烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
实验五 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
实验五聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、目的同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
研究表明，植物在发育过程中，所含同工酶的种类和比例都不相同，它们与植物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系，因此作为基因表达的产物，测定同工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具，在植物的种群、发育及杂交遗传的研究中有重要的意义。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化，测定这种酶的活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
利用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便，灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验要掌握电泳技术的原理、方法、装置、凝胶配制等知识，熟悉主要的操作过程，同时对同工酶有一个感性的认识。
二、原理1．电泳带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
近几十年来，电泳作为一项有效的分析、分离和制备技术发展很快，在生产、科研和医疗工作中得到了广泛应用。
用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。
2．影响电泳的主要因素若将带净电荷q的粒子放入电场，则该粒子所受到的引力F引可用数学式表示如下：F引＝E·q（1）式中E为电场强度，单位为“v/cm”，表示电场中单位距离上的电位差。
如果这种情况发生在真空中，则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。
但在溶液中，由于电场的牵引力F引与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力（即摩擦力）F阻相对抗。
故上述现象不会发生。
根据Stokes公式，阻力的大小取决于粒子的大小和形状以及所在介质的粘度：F阻＝6πrηv (2)式中F阻是球形粒子所受的阻力，r是球形粒子的半径，η是溶液的粘度，v是粒子移动的速度。
实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析(实验报告)
实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶生物111班杨明轩1102040128一、研究背景及目的过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工酶很少,待幼芽长到0.5 -1 厘米以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达。
这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有密切关系。
而同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能。
它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。
在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，体现各组织的特异功能，这一特点可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。
品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。
育种工作者常用同工酶来作为鉴定植物的种间杂交, 特别是远缘杂交的生化指标。
在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段。
要对同工酶展开研究，首先要实现对它的分离，因此要选择合适的分离技术。
基于“差异转化”的思路，层析和电泳是两种最为常见的大分子分离方法。
但由于二者技术细节上的差异，层析更常用于大分子的分离纯化，而电泳则主要用于大分子的分离检测。
因此在本次实验中，我们采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。
同时本实验利用电泳现象对过氧化物同工酶进行分离纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较分析电泳技术和其它分离技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分离技术。
6-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶植物098 原硕0901080808摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生化反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装臵、凝胶配臵等问题，熟悉所有的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。
关键字：聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，同工酶一、研究背景及目的：同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
它们是DNA编码的遗传信息表达的结果。
