.0%左右，猪肉中为9.5%，兔肉为21%，鸡肉为 20%，牛乳为3.5%，黄鱼为17.0%，带鱼为18.0%，大豆为 40%，稻米为8.5%，面粉为9.9%，菠菜为2.4%，黄瓜为 1.0%，桃为0.8%，柑橘为0.9%，苹果为0.4%和油菜为1.5% 左右。 测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合 理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指 导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。
（6）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶 液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。
③ 滴定 将接受瓶内的硼酸液用0.01mol/L盐酸标准溶液滴定 至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化 开始操作完全相同）。
(4) 结果计算
c(V2 V1 ) 0.014 F W 100 10 m 100
（3）蛋白质的性质
蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大，大部分高
达数万~数百万。
从组成上看：化学元素C、H、O 、N（P、S、Cu、Fe）；
它们由20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，
官能基团：肽键、氨基酸残基、酸碱基团、芳香基团
结论：含氮是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。
化学性质
三聚氰胺呈弱碱性（pKa=8），可与多种
酸反应生成三聚氰胺盐。遇强酸或强碱水
溶液水解，胺基逐步被羟基取代，先生成 三聚氰酸二酰胺，进一步水解生成三聚氰 酸一酰胺，最后生成三聚氰酸。
毒性：
以前三聚氰胺被认为毒性轻微，大鼠口服的半数致 死量大于3克/公斤体重。据1945年的一个实验报道： 将大剂量的三聚氰胺饲喂给大鼠、兔和狗后没有观 察到明显的中毒现象。动物长期摄入三聚氰胺会造 成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可 进一步诱发膀胱癌。
量测定 仪器、试剂: 500mL凯氏烧瓶、凯氏定氮装置 消化用：① 浓硫酸 ② 硫酸钾 ③ 硫酸铜 蒸馏用：④ 40%氢氧化钠溶液 吸收用：⑤ 4%硼酸 滴定用： ⑥ HCl标准溶液 ⑦ 0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%溴甲酚绿乙醇 溶液混合指示剂
微量凯氏定氮法操作步骤
样品消化 → 蒸馏→ 吸收→ 滴定 ①样品消化 : 准确称取一定量的样品至干燥洁净的 500mL凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.5g（1g）、硫酸钾10g （3g)和浓硫酸20mL、玻璃珠数粒→轻轻摇匀，以45º斜 支于石棉网上→用电炉以小火加热(或先烧瓶放在距电 炉较远处)，待内容物全部炭化、泡沫停止产生后→加 大火力(或将烧瓶放在电炉上)，保持瓶内液体微沸→至 液体变蓝绿色透明后→继续加热微沸30min→关闭电炉， 取下烧瓶、冷却→转移至100mL容量瓶中，加水定容。
三鹿奶粉相关荣誉
中国名牌产品，中国驰名商标，国家免检
产品，绿色食品，中国食品工业百强，农
业产业化国家重点龙头企业，中国最具价 值的品牌，国家第一批卫生安全食品 。
石家庄三鹿集团股份有限公司2008年9月 11日晚则发布产品召回声明称，经公司自 检发现2008年8月6日前出厂的部分批次三 鹿婴幼儿奶粉受到三聚氰胺的污染，市场上 大约有700吨。
① 样品消化：
2 NH2-(CH2)2-COOH + 13H2SO4→(NH4)2 SO4+6CO2+ 12SO2 + 16H2O 浓硫酸的作用： 脱水作用—使有机物脱水并碳化为C、H、N 氧化作用—将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳， 硫酸则被还原成二氧化硫 2H2SO4 ＋C ＝2SO2＋ 2H2O ＋CO2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化 硫，氨与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。
蛋白质和氨基酸的测定
概述
凯氏定氮法 蛋白质的快速测定法 氨基酸总量的测定 氨基酸的分离与测定
概述
（1）蛋白质的生理功能及在食品中的作用 （2）食品中的蛋白质含量
（3）蛋白质系数
（4）蛋白质测定方法
概述
（1）蛋白质的生理功能及在食品中的作用 ① 蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的 重要成分，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。 ② 人体的酸碱平衡、水平衡的维持； ③ 遗传信息的传递； ④ 物质的代谢及运转都与蛋白质有关。 ⑤ 人及动物只能从食品得到蛋白质及其分解产物来构成 自身的蛋白质，是人体重要的营养物质 ⑥ 食品的重要营养指标。
三聚氰胺的最大的特点是含氮量很高（66 ％），加之其生产工艺简单、成本很低， 给了掺假、造假者极大地利益驱动，有人 估算在植物蛋白粉和饲料中使蛋白质增加 一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实 蛋白原料的1/5。所以“增加”产品的表观 蛋白质含量是添加三聚氰胺的主要原因， 三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什 么气味和味道，掺杂后不易被发现等也成 了掺假、造假者心存侥幸的辅助原因。
2007年中国徐州一家出口美国猫狗食物的 企业在宠物食品中添加三聚氰胺来冒充蛋 白质导致中美关系轩然大波 。 宠物食品污染事件的初步调查结果认为：掺 杂了≤6.6%三聚氰胺的小麦蛋白粉是宠物 食品导致中毒的原因，为上述毒性轻微的 结论画上了问号。 导致美国大量宠物死亡，被FDA彻底封杀钾的作用是：提高溶液沸点而加快
有机物的分解（3380C
4000C）
K2SO4+H2SO4=2KHSO4
2KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3 但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度 过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而 造成损失： （NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O 除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来 提高沸点，但效果不如硫酸钾。
式中 W—蛋白质的质量分数，%； c—盐酸标准溶液的浓度，mol/L； V1—空白滴定消耗标准液量，mL； V2—试剂滴定消耗标准液量，mL； m—样品质量，g； 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； F—蛋白质系数。