DNA甲基化检测专题 枫树海树枝
甲基化检测方法(亚硫酸氢盐修饰后测序法)
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）第一部分基因组DNA的提取。
这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。
DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。
因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。
否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。
两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。
第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；3：42℃水浴30min；水浴期间配制：4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。
这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。
PH一定要准确为5.0。
加520ul至上述水浴后溶液中。
6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。
8：50℃避光水浴16h。
一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am 以后收，时间上很合适。
DNA甲基化
（2）吸出孔内保存液，用去离子水清
洗三次，依顺序分别加入marker和 ladder （3）将芯片放入 LabChip GX/GX II
注意事项
（1）所有空不能长时间处于干燥状态 （2）孔4内marker要及时补充 （3）marke可以回收再利用 （4）仪器提前开机30min预热（先开 仪器在开电脑）
原理：
利用对DNA甲基化敏感性不同的同裂酶分别切割DNA，产生不同的酶切产
物，同时将酶切产物添加接头，然后进行PCR扩增、PAGE电泳、银染，产
生可见的具有不同酶切型式的谱带，即可得知DNA甲基化信息。
甲基化状态分析：
在不同泳道相对应的位置上，如果Msp I酶切产物有扩增带、而Hpa II酶切
产物没有扩增带的，说明此处的序列是CCmGG；若都有扩增带，说明此 处是CCGG。还可以进一步对差异条带进行切胶回收、克隆、测序，以便
7. 电泳（ 1500—2000V、55W ，2-3h）
8. 银染（固定-染色-水洗-显色-冲洗）
注意事项：
1. 灌胶要匀速，防止焦内气泡产生，可以先慢
后快不可以先快后慢
2. 预电泳前先将点样孔标记，再注入缓冲液
（下部盒内缓冲液有一半）
3. 预电泳结束后，要将点样孔内的沉淀吹出
4. 染色10min,不要过久；水冲洗不要超过10S
（4）点击 Start 按钮开始实验
注意事项：
如果更换新的芯片时，需要选择一下PCR板的规格（板高 不能超
过16mm，否则针会断掉）
图1-2 大分子分析仪电泳图 0-3为样品名；H: EcoRI/HpaII酶切扩增产物，M: EcoRI/MspI酶切扩增产物
谢谢！
得知发生甲基化变化的胞嘧啶的具体位置。
动植物中DNA甲基化的研究进展
动植物中DNA甲基化的研究进展1. 引言1.1 研究背景DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰方式，通过将甲基基团添加到DNA分子上，影响基因的表达情况。
近年来，越来越多的研究表明动植物中DNA甲基化在生物体的生长发育、适应环境、基因表达调控等方面起着重要作用。
动植物中的DNA甲基化有着一些差异，这些差异可能与它们的生物学特性和进化历史有关。
正因为如此，研究动植物中DNA甲基化的差异及其对基因表达的影响，对于深入理解生物体的遗传调控机制具有重要意义。
本文将从基本概念、差异、与基因表达调控的关系、在进化和疾病中的作用等方面系统探讨动植物中DNA甲基化的研究进展，以期为未来相关研究提供启示和指导。
1.2 研究意义DNA甲基化是一种重要的表观遗传调控机制，已被广泛研究并应用于不同生物体中。
动植物中的DNA甲基化具有重要的生物学功能，探究其意义对于理解生物进化、发育和疾病发生发展具有重要意义。
动植物中DNA甲基化的差异性研究可以帮助我们了解不同生物体中基因表达调控的机制。
通过比较不同物种的DNA甲基化图谱，我们可以揭示动植物在进化过程中如何通过DNA甲基化来调节基因表达，从而适应不同的环境和生存压力。
DNA甲基化与基因表达调控的关系研究有助于揭示DNA甲基化在调控基因表达、细胞命运和器官发育中的作用。
了解DNA甲基化在细胞分化和器官形成中的调控机制，有助于我们深入理解动植物的生长发育过程。
