DIGE荧光差异双向电泳

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双向电泳技术.

双向电泳技术.

溶的目标:
1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体 完全破坏,从而形成各个多肽的溶解液
(否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使 2-DE中出现新的蛋白点,相应的表示单个 多肽的点的强度会下降)
2、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、 脂类、 多糖和核酸等物质的去除
3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解 状态
大基本支撑技术。
双向电泳 定义
双向电泳 (two-dimensional electrophoresis)是 一种平板电泳技术 ,是等电聚焦电泳和SDSPAGE的组合,即先进行等电聚焦电泳(按照PI 分离),然后再进行SDS-PAGE(按照分子大小), 样品中的蛋白经过等电点和分子质量的两次分离 后,可以得到分子的等电点、分子质量和表达量 等信息。
待研究样本(如临床样本)常是各种细胞和组织混杂,而蛋 白质组研究的通常是单一的细胞类型。
样品处理
一般性原则:样品制备是双向电泳中最为关键的一 步,这一步处理的好坏将直接影响 2-DE 结果。 目前并没有一个通用的制备方法,尽管处理方法 是多种多样,但都遵循几个基本的原则:
1.尽可能的提高样品蛋白的溶解度,抽提最大量的 总蛋白,减少蛋白质的损失;
4、蛋白样品应在等电聚焦前新鲜配制,或80度分装冻存,绝对避免将样品反复冻融。
5、通过超离心去除所有颗粒性物质,因为颗 粒性物质或脂会阻塞凝胶孔路。
6、为了防止蛋白质被修饰,加入尿素后不要 加热蛋白质样品。当样品中含有尿素时绝 对不要超过37度,升高温度会使尿素水解 成异氰酸盐,使蛋白发生氨甲酰化修饰。
双向电泳的基本原理与流程示意
两性电解质
样品
pH 9 -
等点聚焦 (第一向)
聚丙烯酰胺

差异蛋白分析方法

差异蛋白分析方法

差异蛋白分析方法差异蛋白分析是一种用于比较不同样本中蛋白质表达差异的方法。

在生物研究中,差异蛋白质的分析对于理解生物学过程的变化、疾病的发生和发展等具有重要意义。

下面将介绍几种常用的差异蛋白质分析方法。

1. 二维凝胶电泳(2-DE):二维凝胶电泳是一种常用的分离和定量蛋白质的方法。

首先,通过等电聚焦将蛋白质在电泳液中按照等电点(pI)分离出不同pI的谱点,然后,使用SDS-PAGE将蛋白质按照分子量分离出不同大小的谱点。

最后,通过染色或质谱分析技术进行蛋白质的可视化和鉴定。

该方法可以同时分析数千种蛋白质,对于差异蛋白质的筛选具有高通量和分辨率高的优势。

2. 差异凝胶电泳(DIGE):差异凝胶电泳是二维凝胶电泳的改进方法。

该方法利用荧光染料(如CyDye)对两组样本中的蛋白质进行荧光标记,然后将两组样本混合后共同进行电泳分离。

在同一个凝胶上,差异蛋白质的表达差异可以通过荧光信号强度的比较来确定。

相比于传统的二维凝胶电泳,DIGE方法的灵敏度更高,并且能够同时分析多个样本,适用于大规模样品分析。

3. 质谱分析:质谱分析是一种常用的蛋白质鉴定和定量方法。

主要有两种方法:基于质谱仪的定性分析和基于同位素标记的定量分析。

前者通过将蛋白质样品利用质谱仪进行断裂和离子化后,通过质谱图谱与数据库对比鉴定其潜在蛋白质;而后者则通过同位素标记技术(如TMT、iTRAQ等)对两组样品中的蛋白质进行标记,然后将标记样品混合后质谱分析,通过同位素峰的比较来定量差异蛋白质的表达水平。

