RNA提取程序-TTIZOL
(完整版)Trizol法提取RNA实验步骤.doc
Trizol 法使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。
RNA 质量的高低常常影响 cDNA 库， RT-PCR和 Northern Blot等分子生物学实验的成败。
Trizol 是一种新型总RNA 抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf 管（ RNase-free）、 Tips（ RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致 RNA 降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase 完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA 制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase 的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
用用 DEPC配制的 70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取时必须戴手套。
一般情况下采RNase-free 的物品1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明 RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入 DEPC使 DEPC的终浓度为 0.1%。
注意： DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC 水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将 DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已 DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少 30 分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品250°C 烘烤 3 小时以上。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)
Trizoｌ法使用步骤一、分离纯化得基本原理研究基因得表达与调控时常常要从组织与细胞中分离与纯化ＲＮA。
ＲNA质量得高低常常影响cＤNA库,ＲT-PCＲ与Ｎorthern Ｂloｔ等分子生物学实验得成败。
Ｔrizol就是一种新型总ＲNＡ抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出得核酸酶。
二、用户需自备得试剂与材料无水乙醇、氯仿、Ｇlycｏgen(可能需要)、 1、５ｍｌ Eppeｎｄｏrf管(ＲNase-frｅe)、 Tips(ＲNase－free)三、准备工作RNａse酶非常稳定,就是导致ＲNＡ降解最主要得物质。
它在一些极端得条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。
用常规得高温高压蒸气灭菌方法与蛋白抑制剂都不能就是ＲＮase完全失活。
它广泛存在于人得皮肤上,因此,在与RＮA制备有关得分子生物学实验时,必须戴手套。
RNase得又一污染源就是取液器,根据取液器制造商得要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用ＤEPC（焦炭酸二磷脂,一种ＲＮａse抑制剂)配制得7０％乙醇擦洗取液器得内部与外部,基本达到要求。
取ＲＮａｓｅ－free得物品时必须戴手套。
1、料制品得处理尽可能使用无菌,一次性塑料制品，已标明RNasｅ-Fｒee 得塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下:1)在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEＰＣ使DEＰC得终浓度为０、1%。
注意:DEP Ｃ为剧毒物,活性很强，小心在通风柜中使用。
2)处理得塑料制品放入一个可以高温灭菌得容器中,注入ＤEPC水溶液,使塑料制品得所有部分都浸泡到溶液中。
3)在通风柜中室温处理过夜。
4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已ＤEＰＣ水处理过得塑料制品得烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适得温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻与金属物品250°C烘烤3小时以上。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)
Trizolxx使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCF和Northern Blot等分子生物学实验的成败。
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen （可能需要）、 1.5ml Eppendof管（RNase- free ）、Tips（RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的咼温咼压蒸气火菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA 制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEPC焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂）配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。
注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品烘烤3小时以上。
四、从组织中提取总RNA1）液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。
rna提取一般步骤总结
RNA提取一般步骤总结RNA提取原理：| 通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。
但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。
RNA提取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。
但其中最关键的是抑制RNA酶活性。
RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA 与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。
第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。
实验步骤：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。
1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。
2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。
3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。
4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。
5、融解RNA一般使用TE。
6、保存RNA应该尽量低温。