最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等有一定关系。
因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高、重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。
过氧化物是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断变化。
因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一种时期植物体内代谢的变化。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生化反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装臵、凝胶配臵等问题，熟悉所有的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。
二、研究依据及原理：聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N ，N —四甲基乙二胺(N，N，N ，N —tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
实验八 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、实验目的１ 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
２ 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。
３ 掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。
４ 掌握过氧化物酶的活性的测定。
二 实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr ）和交联剂（即共聚体的N,N －甲叉双丙烯酰胺 Bis ）在加速剂（N,N,N ’,N ’－四甲基乙二胺 TEMED ）和催化剂（过硫酸胺 (NH 4)4S 2O 8 简称AP ）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性１ 聚合反应聚丙烯酰胺是由Acr 和Bis 在催化剂（AP ）或核黄素（C 17H 20O 6N 4）和加速剂（TEMDA ）的作用下聚合而成的三维网状结构。
催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有２种催化体系：① AP-TEMED 属化学聚合作用② 核黄素－TEMED 属光聚合作用２ 凝胶孔径的可调性及其相关性质① 凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr 与Bis 之比： 00100a b T m+=⨯ a:b<10 脆硬乳白交联度： 00100b c a b=⨯+ a:b>100糊状易断 ② 凝胶浓度与孔径的关系T （Acr 和Bis 总浓度）增加 孔径减小 移动颗粒穿过网孔阻力增加③ 凝胶浓度与被分离物分子量的关系分子量增加 阻力增加 移动速度减慢。
同时还与分子形状及分子电荷有关系。
在操作时，可以选用007.5凝胶。
因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。
３ 试剂对凝胶聚合的影响水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ）原理根据有无浓缩效应可分为：连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH 值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。
实验五过氧化物同工酶PAGE分析
成分
含量
作用
A液（30%Acr-0.8%Bis） 2.65mL
交联剂
B液（Tris+EDTA） 4.75mL
缓冲液
C液（TEMED）
10μL
加速剂
D液（10% AP）
50μL
催化剂
四、操作步骤
样品制备 称取小麦幼苗叶片0.5 克，放入研钵内，
加 pH8.0 样品提取液1mL，于冰浴中研 成匀浆，转入离心管，在高速离心机上以 8000rpm 离心 10 分钟，倒出上清液， 以等量 40%蔗糖混合，并加2滴溴酚蓝， 即为样品液。
同功酶是机体调节酶活性的一种方式，在各种生物体中 广泛存在。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。 它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。 在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此， 测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某 一时期植物体内代谢的变化。
（二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98）
三、材料、仪器和试剂
试剂：
A液：30%Acr-0.8%Bis B液：Tris+EDTA C液：TEMED D液：10%AP 电极缓冲液：硼酸钠-硼酸（pH8.3） 0.5%溴酚蓝 染色液：0.1%联苯胺 样品提取液：pH8.0Tris-HCl缓冲液 40%蔗糖溶液
四、操作步骤
凝胶制备
四、操作步骤
装槽、上样
30-50μL
四、操作步骤
电泳 接好电源线(上槽接负极，下槽接正极)。
打开电源开关，调节电压，以10V/cm稳 定电压电泳，待前沿指示染料溴酚蓝下行 至距胶板末端1-2 厘米处，即可停止电泳。
四、操作步骤
剥胶、染色
实验9-10 植物过氧化物酶同工酶的测定(凝胶圆盘电泳)
（五）记录并计算： 记录并计算： 观察、记录酶谱， 观察、记录酶谱，并 计算各同工酶的相对 迁移率。 迁移率。