DNA甲基化在动植物中的作用与疾病发生发展密切相关。
研究表明DNA甲基化异常与多种疾病如肿瘤、神经退行性疾病等密切相关，因此深入探究DNA甲基化在疾病发生发展中的作用，对于疾病的防治具有重要意义。
通过对DNA甲基化的研究，我们可以更好地了解疾病的发生机制，为疾病的预防和治疗提供新的思路和方法。
2. 正文2.1 DNA甲基化的基本概念DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰，是指在DNA分子上加上甲基基团的化学反应。
这种修饰主要发生在CpG二核苷酸上，即在DNA中的Cytosine和Guanine相连的核苷酸对位置上。
DNA甲基化
（2）采用特异性PCR检测：是利用甲基化特异引物和非甲基化 2 采用特异性PCR检测
特异引物来分析基因启动子区引物对应的几个CG二核苷酸甲基化状况， 有时需要设计多对引物，PCR条件必须严格控制以避免假阳性结合。
• 这两种方法一般给出定性结果，不能定量 这两种方法一般给出定性结果，
2、亚硫酸盐测序
它是检测甲基化的“金标准”，但需要大量的克隆测序，过程较为 繁琐、昂贵。
植物DNA的甲基化及其生物学功能 植物DNA的甲基化及其生物学功能 DNA DNA甲基化含义 一、DNA甲基化含义 DNA甲基化相关机制 二、DNA甲基化相关机制 DNA甲基化的功能 三、DNA甲基化的功能 四、甲基化检测技术 五、结论与展望
结论与展望
• DNA甲基化在基因表达调控中扮演着重 要角色．虽然DNA甲基化是各种表观遗 传学现象中最早被人们认识也是研究相 对较成熟的现象之一，但是目前对于 DNA甲基化的机理机制的探索还仍然处 于比较初级的阶段．一些问题有待进一 步验证。
3、DNA去甲基化 去甲基化
DNA去甲基化是一种重要的DNA功能调节机 制，通常分为2种类型位点特异性去甲基化 位点特异性去甲基化 和总基因组的去甲基化 总基因组的去甲基化。 总基因组的去甲基化 • 两者在胚胎发育过程中有着重要的作用，保证 在特定细胞中只有需要的基因才处于活性状态 引。 • DNA去甲基化的机制分为被动去甲基化 主 被动去甲基化和主 被动去甲基化 动去甲基化两种。被动去甲基化过程与DNA半 动去甲基化 保留复制有关，而主动去甲基化过程需要“去 甲基化酶”的参与。
3 DNA甲基化引起的植物 转基因沉默
• 转基因沉默 转基因沉默(tmsgene silencing) ：
又称转基因失活 转基因失活，即当向生物体内导人外源基因时， 转基因失活 引起目的基因及其相应序列的同源内源基因的表达被 特异性抑制的一种基因调控现象。
动植物中DNA甲基化的研究进展
动植物中DNA甲基化的研究进展DNA甲基化指通过在DNA上甲基化修饰作用于甲基转移酶，使得基因表达得以控制的一种遗传信息的传递方式。
DNA甲基化在生物体内起着非常重要的生物学功能，是生理学和病理学研究的重要领域之一。
本文将探讨动植物中DNA甲基化的研究进展。
一、植物中DNA甲基化的研究进展在植物共同进化过程中，植物维持了一种基础型的DNA甲基化水平。
DNA甲基化具有调节基因组转录的功能。
研究表明，在植物中，DNA甲基化的一些重要基因位点DNA甲基化状态受到环境因素的影响。
目前，植物中DNA甲基化的研究主要集中在以下几个方面：1、DNA甲基化修饰相关基因的鉴定植物生长发育和环境适应过程中，DNA甲基化关键酶和蛋白质参与其中。
这些基因在植物生长发育与环境适应中起着重要作用。
研究发现，许多DNA甲基化酶在植物中都有表达，如MET1、CMT3、DRM2、DME、ROS1等。
这些酶在不同的组织和器官中具有不同的表达模式。
目前，界定和测定DNA甲基化的研究方法主要有：甲基化敏感限制酶切割（MspI、HpaII等）、甲基化特异性PCR扩增、甲基化特异性荧光探针、高通量测序等。
这些方法可以通过比较甲基化和非甲基化DNA保守区域的序列差异，来确定DNA甲基化的位点、密度和模式。
此外，还可以利用质谱法和芯片技术等方法测定DNA甲基化。
3、DNA甲基化在植物生长发育和环境适应中的功能和调控机制DNA甲基化在植物生长发育和环境适应中起着重要作用。
因此，研究DNA甲基化在植物中的功能和调控机制对于揭示植物基因调控网络具有十分重要的意义。
目前，研究表明，DNA甲基化和丝氨酸/苯丙氨酸降解途径、光叶黄素合成途径等信号通路紧密相关。
二、动物中DNA甲基化的研究进展在动物体内，DNA甲基化是重要的表观遗传修饰方式之一，它参与了基因表达的调控及布置染色质。
DNA甲基化主要集中于CpG二核苷酸对上的C上进行甲基化修饰。
DNA甲基化在脊椎动物中呈现出非常特异性的富集分布模式。
DNA甲基化检测技术全攻略
DNA甲基化检测技术全攻略DNA甲基化是指DNA分子上的甲基基团与DNA碱基结合，从而调节基因的转录活性。
甲基化的变化在许多疾病和发育过程中起着重要作用。
因此，DNA甲基化检测技术成为了研究和诊断领域中的关键工具之一、本文将介绍DNA甲基化检测技术的全攻略，包括常用的方法和关键步骤。