为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。
从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。
另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。
RNA提取(Trizol法)
RNA提取
1、植物材料，液氮研磨，转入2.0ml离心管，加1ml Trizol，充分混匀，室温放置10min；
2、4℃，13000rpm，20min；
3、取上清于新离心管（尽可少，不可多），加250ul
的5M NaCl，250ul氯仿。
这一步也可以全部加氯仿，加等体积的氯仿，充分混匀；
4、4℃，13000rpm，20min；
5、取上清于新离心管（尽可少，不可多），，加等体
积的异丙醇，混匀，室温放置10min，或者-80℃冰箱放置1小时；
6、4℃，13000rpm，20min；
7、弃上清，加1ml75%乙醇（DEPC水配）;
8、4℃，13000rpm，5min，弃上清；
9、重复（7, 8），室温放置，晾干（5-10min）；
10、加20-30ulDEPC水溶解。
除基因组
1.在微量离心管中配下列反应（50ul）
全RNA 20-50ul；
10*DNase I Buffer 5ul
DNase I (5v/ul) 2ul
RNase Inhibiter (40v/ul) 0.5ul
DEPC 水 up to 50ul
2.37℃反应20-30min；
3.加250ul的DEPC水；
4.加等量的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）充分混匀；
5.离心，取上清，移到新离心管；
6.加等量氯仿：异戊醇（24:1），充分混匀；
7.离心，取上清，移到新离心管中；
8.加1/10量的3 M NaOAc（pH 5.2）。
9.加2.5倍无水乙醇（预冷），-20℃放置1h；
10.离心，弃上清，75%乙醇洗涤，离心；
11.弃上清，干燥，加适量DEPC水溶解。
RNA提取过程
RNA提取步骤及注意事项实验步骤如下：1.取50—100mg的组织,加入1ml Trizol试剂，用匀浆器打匀(Trizol先放于冰上)。
2.将匀浆室温放置5min。
3.加入300μl氯仿,剧烈震荡混匀30s，冰上静置4min。
4.12000rpm，4℃离心15min。
5.将上清液小心转移到新的1.5ml离心管中（取400μl），加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置15min。
（此步中注意：不要吸取任何中间层物质，宁缺勿烂。
）6.12000rpm，4℃离心15min。
7.小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。
8.用70%乙醇（DEPC处理的水配制）洗涤1次，加入700μl乙醇，将RNA沉淀弹起，漂洗。
（此时RNA是不溶解的）9.12000rpm，室温离心10min。
10.尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失。
11.真空离心干燥3—5分钟，或放在室温下使乙醇完全挥发掉。
12.沉淀用20μl DEPC-H2O溶解。
如发现沉淀难溶，68℃处理10min。
13.RNA检测(1)测定样品在260nm和280nm的吸光值按1OD=40μg/ml RNA计算RNA的产量。
OD260/OD280在1.8-2.0。
(2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,确定RNA的完整性和污染情况。
注意事项：1.获得RNA效率低有一下原因a:样品裂解或匀浆处理不彻底b:最后得到地RNA沉淀未完全溶解2.A260/A280＜1.65原因a:检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。
低离子浓度和低PH条件下，A280值会较高b:样品匀浆时加地试剂量太少c:匀浆后样品未在室温放置2分钟d:水相中混有有机相e:最后得到地RNA沉淀未完全溶解3.RNA降解原因a:组织取出后没有马上处理或冷冻b:样品或提取地RNA沉淀保存于-5--20度，未在-60--70度保存c:细胞在胰酶处理时被破坏d:溶液或离心管未经RBase去处理反转录成cDNA第一链在20ul体系中，冰上操作，加入11ul总RNA, 1 ul oligo dT 70°c温育10分钟后立即冰浴冷却，继续加入4ul 5 x Buffer, 2ul 核酸抑制剂、2ul IOMm dNTPs ( IOM m/种)，混匀后于42℃保温2分钟，加入1ul( 200U)的反转录酶，42℃继续温育60分钟。
rna提取实验步骤
RNA提取实验步骤如下：
●匀浆处理：
●组织：将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆
仪进行匀浆处理。
●单层培养细胞：直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即
3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。
●细胞悬液：离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107
细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。
加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。
一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。
每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
2-8℃10000×g离心15分钟。
收集上清液。
使用酒精洗涤RNA，以去除离心管内残留的试剂和盐。
最后利用2-甲基硫氰酸盐（MECT）溶液进行脱水，使RNA干燥而不影响RNA的完整性。
此外，如果是从动物组织中提取RNA，还需要使用DNase I处理RNA，以去除残留的DNA。
如果是从细菌中提取RNA，需要先进行细菌的裂解和细胞壁的破碎。
同时需要注意，整个提取过程需要严格控制RNA酶的污染。
Trizol法提取RNA实验步骤
Trizol法使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。
RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、 Tips（RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。
注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品250°C烘烤3小时以上。
四、从组织中提取总RNA1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol 加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。
rna提取具体操作流程
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1. 样品准备。
准备合适的生物样品（例如细胞、组织或血液）。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)
Trizol法使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。
RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、Tips（RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。
注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品250°C烘烤3小时以上。
Trizol法提取RNA