【要点提示】 要点提示】
1. 分离胶聚合时间应控制在 ～60min，聚合过 分离胶聚合时间应控制在30～ ， 快使凝胶太脆易断裂，主要是AP或 快使凝胶太脆易断裂，主要是 或TEMED过 过 量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是AP或 量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是 或 TEMED用量不足或已失效。 用量不足或已失效。 用量不足或已失效 2. 电泳时如果电泳槽盖上有冷凝水，则表示电压 电泳时如果电泳槽盖上有冷凝水， 或电流过大，体系发热，可引起蛋白质变性、 或电流过大，体系发热，可引起蛋白质变性、 凝胶底部断裂等，应注意调整。 凝胶底部断裂等，应注意调整。特别是进入分 离胶后应通过控制电压，调节电流不超过5mA/ 离胶后应通过控制电压，调节电流不超过 管。
（四）染色： 染色： 临用时配制染色液：（ ml ） 临用时配制染色液：（10 ：（ 联苯胺母液 H2O 3% H2O2 0.5 ml 9.3 ml 0.2 ml
将染液倒入盛有凝胶条的试管中（ 将染液倒入盛有凝胶条的试管中（没过 胶条）。约10min后用自来水冲洗。 胶条）。约 后用自来水冲洗。 ）。 后用自来水冲洗
【实验步骤】 实验步骤】
（一）过氧化物酶的提取：取8~12粒发芽 过氧化物酶的提取： 粒发芽 的麦粒，加入1ml H2O 或0.5mol/L Tris的麦粒，加入 HCl缓冲液（pH 6.8），冰浴上研成匀浆。 缓冲液（ ），冰浴上研成匀浆。 缓冲液 ），冰浴上研成匀浆 转入离心管，再用2ml上述溶液冲洗研钵 转入离心管，再用 上述溶液冲洗研钵 壁并全部转入离心管，4000r/min离心 壁并全部转入离心管， 离心10 离心 min，上清液供电泳分析用。 ，上清液供电泳分析用。
分离过氧化物同工酶
同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶 蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组 酶。研究表明，植物在发育过程中，所含同 工酶的种类和比例都不相同，它们与植物的 遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一 定关系，因此作为基因表达的产物，测定同 工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具， 在植物的种群、发育及杂交遗传的研究中有 重要的意义。
4、电泳 加样，连接电极线，电泳。 5、剥胶，染色，记录结果
聚丙烯酰胺凝胶
丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联 剂N，N‘-甲叉双丙烯酰胺（N,N’-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚 合而成的 聚合:化学法—过硫酸铵-TEMED 光化学法—核黄素-TEMED 光聚合形成的凝胶孔径较大 聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决 定
2、分别制备分离胶、浓缩胶
在玻璃板做记号，取专用小烧杯，按分离胶取样表加试剂，混匀后沿长玻 璃板小心加到玻璃板之间（避免产生气泡），加至记号处，立即覆盖 2～3mm的水层，静置待聚合（约40min），当胶与水层的界面出现时表 明胶已聚合。按浓缩胶取样表加试剂，倒掉分离胶上的水层，立即加入 浓缩胶，插入梳子（即样品槽模板），待胶凝后，小心取出梳子。将稀 释10倍的电极缓冲液倒入两槽中，前槽（短板侧）缓冲液要求没过样品 槽，后槽（长板侧）缓冲液要求没过电极，备用。
■ 凝胶的聚合：
聚合反应
free radical
Bis Bis
顶点自由基 可再延续
自由基形成
催化系统
聚合作用只有在自由基存在时才能发生，需要一个催化 诱发剂系统产生自由基 化学聚合 过硫酸铵—TEMED（四甲基乙二胺） 孔径较小，用于制备分离胶 影响聚合：低pH，氧分子，一些金属离子，低温 光聚合 核黄素—TEMED 需要有痕量氧存在 ，直接日光或室内强散射光 孔径较大，用于制备浓缩胶胶
实验二 过氧化物酶同工酶的提取、分离
实验二过氧化物酶同工酶的提取、分离苟亚峰摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定玉米幼苗过氧化物酶同工酶，实验结果显示玉米幼苗中至少含有5种过氧化物同工酶。
关键词：过氧化物同工酶；PAGE；电泳分离引言同工酶是指催化同一种化学反应，但酶的分子结构组成却有所不同的一组酶。
同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如过氧化物酶在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。
电泳(electrophoresis，简称EP ) 指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
1937年瑞典科学家Tiselius 成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖。
50年代，先后出现了以滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物的电泳技术。
60年代，出现了聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。
这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基团体系时，就会聚合。
引发产生自由基的方法有两种：（1）化学法：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺单体形成单体长链。