一、DNA甲基化检测技术的基本原理全基因组的甲基化检测通常使用甲基化敏感的限制酶来区分甲基化和非甲基化的DNA。
通过将DNA与限制酶一起处理，只有非甲基化的DNA会被酶切割。
然后可以使用聚合酶链反应（PCR）或基因芯片等方法来扩增和检测特定的DNA片段。
位点特异性的甲基化检测主要通过甲基化特异性的PCR或测序方法来实现。
首先需要设计特异性的引物，这些引物能够在甲基化和非甲基化的DNA片段上扩增。
接着，通过PCR扩增或测序分析来确定甲基化位点的状态。
二、DNA甲基化检测技术的常用方法1.甲基化敏感的限制酶消化法：通过将DNA与甲基化敏感的限制酶一起处理，只有非甲基化的DNA会被酶切割。
然后可以使用PCR或基因芯片等方法来扩增和检测特定的DNA片段。
2.甲基化特异性的PCR：通过设计甲基化特异性的引物，来扩增甲基化和非甲基化的DNA片段。
这种方法可以用于位点特异性的甲基化检测。
3.甲基化特异性的测序方法：通过测序分析来确定DNA片段上的甲基化状态。
这种方法可以用于全基因组的甲基化检测。
三、DNA甲基化检测技术的关键步骤1.样本的准备：样本可以是基因组DNA或特定的DNA片段。
对于全基因组的甲基化检测，需要提取和纯化高质量的基因组DNA。
对于位点特异性的甲基化检测，可能需要对DNA进行限制酶切割或甲基化特异性的PCR 前处理。
2.甲基化敏感的限制酶消化或甲基化特异性的PCR：根据实验设计，选择合适的方法来检测甲基化状态。
对于甲基化敏感的限制酶消化法，将DNA和甲基化敏感的限制酶一起处理，然后使用PCR或基因芯片等检测方法来扩增和检测特定的DNA片段。
DNA甲基化测序文库及制备方法和DNA甲基化检测方法
专利名称：DNA甲基化测序文库及制备方法和DNA甲基化检测方法
专利类型：发明专利
发明人：陈澍宜
申请号：CN202111398632.4
申请日：20211124
公开号：CN113969307A
公开日：
20220125
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本申请公开了一种DNA甲基化测序文库及制备方法和DNA甲基化检测方法。
本申请在建立测序文库时采用全甲基化的dNTP对双链DNA进行末端修复，然后利用酶转化和PCR扩增来建立DNA甲基化测序文库，因此，本申请能够避免仅采用未甲基化的dNTP进行末端修复时所带来的测序数据冗余现象。
另外，末端修复后所引入的甲基化水平很容易从甲基化检测结果中进行剔除，故本申请虽然进行了末端修复，但是最终不会产生由于末端修复而导致的甲基化信息干扰，从而不会造成甲基化水平失真现象。
申请人：竹石生物科技(苏州)有限公司
地址：215000 江苏省苏州市中国(江苏)自由贸易试验区苏州片区苏州工业园区星湖街328号创意产业园4-B502
国籍：CN
代理机构：深圳紫藤知识产权代理有限公司
代理人：孔翰
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如何利用生物大数据技术进行DNA甲基化分析
如何利用生物大数据技术进行DNA甲基化分析DNA甲基化是指在DNA分子中加上甲基基团的化学修饰过程。
这种修饰可以影响基因的表达，从而对细胞的功能和发育产生重要影响。
随着生物大数据技术的快速发展，现在我们可以利用这一技术来进行DNA甲基化分析，从而深入了解基因的调控机制和相关疾病的发生机制。
首先，进行DNA甲基化分析的第一步是采集样本并提取DNA。
常见的样本可包括血液、组织、细胞等。
提取DNA可以使用基础的分子生物学方法，如蛋白酶K消化法、盐法、有机溶剂提取法等。
提取的DNA要经过质量和纯度检测，确保后续分析的准确性。
接下来，可以利用生物大数据技术进行DNA甲基化分析的方法有很多，其中常用的方法包括甲基化敏感限制酶切分析、甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）以及甲基化特异性测序技术。
甲基化敏感限制酶切分析是一种简单直接的方法，它利用甲基化敏感的限制酶来切割DNA，然后通过聚合酶链反应（PCR）扩增和分析切割的DNA片段。
这个方法可以分析特定的DNA区域是否被甲基化。
甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）是一种常用的甲基化分析方法。
它基于PCR技术，使用特异性引物来扩增甲基化和非甲基化的DNA片段，然后通过凝胶电泳可以判断特定位点是否被甲基化。
甲基化特异性测序技术是近年来发展起来的一种高通量测序技术，通过测定DNA的甲基化状态和位点，可以全面分析基因组中的甲基化信息。
这种方法可以提供高分辨率的甲基化信息，对于甲基化的全基因组分析和发现新的甲基化位点非常有用。
除了上述方法外，还有其他一些生物大数据技术可以用于DNA甲基化分析。
例如，利用芯片技术可以同时检测大量甲基化位点，通过生物计算和数据分析可以获得全面、高通量的甲基化数据。