Trizol 法提取RNA实验步骤一、需要的试剂：1.氯仿2.异丙醇3.75%乙醇（in DEPC-treated water)4.RNase free水或者0.5% SDS溶液[准备不含RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC) to 0.01% (v/v)。
静置过夜，然后高压灭菌。
0.5% SDS溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水]1、组织匀浆(1) 取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒入液氮，研碎。
(2) 每50-100mg均浆组织标本中加入1ml的TRIZOL，标本的量不能超过TRIZOL体积的10%，否则会出现DNA污染。
(3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。
2、相分离加入0.2 ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15秒，在15- 30°C放置2-3分钟，然后离心12,000×g，15 minutes ，2 - 8°C。
离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。
RNA只存在于水相中。
水相占总TRIZOL的60%。
3、RNA沉淀将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入0.5ml异丙醇，静置10 minutes ，15 -30°C，然后离心12,000 ×g ，10 minutes，2 - 8°C。
离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。
4、RNA洗涤去上清，加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7,500 ×g ，5 minutes，2 -8°C。
5、RNA再溶解去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心干燥）。
注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。
RNA抽提步骤
RNA抽提步骤第一篇：RNA抽提步骤RNA抽提步骤 DAY one：1、提前一天灭好工具：置180度过夜，根据材料的多少准备工具。
研磨棒、研钵、小勺子，必要时一把小镊子，用锡箔纸包住置180度烘箱中。
2、可以取材料于-70度液氮中冻着。
取时就浸在液氮中（也可以当天取材料当天抽RNA）。
DAY two:1、擦拭超净台，放上各量程的枪；关闭玻璃门，打开紫外灯，照射20分钟；关上紫外灯，打开玻璃门释放里面的臭氧；30分钟后开始做。
2、预冷研钵、研磨棒，倒入材料开始研磨（材料一直在液氮中，注意戴手套口罩）。
3、等液氮即将挥发完时，快速用力研磨。
研磨必须充分，然后装在预冷的1.5mldorf管中。
4、加入tri-zol提取液1ml(先500ul再500ul也可以)，震荡混匀。
5、静置5分钟，加200ul三氯仿手摇晃15秒，室温下静置2-3分钟。
6、2-8° 12000rpm离心15分钟，RNA处于上层约为60%（450ul）。
7、吸上清450ul到另一drof管中，加500ul异丙醇，室温下放10分钟。
8、2-8°12000rpm离心10分钟，弃上清后加1ml 75%乙醇，涡旋，2-8° 7500rpm 5分钟。
9、室温干燥RNA 5-10分钟，将RNA溶于20-40ul DEPC水中，-70°保存。
DAY three:抽的RNA反转录：RT-PCR步骤一、总RNA提取1.取200mg组织，放到1.5ml EP管中，加入1ml Trizol剪碎。
2.震荡30s。
3.加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。
4.12000×g，4℃ 离心，15min。
5.吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。
6.加等体积异丙醇，-20℃，30min。
7.12000×g，4℃ 离心，10min。
在管底部可见微量RNA沉淀 8.弃上清，加75％乙醇1ml，振荡。
(完整版)Trizol法提取RNA实验步骤(可编辑修改word版)
Trizol 法使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。
RNA 质量的高低常常影响cDNA 库，RT-PCR 和Northern Blot 等分子生物学实验的成败。
Trizol 是一种新型总RNA 抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf 管（RNase-free）、Tips（RNase-free）三、准备工作RNase 酶非常稳定，是导致RNA 降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase 完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA 制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase 的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEPC 配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取RNase-free 的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC 使DEPC 的终浓度为0.1%。
注意：DEPC 为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC 水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将DEPC 水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC 水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30 分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品250°C 烘烤3 小时以上。
RNA抽提详细步骤
RNA抽提指南(TRIZOL法)RNA抽提指南(TRIZOL法)注意事项：* 全程佩戴一次性手套。
皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。
培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
* 使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。
例如，使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A 或T1来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品（如自动吸管）可能富含RNA酶。
* 在TRIZOL 中，RNA 是隔离在RNA 酶污染之外的。
而对样品的后续操作会要求用无RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。
玻璃器皿可以在150°C 的烘箱中烘烤4 小时。
塑料器皿可以在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
抽提步骤：1．匀浆化作用通过离心来沉淀细胞后，弃上清，用移液管加TRIZOL试剂反复吹打来裂解细胞至均一通亮的液态后，将匀浆样品在15—30°C 条件下孵育5 分钟以使核蛋白体完全分解。
（每5—10×106的动物细胞，植物或酵母菌细胞或每1×107 细菌加1ml的TRIZOL。