化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；（2）光聚合法：光聚合法的催化剂是核黄素（VB2），光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。
生化实验：聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶
LDH同工酶广泛存在于动植物及微生物中，动物各组织中LDH 同工酶各组分含量不同。临床上对LDH及同工酶的检测可作为某些 疾病诊断的依据之一。
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四. 思考题
1. 何谓连续体系？不连续体系？不连续体系的浓缩效应是 怎样实现的？
2. 操作中有哪些关键环节？应做何处理？ 3. 如何分析实验结果？
其他注意事项
▪ TEMED加入后，搅拌并快速装柱 ▪ 电泳时先加缓冲液，后上样。上样前检查是否漏缓冲液，
是否有气泡。 ▪ 凝胶不能倒入水池。 ▪ 显色时保温避光，用40℃显色。
不连续电泳的四个不连续性 凝胶浓度的不连续 性；缓冲液离子成分的不连续性；缓冲液pH梯度的不 连续性；电位梯度的不连续性。
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净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳
分离蛋白质的原理
净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大分子 进行的电泳，目的是为了保持蛋白质的天然构象、其亚 基之间的相互作用及其生物学活性。利用蛋白质分子中 所带净电荷、分子质量、形状的差异，在电场中泳动的 速度和方向不同，从而达到分离的目的。多数蛋白质的 pI在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统中 进行电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极迁 移，称为阳极电泳；对于一些碱性蛋白，使用酸性缓冲 系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而向阴极迁移，称 为阴极电泳。
22
18
电泳： 加样后，盖上电泳槽安全盖，接通电源，
注意正负电极的连接，将电泳仪调至恒压220 V， 直到溴酚蓝前沿到达距凝胶下端约0.5 cm时（60 min），关闭电源，停止电泳。
垂直板聚丙烯酰胺凝胶连续电泳分离乳酸脱氢酶同工酶(活性染色鉴定法)
电泳结果实例
1 2 3 4
LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1
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电泳装置
采用Pharmacia公司的SE250小型夹心式垂直 板电泳装置： 制胶装置 制备凝胶板 电泳装置 进行凝胶电泳 每组（2人）做一块胶，两组共用一套电泳装置， 两套电泳槽共用一台电泳仪。
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操作步骤
一、样品制备： 样品制备： 断脊椎处死小鼠，取适量小鼠骨骼肌、肝脏、 心肌和脑组织，加入5倍组织重的匀in，15 min)， 吸出上清液，加入等体积40 %的蔗糖（含少许溴酚 蓝）混匀，放置4℃冰箱中备用。
3
AP-TMTED催化体系 AP-TMTED催化体系
TEMED催化 生成硫酸自由基： 催化AP生成硫酸自由基 催化 生成硫酸自由基：
－ S2O82－
2SO4
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链： 单体并形成单体长链： 硫酸自由基的氧原子激活 单体并形成单体长链
Bis将单体长链间连成网状结构： 将单体长链间连成网状结构： 将单体长链间连成网状结构
10电荷因素蛋白质分子形状和大小相同所带电荷性质和数量不同分子大小蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同分子大小不同分子形状蛋白质分子所带电荷性质和数量相同分子形状不同电荷因素分子大小分子形状11连续系统是指电泳系统采用相同孔径的凝胶缓冲系统等条件下进行区带电泳是利用蛋白质分子的电荷效应进行分离凝胶的分子筛效应不明显一般只用于分离一些比较简单的样品缺点是分辨率不高
6
温度
分子氧
杂质
凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响
凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝 胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因 素。T为凝胶溶液中单体和交联剂的总质量浓度，C为凝胶溶液中交联 剂占单体和交联剂总量的质量分数。 b a+b C = × 100 % T = × 100 % a+b m 式中，a为丙烯酰胺单体的质量(g)，b为交联剂的质量(g)，m为溶液的 终体积(mL)。 凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。当a:b小于10时，凝胶脆且硬， 不透明，呈乳白色；当a:b大于100时，即使用5%的丙烯酰胺凝胶也呈 糊状；通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺浓度高于3%，凝胶富有弹 性并且透明。
植物过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳实验指导
植物过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳【目的】1．掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作过程。
2．了解聚丙烯酰胺圆盘电泳的实际应用，利用此法分离植物过氧化物同工酶。