另外，还有一些基于机器学习和人工智能的算法，可以从大规模的DNA甲基化数据中学习和预测甲基化模式和相关基因的功能。
最后，进行DNA甲基化分析后，需要对结果进行生物学解释和功能研究。
通过生物学实验证实甲基化位点的功能，可以深入了解甲基化在基因调控中的作用。
基因甲基化水平检测方法
基因甲基化水平检测方法嘿，咱今儿个就来唠唠基因甲基化水平检测方法。
这可真是个神奇又重要的玩意儿啊！你想想看，基因就像是我们身体里的一本神秘大书，而甲基化呢，就像是给这本书做的一些标记。
检测这些标记，那可太关键啦！就好比你要了解一本书的重点内容，不就得看看那些特殊的标注嘛。
目前呢，常用的检测方法有好几种。
比如说重亚硫酸盐测序法，这就像是一个超级侦探，能非常准确地找出基因甲基化的具体位置和情况。
它就像是一个细心的考古学家，一点点地挖掘出基因里的秘密。
还有甲基化特异性 PCR 法，这可厉害啦！它能快速又灵敏地检测出基因甲基化的存在与否，就好像是一个敏锐的警报器，一旦发现有异常，马上就发出信号。
免疫沉淀法也不错哦！它就像是一个精准的捕捉器，专门抓住那些和甲基化有关的蛋白质，从而了解基因甲基化的情况。
这就好像你要抓鱼，得先找到鱼爱吃的鱼饵一样。
这些检测方法各有各的特点和用处，就像我们生活中的各种工具一样。
你不能说哪个就一定最好，得根据具体的情况来选择合适的。
比如说，有时候你需要非常精确的结果，那可能就会选择重亚硫酸盐测序法；要是你着急要个大概的情况，那甲基化特异性 PCR 法可能就更合适啦。
咱再打个比方，这检测方法就像是医生看病的手段。
医生得根据病人的症状和需求，选择合适的检查方法来诊断病情，对吧？这基因甲基化水平检测方法也是一样的道理呀！而且哦，随着科技的不断进步，检测方法也在不断地更新和完善呢。
说不定哪天又会出现一种更加神奇、更加好用的检测方法。
这多让人期待啊！你说，要是没有这些检测方法，我们对基因的了解不就少了很多吗？那可不行！我们得靠着这些方法，一点点地揭开基因的神秘面纱，更好地了解我们自己的身体。
总之呢，基因甲基化水平检测方法可真是太重要啦！它们就像是打开基因秘密宝库的钥匙，让我们能更好地探索生命的奥秘。
咱可得好好了解了解这些方法，说不定哪天就能派上大用场呢！你说是不是呀？。
酶转化法 dna甲基化测序
酶转化法（Enzymatic Conversion）在DNA甲基化测序中是一种常用的技术，用于将DNA样本中的甲基化胞嘧啶（5-methylcytosine, 5mC）转变为可检测的标记。
这是因为自然状态下的甲基化胞嘧啶在进行测序时很难直接检测到。
通过酶转化法，可以使得甲基化的胞嘧啶转变为一种可以被测序机器识别的标记，从而进行分析。
这个过程通常涉及以下几个步骤：
1. DNA提取：首先从细胞或组织中提取DNA。
2. 酶处理：使用特定的酶（如bisulfite 酶）处理DNA。
这种酶能够将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶（uracil），而甲基化的胞嘧啶则保持不变。
3. PCR扩增：对处理后的DNA进行PCR（聚合酶链反应）扩增，以便进行分析。
4. 测序：扩增后的DNA可以进行高通量测序，此时，甲基化的胞嘧啶会显示出特定的标记，如胞嘧啶转变为尿嘧啶。
5. 数据分析：通过生物信息学工具分析测序数据，确定DNA的甲基化模式。
酶转化法是DNA甲基化研究中的一个关键步骤，它使得研究者能够更好地理解基因表达调控和表观遗传学中的甲基化机制。
这些信息对于研究各种生物学过程，如发育、疾病发生和细胞分化等，都具有重要意义。
甲基化测序原理
甲基化测序原理甲基化测序是一种广泛应用于DNA研究中的技术，用于检测DNA分子上的甲基化修饰。
甲基化是一种常见的DNA修饰形式，可以对基因表达和染色质结构产生重要影响。
通过了解DNA序列的甲基化状态，人们能够更深入地研究生物学过程以及疾病的发生机制。
甲基化测序的原理是基于DNA序列中C（胞嘧啶）碱基的甲基化状态。
在正常情况下，DNA中的C碱基会被一个甲基分子修饰，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。
然而，在一些情况下，这种甲基化修饰可能会发生异常，导致基因沉默或功能改变。
因此，分析DNA分子中的甲基化状态对于理解基因组功能和疾病机制非常重要。
甲基化测序的方法主要分为两种：全基因组甲基化测序和特定位点甲基化测序。
全基因组甲基化测序是指对整个基因组进行甲基化的分析，可以提供全面的甲基化图谱。
特定位点甲基化测序则是选取特定的DNA区域进行检测，可以更加深入地研究某些关键基因或区域的甲基化状态。
甲基化测序的过程首先需要将DNA样本进行处理，包括DNA提取和断裂。
接着，通过特定的化学反应将5-mC转化为甲基化敏感的测序标记物。
然后，使用高通量测序技术对DNA样本进行测序，得到包含甲基化信息的DNA序列。