在加入TRIZOL前应避免洗涤细胞因为那样会增加mRNA降解的可能性。
）2．分离阶段每1 mlTRIZOL 加0.2 ml 氯仿。
盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15 秒并将其在30°C 下孵育2—3 分钟。
在2—8°C 下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心15 分钟。
离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。
RNA 无一例外地存在于水样层当中。
水样层的容量大约为所加TRIZOL 容量的60%3．RNA的沉淀将水样层转移到一干净的试管中，通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。
最初均化时的每1 m lTRIZOL 对应0.5 ml 异丙醇。
Trizol法提取RNA实验步骤之令狐文艳创作
令狐文艳Trizol法使用步骤令狐文艳一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。
RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot 等分子生物学实验的成败。
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、 Tips（RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。
注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC 水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品250°C 烘烤3小时以上。
四、从组织中提取总RNA1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg 组织/ml Trizol 加入Trizol ，转入离心管进行第2步操作。
RNA提取标准流程
TRIzol 试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA 。
TRIzol 使样品细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase 抑制剂可保持RNA 的完整性。
在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA 在水相中，取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA。
1 ．经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase 的来源。
2 ．使用灭过菌的RNA 专用塑料制品避免交叉污染。
3 ．RNA 提取过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。
玻璃器皿、塑料制品高压灭菌，然后烘干即可。
4 ．配制溶液应使用无RNase 的水(将水加入处理过不含RNase 的玻璃瓶中，加入DEPC 至终浓度0.05% v/v，充分混匀后37ºC 放置过夜，高压灭菌。
注：DEPC 有致癌之嫌，需小心操作。
)(可保存在-20ºC，用时取出置于冰上)，75%乙醇，无RNase 的水。
所有.溶液均需用0.05% DEPC 处理过的水配制。
10×Loadingbuffer (宝生物工程(大连)有限公司，货号：D603，35 元，1mL×5 支)1 mL、200 μL枪头、小烧杯*3、1.5 mL Eppendorf 管、2 mL Eppendorf 管若干、报纸、卷纸、研钵，以上物品全部需要高压。
研磨+匀浆：将组织在液氮中磨碎，取50~100 mg 组织样品(肝脏可减少样品量到30 mg)放入2 mL 离心管中，织或者小体积的不均一组织可直接称重后匀浆。
每50~100 mg 组织加入 1 mL TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。
样品体积不应超过TRIzol 体积10%。
将匀浆样品在室温(15~30ºC)放置5 min (可延长到15 min)，使核酸蛋白复合物完全分离。
可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖(如肝脏和肌肉中的糖原)或胞外物质 (肌肉) 可于2~8℃ 10000 × g 离心10 min，取上清。
全血RNA提取步骤
Trizol法提取全血总RNA实验前准备:Trizol,氯仿，异丙醇，75％乙醇（用RNase—Free水配制），RNase-Free水，柠檬酸钠抗凝管。
1ml注射器，1。
5、3 ml EP管（DEPC处理过)，大、中、小号枪头（DEPC处理）150~250 ul全血加入10倍体积TRIzol（主要是异硫氰酸胍）（1.5 ml～2。
5 ml），充分吹打混匀，室温静置5min（使核酸蛋白复合物完全分离）。
每1毫升的TRIzol试剂加入200 ul的氯仿（300 ul~500ul），静置3min，离心12000g,4℃，15min。
将上层水相转移到1。
5 ml EP管中，加500 ul的异丙醇，上下颠倒混匀10 s，室温静置10min，离心12000 g，4℃，10 min,弃上清。
加入1 ml的75%乙醇，上下颠倒混匀10 s,离心7500 g，4℃，10 min，弃上清。
室温下干燥5—10 min（充分干燥不好溶解)，加入50 ul的RNase-free-water充分溶解RNA。
分光光度计测OD值。
(取2μl进行电泳，其余-80℃保存？)#加入TRIzol后可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪,多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清.离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。
取澄清的匀浆液进行下一步操作。
▲分光光度计检测质量取出2 ul定量，测量buffer： 10mM TrisCl（pH7.8）。
A260/A280=1.8~2。
1，说明RNA质量可靠；A260/A280〈1。
8，说明有蛋白污染；A260/A280〉2。
1，说明RNA存在降解。
▲电泳检测RNA电泳检测RNA完整性：配制1%的凝胶，上样，120V电泳20min，紫外灯下观察结果，若能看到28S和18S两条带，且亮度约为2：1，说明RNA完整性较好。
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RNA提取
1、将涡虫吸干水分，加入500μl裂解液，55℃水浴裂解1h。
2、加入等体积酚/氯仿（1:1），冰上放置15min。
3、4℃，12000g离心20min，留上清。
4、加入等体积氯仿，4℃，12000g离心5min，留上清。
5、加入0.1倍体积醋酸钠，2.5倍体积无水乙醇，-20℃放置30min。
4℃，12000g 离心20min，去上清。
6、70%乙醇洗涤沉淀，4℃，12000g离心5min，去上清。
7、使沉淀干燥，溶于30μl无RNase污染的去离子水中，-70℃保存或现用。
RT-PCR
将上述制备的RNA 10μl与2μl OligodT（10mmol/l）混合均匀，70℃水浴热激5min。
立即放冰上静置几分钟，然后加入5μl5×RT M-MLV 缓冲液，1μl dNTPs（10mmol/l），1μl RNase 抑制因子(40U/μl)，1μl M-MLV 逆转录酶（50U/μl），加水至25μl。
然后放入PCR仪中进行如下操作：37℃15min，42℃1h，70℃ 15min。
得到的cDNA于-20℃保存。
线虫RNA提取用裂解液：0.5 % SDS，5 % 2-巯基乙醇，10 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris-HCl，0.5 mg/ml蛋白酶K。