【概述】1．聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支承物的一种电泳技术。
其凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构。
凝胶网孔的大小可通过改变单体浓度和交联剂浓度的比例加以调节，常用的所谓标准凝胶是指含丙烯酰胺7%～7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能达到满意的结果。
聚丙烯酰凝胶电泳过程中除了一种电泳所具有的电荷效应外，还具有“分子筛”效应；不连续的凝胶电泳过程中具有电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
不连续凝胶电泳体系的不连续性体现在：（1）凝胶由上、下两层组成，两层胶孔孔径不同。
上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH 值不同。
如常用的碱性系统中，电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl 缓冲液，分离胶为pH8.9的Tris-HCl 缓冲液。
（3）在电场中形成不连续的电位梯度。
在这种不连续的系统中有三种物理效应起作用，使样品分离效果好、分辨率高。
这三种效应是电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
① 电荷效应 由于各种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而在一定电场作用下迁移率不同。
承载有并效电荷多的，泳动的快，反之则慢。
CH 2CH C=O NH 3CH 2=CH C=O NH CH 2NH C=O CH 2+CH 2CH C=O NH 3CH 2CH C=O NH 3C=O NH CH 2NH C=O CH 2CH 2CH [[]]nn 催化剂② 分子筛效应 因为聚丙烯酰胺具有网孔结构，所以直径大，形状不规则的分子，电泳时通过凝胶受到的阻力大，移动较慢；分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到的阻力小移动较快。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
TEMED 丙烯酰胺 + 甲叉双丙烯酰胺------------------聚丙烯酰胺凝胶 Ap (三维网状结构)
AP-TMTED催化体系
TEMED催化AP生成硫酸自由基：
S2O82－
¯ 2SO4·
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：
Bis将单体长链间连成网状结构：
通过改变凝 胶浓度及交 联度来调节 凝胶的孔径， 具有良好的 分子筛效应。
试剂贮备液瓶号 ①分离胶缓冲液 吸取毫升数
②分离胶贮液 ③过硫酸铵 蒸馏水 4ml 8ml 2ml
2ml
混匀，立即用装有针头的注射器将凝胶液缓缓注入已准 备好的干洁胶室中。胶室两侧和底部要防止渗漏，注胶 过程中要防止气泡产生。胶液加至离玻璃板顶部约 0.8cm处，此时将电泳槽垂直放置；立即注入蒸馏水使 胶的表面覆盖少量水层。约30min后，胶和水层之间出 现清晰的界面，表明聚合完成。
3、样品的制备
过氧化物酶的提取：称 取1g甘薯叶柄置于冰浴 上的研钵内，加入1ml样 品提取液(内含 pH6.8 、 0.05mol/L Tris－HCl， 20%蔗糖)研成匀浆后， 再加2ml提取液研磨均匀， 转入离心管，于3500rpm 离心15min，其上清液即 为酶的提取液，供电泳 分析用。
7、绘制酶谱条带，并计算各同工酶的迁移率
[结果计算]： a Rf值 = ----b
a
b
四、注意事项
安装玻璃夹心槽时，两片玻璃要干燥，有机玻璃条要夹平并用 胶布密封好。 分离胶或浓缩胶配制好的混合液要马上进行灌胶，以免溶液聚 合成胶。 过硫酸铵要现用现配。 分离胶灌好，上层要覆盖一层水层，避免胶氧化，同时使分离 胶胶面平整。 电泳仪连接电泳槽后，通电要严格控制电泳，每个电泳槽的电 流不能超过10mA,电压不能超过170V，电压过高会导致玻璃板 裂开。 染料必须现用现配。
过氧化物酶同工酶的提取分离
(3)凝胶的质量决定因素：
（1）凝胶度：
是指100mg凝胶溶液中含有单体（Acr）和交联剂 （Bis）的总克数，用T%表示。
（2）交联度：
是指凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的 百分数，用C%表示。 一般浓缩胶的浓度为7.5%，分离胶的浓度为10%。
聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和
不连续PAGE电泳胶体系统的组成：
电泳系统
缓冲液 pH 胶体浓度
1 上层 (负极) 缓冲液 Tris-glycine 8.3
-
2 样本溶液
Tris-glycine 8.3
-
3胶
浓缩胶 Tris-HCl
6.7
5%
4体
分离胶 Tris-HCl
8.9
7%
5 下层 (正极)缓冲液 Tris-glycine 8.3
a与b的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，a 与b的重量比应在30左右。常用29 ： 1
(4)不连续PAGE的原理：
第一、三个不连续性： ①凝胶孔径的不连续； ②缓冲液离子组成及各层凝胶pH的不连续； ③在电场中形成的电位梯度的不连续。
第二、不连续系统中的三种物理效应： ①电荷效应： ②分子筛效应: ③浓缩效应:
二、实验原理:
2、同工酶概念：
同工酶指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分 子结构组成却有所不同的一组酶。
同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等 都有一定的关系，如POD在细胞代谢过程中与呼吸作用，光 合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同 工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。