最后，通过对测序结果进行分析和比对，可以确定DNA序列中每个碱基的甲基化状态。
甲基化测序技术的发展为研究者提供了一个非常有力的工具，可以帮助他们深入了解DNA的甲基化修饰和相关生物学过程。
这种技术在癌症研究、遗传学研究以及表观遗传学研究中具有重要的应用价值。
随着技术的不断进步，甲基化测序将进一步发展，为科学家解开生命奥秘提供更多帮助。
动植物中DNA甲基化的研究进展
动植物中DNA甲基化的研究进展DNA甲基化是指通过酶催化反应将DNA中的脱氧胞嘧啶（cytosine，C）碱基的C5位上加上一个甲基（CH3），从而形成5-甲基脱氧胸腺嘧啶（5-methylcytosine，5mC）的过程。
DNA甲基化在生物体的发育、成熟、老化过程中起着重要的调控作用，并且与多种疾病的发生发展密切相关。
对于动植物中DNA甲基化的研究，为我们深入了解生物体的遗传和表观遗传调控提供了重要的理论基础。
本文将介绍近年来动植物中DNA甲基化研究的主要进展。
动植物中DNA甲基化的检测方法是研究甲基化调控的重要工具。
传统的检测方法包括甲基化敏感限制性内切酶切割和甲基化特异性PCR。
这些方法虽然简单易行，但是存在着准确性低、靶标选择性差等问题。
近年来，随着高通量测序技术的发展，甲基化测序（MeDIP-seq）和全基因组甲基化测序（WGBS）等新方法的出现，对于动植物中DNA甲基化的检测和分析提供了更高的准确性和全局性。
DNA甲基化修饰在动植物中具有重要的调控作用。
许多研究表明，DNA甲基化在植物的发育过程中起着重要的调控作用。
花的发育和营养代谢等多个生物过程中都与DNA甲基化相关。
在动物中，DNA甲基化在胚胎发育、性别决定和细胞分化过程中也起着重要的作用。
DNA甲基化还参与了免疫反应、DNA修复和基因组稳定性的维持等过程。
DNA甲基化修饰与疾病的关系也得到了广泛关注。
研究发现，DNA甲基化与许多疾病的发生和发展密切相关。
DNA甲基化异常与多个肿瘤形成和发展相关。
DNA甲基化的改变还与心血管疾病、神经系统疾病和代谢性疾病等的发生发展密切相关。
在动植物中，DNA甲基化修饰的调控机制非常复杂。
近年来的研究发现了一些调控DNA 甲基化的蛋白和调控因子。
在植物中，DNA甲基转移酶家族（DNA methyltransferase，DNMT）和DNA甲基酶抑制因子家族（DNA demethylase）是DNA甲基化修饰的关键调控因子。
DNA甲基化检测专题 枫树海树枝
根据研究所用处理方法不同，即 DNA 的甲基化修饰（指 CpG 二核昔酸中 胞嘧啶的5 位碳原子加上一个甲基基团，形成5 甲基胞嘧啶）。一般而言，可 以分辨出甲基化修饰的方法有以下几种： 1. 甲基化敏感性内切酶 2. 亚硫酸氢盐的修饰 3. 特异性识别甲基化修饰DNA的抗体或蛋白 4. 质谱或色谱等精密检测手段
CpG岛（CpG Island）
结构基因组中70-90 %的独立CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇
地聚集形成CpG岛。
CpG岛主要位于结构基因的启动子和第一外显子区域，约有60 %以上
基因的启动子含有CpG岛（结构基因启动子的核心序列及转录起始 点）。
CpG岛的功能：通过甲基化与去甲基化，调控下游基因的表达，即基
Uhlmann 等发现不同病理类型及不同恶性程度的神经胶质瘤细胞的 7 种肿瘤标志
基因存在着不同程度的甲基化。因此，甲基化的研究为肿瘤的早期预测、分类、 分级及预后评估提供了新的依据 。
DNA甲基化检测意义
继 人 类 基 因 组 计 划 结 束 后 ， 2003 年 人 类 表 观 基 因 组 协 会 (Human
差异，在扩增过程中会出现 PCR 偏性，则可提高预变性温度 ( 一般应 >95 ℃，
10min)和变性温度( >95℃，1min)，退火温度以60℃做梯度或70℃做降落PCR。
4. 其他
bisulfite conversion之后的DNA跑胶EB染色是看不见的,因为 这时候DNA基本上都是单链了(转化之后两条链不再互补)
Mg2+浓度一般在2.0-2.5mmol/L为宜，过高或过低都不利于扩增。 Taq酶一般选择针对富含GC等复杂二级结构模板的Buffer与酶，一旦使用不要轻
DNA甲基化检测技术
MS-HRM检测方法及步骤
1. 引物设计：
MS-HRM检测方法及步骤
2. DNA样本的准备：
可使用新鲜组织或石蜡组织样本，一般不使用血液样本；
3. 仪器选择（一般可进行HRM分析的仪器均可）：
如LightCycler480 (Roche), RotorGene6000 (Corbett Research), Applied Biosystems 7500 FAST real-time PCR system(Applied Biosystems), LightScanner System and the HR-1 instrument(Idaho Technologies).