一、实验目的：
1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法； 2、掌握过氧化物酶(POD)活性测定的原理及方法。 3、了解过氧化物酶(POD)的生物学功能。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶.
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶【目的要求】1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。
2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质的操作技术。
【实验内容】乳酸脱氢酶目前发现有五种同工酶，分别是LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，根据五种同工酶分子结构以及理化性质的不同，pI各不相同，在同一pH条件下带电荷多少不同，在电场中移动速度不同，可用电泳法将其分离。
采用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳可将新鲜血清中的乳酸脱氢酶同工酶进行分离，然后用由乳酸、NAD+、PMS、NBT组成的染色液染色，显示清楚的五条色带，即五种乳酸脱氢酶同工酶，从阳极到阴极分别是LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。
最后将分离的乳酸脱氢酶凝胶柱用波层层析扫描仪在560nm波长处扫描，测出光密度，计算出各种LDH同工酶的百分含量。
【实验材料】1．仪器与材料真空泵、圆盘电泳槽、电泳仪、刻度吸管、微量加样器、长头注射器、烧杯等。
2．试剂30％丙烯酰胺贮存液、催化剂1％过硫酸铵、1％TEMED缓冲液、电泳槽缓冲液、蔗糖、乳酸钠、辅酶I、PMS、NBT、7.5%醋酸溶液3．样品血清【基本步骤】1. 准备玻璃管：准备5×60mm玻璃管若干支，洗净烤干，管下端套一密塞的橡皮套或瓶塞，垂直插入管架上。
2. 配制凝胶：TEMED缓冲液 1.5ml30%Acr-Bis溶液 4ml蒸馏水6ml混匀真空抽气5分钟0.14%过硫酸铵6ml轻轻摇匀准备装管3. 装管：用细长滴管或长头注射器吸取凝胶装入玻璃管中，高度距离管上口8mm为宜，检查管内无气泡后，向胶面缓缓注入蒸馏水约4mm高度，在自然光下聚合约40分钟，见水与胶之间有明显界面出现，为胶已聚合。
用滤纸条吸取凝胶上方水层，取下管底部的橡皮套管，将凝胶管垂直插入电泳槽圆孔中并尽量使各管高度一致。
4. 加样：用微量加样器每管加血清—蔗糖稀释液100ul，（血清1份，40%蔗糖6份，溴酚兰少许混合而成）。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离LDH同工酶
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离LDH同工酶一、实验目的1.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。
2.学习聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法分离LDH同工酶。
二、实验原理LDH 同工酶是由催化反应相同、分子结构和理化性质不同的一组酶组成，由于分子效应和电荷效应，他们分别以不同的速度在以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳中泳动，可分离出5种同工酶，泳动速度为LDH1> LDH2> LDH3> LDH4> LDH5。
聚丙烯酰胺凝胶电泳有丙烯酰胺单体和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂作用下，形成的三维网状结构称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称PAGE），电泳速度与粒子所带电荷、粒子大小有关外，还与网络的孔径有关。
粒子大于凝胶孔径的，电泳速度慢。
反之则电泳速度快。
三、实验试剂30％凝胶贮存液：丙烯酰胺29g，亚甲双丙烯酰胺1g，加蒸馏水溶至100ml，过滤棕色瓶4度保存。
Tris-甘氨酸电极缓冲液（5X）：Tris碱 15.1g 甘氨酸94g溶解于900ml去离子水中调解为PH8.3用去离子水定容至1000ml。
10％过硫酸铵：将0.5g过硫酸铵溶解于5ml水中。
Tris-Hcl 1.5mol／ml（ PH8.8）：18.165g Tris碱溶解于40ml水中，用1mol/lHCl调节PH至8.8，加水定容至100ml。
Tris-Hcl 0.5mol／ml（ PH6.8）：12.11g Tris碱溶解于40ml水中，用1mol/lHCl调节PH至6.8，加水定容至100ml。
2X样品缓冲液：Tris碱0.76g 蔗糖20g加41.5ml水溶解，然后加蒸馏水定容至50ml。
染色液：甲醇250ml 冰乙酸50ml 考马斯亮R250 0.5g去离子水200ml.脱色液：甲醇250ml 冰乙酸80ml去离子水200ml。
TEMED（四甲基乙二胺）四、实验操作1 PAGE凝胶的制备12%分离胶配方大约注入玻璃板的2/3轻轻在其顶层加入少量去离子水以磨平胶面。
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实验八聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
一、实验目的
１学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
２掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。
３掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。
４掌握过氧化物酶的活性的测定。
二实验原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂（即共聚体的N,N－甲叉双丙烯酰胺Bis）在加速剂（N,N,N',N'－四甲基乙二胺TEMED）和催化剂（过硫酸胺(NH4)4S2O8 简称AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性
１聚合反应
聚丙烯酰胺是由Acr和Bis在催化剂（AP）或核黄素（C17H20O6N4）和加速剂（TEMDA）的作用下聚合而成的三维网状结构。
催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有２种催化体系：
①AP-TEMED 属化学聚合作用
②核黄素－TEMED 属光聚合作用
２凝胶孔径的可调性及其相关性质
①凝胶性能与总浓度及交联度的关系
凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比：a:b<10 脆硬乳白
交联度：a:b>100糊状易断
②凝胶浓度与孔径的关系
T（Acr和Bis总浓度）增加孔径减小移动颗粒穿过网孔阻力增加
③凝胶浓度与被分离物分子量的关系
分子量增加阻力增加移动速度减慢。
同时还与分子形状及分子电荷有关系。
在操作时，可以选用凝胶。
因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。
３试剂对凝胶聚合的影响
水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理
根据有无浓缩效应可分为：
连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。
不连续系统：电泳体系中由于缓冲液离子成分、PH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还有浓缩效应。
因而其分离带清晰度及分辨率高。
垂直板电泳：凝胶是在两块间距几毫米的平行玻璃板中聚合。
垂直圆盘电泳：凝胶是在玻璃管中聚合，样品分离区带染色后呈圆盘状。
（三）过氧化物酶染色原理
过氧化物酶催化过氧化氢释放活性氧，进一步氧化联苯胺使之由蓝色变为褐色。
属于活性染色，若酶失活，则不能变色。
（四）过氧化物酶活性的测定原理
过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。
在有过氧化氢存在下过氧化物酶能使愈创木酚氧化生成褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量，以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以A470/min.mg蛋白质表示
三实验器材
１电泳仪（600V）及盘状电泳电泳槽
２电泳玻璃管（用碱性较低的玻璃管），内径5－7mm，长80－100mm
３玻璃架
４微量注射器或微量吸管
５带长针头的注射器
６日光灯
７带有玻璃珠或玻璃棒的一小段乳胶管
四试剂和材料
１贮液和工作溶液的配制
２染色液的配制
A液：称取0.4g联苯胺，加入３ml冰醋酸，溶解后加入１７ml蒸馏水随用随配
B液：NH4Cl C液：EDTA(PH6.0)D液：H2O2
按A：B：C：D＝1：1：1：８比例配制
３测酶活力所需试剂
20mmol/l KH2PO4 H2O2 愈创木酚100mmol/l磷酸缓冲液（PH=6.0）
反应混合液：100mmol/l磷酸缓冲液（PH=6.0）50ml于烧杯中，加入愈创木酚28l于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解。
冷却后加入H2O2 19l 混合均匀保存于冰箱中。
４酶液的制备
（１）材料：萌发３－６天的高粱玉米小麦种子
（２）步骤：称取不同植物材料幼苗茎部1g加入20mmol/l KH2PO4 10ml于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min 离心15min。
倾出上清液，测出总体积放于冷处。
五操作步骤
１过氧化物酶活性的测定
取２只光径1cm的比色板，１只中加入反应混合液３ml、KH2PO41ml 作为校零对照，另一只加入反应混合液３ml、酶提取液１ml立即开启，秒表记时，于分光光度计上测量吸光值。
每隔一分钟计数一次。
（A470= ------------------------）
酶活力= ---------
２凝胶的制备
（１）分离胶的制备：（小孔径凝胶）PH8.9凝胶浓度
将贮液按１号：２号：水：３号＝5ml：10ml：5ml：20ml比例混匀。
用带长针头的注射器快速加入玻璃管中（或两层玻璃板之间），高度约3/4。
沿壁加入3－5ml蒸馏水用于隔绝空气，使胶面平整。
静置30－60min完成聚合，用滤纸吸去水分。
（２）浓缩胶制备：（大孔径凝胶）PH6.7凝胶浓度
将贮液按４号：５号：６号：７号＝３ml：6ml：3ml：12ml比例混匀，按上述方法加到分离胶上方距离管上缘0.5cm处（或两层玻璃板之间，放上样品槽模板）。
仔细加入水层，在距管口１０cm处用日光灯照射进行光聚合。
照射6－7min凝胶由淡黄变为乳白。
30完全聚合，在室温下放置30－60min。
取出样品槽模板，用滤纸吸去多于液体。
在电泳槽上下槽中加入稀释10倍的PH8.3电板缓冲液并没过玻璃管顶端（或没过短玻璃板）。
（３）加样
酶提取液：蔗糖＝１：１，加少许溴蓝指示剂，混匀。
用微量加样器取５样品混合液，通过缓冲液，小心加到玻璃管中（或样品凹槽底部）。
（４）电泳
接通电源，调节电压，开始为150V，待样品进入分离胶调整至300V 。
当指示剂迁移至距下缘１cm时，停止电泳，关闭电源。
（５）染色
取出胶条（胶板），于染色液中染色20min，酶带显蓝色，漂洗后显褐色。
六思考题
１简述聚丙烯酰胺凝胶聚合的原理，如何调节凝胶的孔径？
２为什么样品会在浓缩胶中压缩成层？
３为什么要在样中加入少许溴酚蓝和蔗糖？各有什么作用？
４根据实验过程的体会总结如何做好聚丙烯酰胺凝胶电泳，哪些是关键步骤？。