DNA甲基化的生物学意义
1、转录抑制
基因启动 子区的甲基化可 影响转录激活因 子和其识别序列 的结合.
DNA甲基化的生物学意义
2、影响基因表达
直接抑制基因表达 或甲基化的 CpG双核苷 酸序列可被甲基结合蛋 白家族 识别,而后者可通 过吸引补充组蛋白去乙 酞化酶 和组蛋白甲基化 转移酶 等组蛋 白修饰蛋 白质来改变染色质的活 性 ,以间接方式影响基因 表达.
MS-HRM检测结果分析
Figure 4. The MS-HRM assay for BNIP3 methylation. Results of the BNIP3-MS-HRM assay for five clinical samples compared to the dilution standards. Samples 1–5 show different methylation levels. The samples have been distributed over three panels to help distinguish the individual samples.
植物甲基化实验报告
一、实验目的本研究旨在探究植物DNA甲基化在基因表达调控中的作用，通过实验分析甲基化水平的变化，探讨其与植物生长发育的关系。
二、实验原理DNA甲基化是表观遗传学中一种重要的调控机制，通过甲基化修饰DNA碱基，影响基因的表达。
本研究主要针对植物DNA甲基化中的胞嘧啶5-甲基化（5-mC）进行实验分析。
三、实验材料与方法1. 实验材料- 植物样品：选取某植物品种的叶片、茎和根部组织。
- 主要试剂：DNase I、DNase I酶抑制剂、DNA提取试剂盒、甲基化特异性PCR试剂盒、引物合成服务等。
2. 实验方法（1）DNA提取- 将植物样品充分研磨，加入DNA提取试剂，按照试剂盒说明书进行DNA提取。
（2）DNA甲基化分析- 采用DNase I酶切法，将DNA中的5-mC位点切割成单链，进行甲基化特异性PCR。
（3）PCR扩增与产物分析- 以甲基化特异性引物进行PCR扩增，产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。
四、实验结果与分析1. DNA提取结果成功提取出植物样品的DNA，A260/A280比值在1.8-2.0之间，表明DNA纯度较高。
2. DNA甲基化分析结果通过琼脂糖凝胶电泳检测，甲基化特异性PCR产物在预期位置出现，表明植物DNA中存在5-mC修饰。
3. 不同组织DNA甲基化水平比较通过比较叶片、茎和根部组织的甲基化水平，发现根部组织甲基化水平最高，其次是茎，叶片最低。
五、讨论本研究结果表明，植物DNA甲基化在基因表达调控中起着重要作用。
根部组织甲基化水平较高，可能与根部在植物生长发育中的重要作用有关。
甲基化修饰可能抑制某些基因的表达，从而调控植物生长发育。
六、结论本研究通过分析植物DNA甲基化水平，揭示了甲基化在植物生长发育中的调控作用。
为进一步研究甲基化修饰与植物基因表达的关系，本研究将开展以下工作：1. 分析不同生长发育阶段植物DNA甲基化水平的变化规律。
2. 筛选甲基化修饰与植物生长发育相关的关键基因。
使用生物大数据技术解析DNA甲基化数据的使用方法
使用生物大数据技术解析DNA甲基化数据的使用方法DNA甲基化是一种重要的生物学修饰方式，它参与了基因表达和细胞命运决定等生物过程。
而随着生物大数据技术的发展，研究人员可以利用这些技术更深入地解析DNA甲基化数据，以揭示生命现象的复杂性和多样性。
本文将介绍DNA甲基化数据的使用方法以及生物大数据技术在该领域的应用。
DNA甲基化是指在DNA分子的CpG位点上加上一个甲基基团，它能够直接影响基因的表达。
研究人员可以通过测序和分析DNA甲基化数据来研究基因组的表观遗传学变化，从而了解生物体在不同发育阶段或疾病状态下的特征。
在使用DNA甲基化数据之前，首先需要了解数据的来源和类型。
DNA甲基化数据通常通过DNA测序得到，可以分为全基因组甲基化测序数据和甲基化芯片数据两种类型。
全基因组甲基化测序数据提供了全基因组范围内的DNA甲基化信息，而甲基化芯片数据则只能检测特定的甲基化位点。
对于全基因组甲基化测序数据，首先需要对测序数据进行质量控制和预处理。
质量控制可以剔除低质量的测序 reads，避免数据中的噪音对后续分析的影响。
预处理包括去除测序引物序列、去除低质量的碱基等步骤。
处理完测序数据后，可以利用生物大数据技术进行数据分析。
其中一个常用的分析方法是甲基化水平的差异分析，可以通过比较不同样本集合中的甲基化位点的差异来找出差异甲基化位点。
这种分析方法可以帮助研究人员找出与生物体发育、疾病等相关的甲基化变化。
此外，也可以利用DNA甲基化数据进行甲基化基因组组装，从而重建甲基化基因组的完整性。
这种方法可以直接获取基因组范围内的甲基化信息，有助于深入研究基因组和表观遗传学的关系。
生物大数据技术在DNA甲基化数据的使用中起到了关键的作用。
通过生物大数据技术，研究人员可以对庞大的DNA甲基化数据进行高效的存储、管理和分析。
例如，利用云计算平台，可以存储和处理大量的DNA甲基化数据，同时提供高性能的分析和可视化工具。
这些技术为研究人员提供了更多的可能性，使得他们能够更准确地解读DNA甲基化数据，并且发现其中的生物学意义。
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这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的表达。脊椎动物基
因的甲基化状态有三种：持续的低甲基化状态，如管家基因；去甲基化状态，如
发育阶段中的一些基因；高度甲基化状态，如女性的一条失活的X染色体。
DNA甲基化基本概念
DNA甲基化是唯一发生在哺乳动物细胞内DNA合成后的修饰作用，是调节基因表
附：DNA甲基化引物设计步骤
引物设计
——获取启动子区域序列
1）/
2）/index.html?redirect=no
附：DNA甲基化引物设计步骤
引物设计
——设计引物
1）
2）/cgibin/methprimer/methprimer.cgi
甲基化PCR中未甲基化引物序列中正向引物不含鸟嘌呤碱基（G），反向引物
不含胞嘧啶碱基（C）且引物设计尽可能满足普通PCR引物设计的原则 MSP 所遇到的困难是，要扩增的是启动子或部分第一外显子序列，其CG含量相对较 高，MSP 扩增难度加大，因此设计好的引物最好用引物软件如 Primer5.0 从理论上推
出片段，则说明检测位点存在甲基化；
若用引物U扩增出片段，则说明被检测 的位点不存在甲基化。 1. 检测灵敏度高，样品消耗少，仅需 1μg的基因组DNA； 2. 快速、简单，省时；
2. 灵敏度高，可以用于分析少于100个
细胞的检测样品。用微量的基因组 DNA进行分析就能得到各个 DNA 分 子精确的甲基化位点分布图。
DNA甲基化检测方法
随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不
同类型研究的要求。甲基化检测方法分为两类，甲基化分型 (methylation typing )
甲基化图谱( methylation profiling)，后者又被称为甲基化组学( methylome)。这些 方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化 的检测和新甲基化位点的寻找。
生的由甲基化状态决定的序列改变。
关键: MSP中设计两对引物，即一对结 合处理后的甲基化DNA链(M)，另一对 结合处理后的非甲基化DNA链(U)。检 测MSP扩增产物，如果用引物M能扩增
的DNA序列设计特异性引物并进行 PCR。
PCR 产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点 被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶 位点保持不变。 1. 特异性高，能够提供高特异性的分 析结果，这是所有其他研究甲基化 的分析方法所不能比拟的；
附：DNA甲基化引物设计步骤
提取DNA
DNA甲基化
检测与测序分析
凝胶电泳检测 测序分析
差异，在扩增过程中会出现 PCR 偏性，则可提高预变性温度 ( 一般应 >95 ℃，
10min)和变性温度( >95℃，1min)，退火温度以60℃做梯度或70℃做降落PCR。
4. 其他
bisulfite conversion之后的DNA跑胶EB染色是看不见的,因为 这时候DNA基本上都是单链了(转化之后两条链不再互补)
BSP: 亚硫酸氢钠的浓度最好控制在 3.0-3.9 mol/L。 PCR产物最好不要超过300bp 否则比较难
修饰时间控制在 10-16h ，修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化为尿嘧啶 BSP对酶的要求比较高，最好选用 hotstart的酶
且 DNA模板破坏加剧；时间过短会导致修饰不彻底。从而可能出现 PCR 只能扩 Touch down PCR对BSP很好用(对所有有false priming问题的PCR 出U，M出不来。 应该都有用), 一般从Tm高几度开始,到低5度结束, 效果很好 反应温度应控制在50～55℃(若用国产恒温水浴箱建议温度设定在53℃为好)； BSP: 对于GC%高, CpG很多(200~2000bp), 可把bisulfite浓度和incubation time都 ，以保证修饰完全。 加大, 就出来了，然后再用kit的试剂, 多run两个变性-转化的循环, 结果也不错
因表达的调控开关。
DNA甲基化生物学作用
DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功
能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的
研究热点之一。 1. DNA甲基化与遗传印记、胚胎发育
研究表明胚胎的正常发育得益于基因组DNA适当的甲基化。例如：缺少任何 一种甲基转移酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的（ Li 等 1992 年和 Okano 等 1999 年）。此外，等位基因的抑制(allelic repression)被印记控制区(imprinting control regions, ICRs)所调控,该区域在双亲中的一个等位基因是甲基化的。
硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应，在真核
生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。
DNA甲基化主要形成5-Mc和 少量的N6-甲基腺嘌呤（N6-m A）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）
原核生物中CCA/TGG和GATC常 被甲基化，而真核生物中甲基化
仅发生于胞嘧啶。
DNA甲基化PCR影响因素
甲基化PCR扩增中存在许多因素可导致其扩增失败。调研分析发现引物设计的
是否合理决定了甲基化PCR扩增的成败与否，而样本的处理好坏与反应温度的选
择决定着甲基化 PCR扩增产物的产量与纯度。总之，其影响因素归纳总结主要有 以下几个方面：引物因素，反应体系因素，反应温度因素三大方面。
1. 引物因素
甲基化PCR引物设计的好坏是甲基化PCR扩增是否成功的关键因素。 甲基化PCR引物设计原理：样品的DNA经亚硫酸盐处理后，发生甲基化的CpG
岛碱基C不变，而未发生甲基化的CpG岛碱基C则变为尿嘧啶U，即C—U。
甲基化 PCR
，最
好是含有多个CpG岛，以保证引物的高特异性，同时可提高DNA甲基化碱基的 检出率。
目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。因为人们发现肿瘤的发生可能与抑
癌基因启动子区的CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭有关
由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此甲基化的诊断可以用于
肿瘤发生的早期预测，而且全基因组的低甲基化也随着肿瘤发生而出现，并且其 随着肿瘤恶性度的增加而显著，因此甲基化的检测可用于肿瘤的分级。
Epigenome Consortium, HEC)宣布开始投资和实施人类表观基因组计划(HEP)。
其主要任务是绘制出人类基
因组中甲基化可变位点图谱，
即不同组织与疾病状态下， 5- 甲基胞嘧啶出现及其分布 频率的图谱，以指导和系统 地研究DNA甲基化在人类表 观遗传、胚胎发育、基因印 记、等位基因失活及肿瘤发 生中的重要作用。
甲基化分型技术通常应用于较少位点的检测，多为单基因的甲基化检测。 甲基化图谱则是对大范围的基因甚至是全基因组的甲基化分析。
根据研究所用处理方法不同，即 DNA 的甲基化修饰（指 CpG 二核昔酸中 胞嘧啶的5 位碳原子加上一个甲基基团，形成5 甲基胞嘧啶）。一般而言，可 以分辨出甲基化修饰的方法有以下几种： 1. 甲基化敏感性内切酶 2. 亚硫酸氢盐的修饰 3. 特异性识别甲基化修饰DNA的抗体或蛋白 4. 质谱或色谱等精密检测手段
3. 反应温度因素
甲基化PCR扩增结果有三种情况：
1. 产物电泳为阴性；
2. 产物电泳出现多条非特异性带；
3. 产物电泳为阳性。 出现1 、2两种结果时，在保证反应体系和引物设计没问题的前提下，可通
过调整甲基化PCR的反映温度去获取目的片段。
由于PCR反应中，Tm的高低与GC含量呈正相关。因甲基化与未甲基化引物序列
测其扩增效率，对于扩增效率<30％的引物要进行优化，方法是：在核心启动子区域
前后反复调整甲基化正向引物扩增起始点，以期使引物扩增效率增高，降低扩增难 度，从而提高 PCR 产量。
2. 反应体系因素
甲基化 PCR 的反应体系一般与普通 PCR 体系一样，但针对甲基化 PCR 的 DNA 模
板，须在抽提后检测其纯度和含量。其纯度要求 ；其含量准确测定，否则在亚硫酸盐处理时会因加入的 DNA模板太多会导致 DNA处理不完全而导致甲基化 PCR扩增失败，而加入模板太少则会因目的片段 少导致假阴性且浪费试剂。同时，甲基化PCR的DNA模板在抽提后要做一个初 步电泳，看抽提的 DNA 模板是否完整。电泳后，若只有一条带则表明抽提的 DNA模板是完整的，反之，得重新提取DNA。因为DNA模板的断裂处若正好是 目的片段所在处，则会导致甲基化PCR扩增失败。
Uhlmann 等发现不同病理类型及不同恶性程度的神经胶质瘤细胞的 7 种肿瘤标志
基因存在着不同程度的甲基化。因此，甲基化的研究为肿瘤的早期预测、分类、 分级及预后评估提供了新的依据 。
DNA甲基化检测意义
继 人 类 基 因 组 计 划 结 束 后 ， 2003 年 人 类 表 观 基 因 组 协 会 (Human
DNA甲基化检测专题
——MSP vs. BSP
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DNA甲基化基本概念 DNA甲基化生物学作用 DNA甲基化检测意义 DNA甲基化检测方法 DNA甲基化PCR特点 DNA甲基化PCR影响因素
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DNA甲基化基本概念
DNA甲基化是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase, Dnmts）催化S-腺苷甲
Mg2+浓度一般在2.0-2.5mmol/L为宜，过高或过低都不利于扩增。 Taq酶一般选择针对富含GC等复杂二级结构模板的Buffer与酶，一旦使用不要轻
易更换，以免MSP因重新优化引起时间和成本浪费。
亚硫酸盐处理模板的过程要严格按照操作说明操作，避免DNA模板处理不完全。 经亚硫酸盐处理后的。DNA模板应保存在-20℃下，且使用不超过2M。