4. 蛋白质芯片技术:蛋白质芯片是一种高通量和高灵敏度的蛋白质分析方法。

它利用固相支持介质上的已知蛋白质或蛋白质片段(如抗体、寡核苷酸)构建芯片,然后将样品中的蛋白质与芯片上的蛋白质发生特异性结合。

通过对芯片上信号的检测和分析,可以确定蛋白质的表达差异。

蛋白质芯片技术具有高通量、高灵敏度和高特异性等特点,可同时检测上千种蛋白质。

5. 高通量测序技术:高通量测序技术也可应用于差异蛋白质的分析。

荧光差异显示双向电泳技术原理

荧光差异显示双向电泳技术原理

荧光差异显示双向电泳技术原理双向电泳是一种常用的蛋白质分离技术,通过电场的作用将蛋白质样品分离成不同的带状区域。

而荧光差异显示双向电泳技术则是在双向电泳的基础上,利用荧光染料对蛋白质进行标记,使得分离出的蛋白质带状区域能够以荧光的形式显示出来。

本文将详细介绍荧光差异显示双向电泳技术的原理及其在蛋白质研究中的应用。

荧光差异显示双向电泳技术的原理主要包括样品制备、电泳分离、荧光染色和荧光成像等步骤。

样品制备是荧光差异显示双向电泳的关键步骤之一。

样品制备的目的是将蛋白质从复杂的生物体中提取出来,并使其具备较好的电泳性质。

常见的样品制备方法包括胶束电泳法和硅胶柱层析法等。

胶束电泳法是通过洗涤剂将蛋白质从细胞中溶解出来,形成胶束溶液,再经过离心等步骤得到纯化的蛋白质样品。

硅胶柱层析法则是利用硅胶柱将蛋白质样品分离纯化,去除杂质。

样品制备的关键在于保证蛋白质样品的纯度和完整性,以便后续的电泳分离。

电泳分离是荧光差异显示双向电泳的核心步骤。

电泳分离是通过电场的作用将蛋白质样品分离成不同的带状区域。

由于蛋白质的分子量和电荷差异,蛋白质在电场中会产生不同的迁移速度,从而实现分离。

双向电泳是指在水平方向和垂直方向施加交叉电场,使得蛋白质样品能够同时在两个方向上进行迁移,从而增加了分离效果。

电泳分离的关键在于电场的施加和控制,以及电泳胶的选择和制备。

然后,荧光染色是荧光差异显示双向电泳的重要步骤之一。

荧光染色是通过将蛋白质样品与荧光染料结合,使得分离出的蛋白质能够以荧光的形式显示出来。

常用的荧光染料包括SYPRO Ruby、CyDye和FluorProtein等。

荧光染色的关键在于染料的选择和染色条件的优化,以确保荧光信号的强度和稳定性。

荧光成像是荧光差异显示双向电泳的最后一步。

荧光成像是通过荧光成像仪将荧光信号转化为图像,以便后续的分析和解读。

荧光成像的关键在于成像仪的选择和参数设置,以及荧光信号的采集和处理。

荧光差异显示双向电泳技术在蛋白质研究中具有广泛的应用。

二维荧光差异凝胶电泳系统部分

二维荧光差异凝胶电泳系统部分

二维荧光差异凝胶电泳系统部分二维荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)系统是蛋白质组学中常用的技术之一,它能够检测和比较不同样品之间蛋白质表达的差异。

以下是二维荧光差异凝胶电泳系统部分的主要内容:1. 实验设计:2D-DIGE系统通常用于比较两个或多个不同样品之间的蛋白质表达差异。

在进行实验设计时,需要考虑样品的来源、处理条件、实验重复次数等因素,以确保实验结果的可靠性和准确性。

2. 样品制备:在2D-DIGE系统中,样品的制备是关键步骤之一。

通常需要将样品进行预处理,如去除杂质、减少盐分等,以提高蛋白质提取和分离的效果。

同时,还需要对样品进行标记,以便在后续的凝胶电泳中对其进行追踪和分析。

3. 一维电泳:在一维电泳中,样品被分离成不同的蛋白质条带。

这个过程通常使用等电聚焦电泳系统进行,可以将不同电荷和分子量的蛋白质分离开来。

在一维电泳结束后,需要对凝胶进行染色和图像分析,以确定每个条带的性质和相对表达水平。

4. 二维电泳:在二维电泳中,不同样品之间的蛋白质条带被进一步分离成更小的蛋白质斑点。

这个过程通常使用双向电泳系统进行,可以根据蛋白质的等电点和分子量对其进行分离。

在二维电泳结束后,需要对凝胶进行荧光染色和图像分析,以确定每个斑点的性质和相对表达水平。

5. 数据分析:通过对2D-DIGE图像进行分析,可以获得不同样品之间蛋白质表达的差异数据。

这些数据可以进行多种分析方法,如统计学分析、聚类分析等,以寻找差异表达的蛋白质点并对其功能进行注释和分类。

同时,还可以利用这些数据探索疾病发生机制、药物作用靶点等生物学问题。

6. 应用领域:2D-DIGE系统在生物学、医学、农业等领域都有广泛的应用。

例如,可以用于研究肿瘤细胞与正常细胞之间蛋白质表达的差异、药物对细胞生长和凋亡的影响等。

此外,2D-DIGE技术还可以与其他蛋白质组学技术结合使用,如质谱分析、蛋白质相互作用研究等,为生物医学研究提供更深入的信息。

2D-DIGE

2D-DIGE

百泰派克生物科技
2D-DIGE
2D-DIGE(Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis)即双向荧光差异电泳技术,是由经典的双向电泳(2-DE)技术发展而来的荧光标记的定量蛋白质组学技术。

其基本原理与2-DE一致,都是利用蛋白质的电荷差异以及
相对分子质量差异来实现蛋白混合物的分离。

2D-DIGE技术与2-DE技术的不同之
处在于荧光标记,进行2D-DIGE之前,先将蛋白混合物利用三色荧光染料(如Cy2、Cy3和Cy5)进行荧光标记,电泳后通过成像技术分析蛋白表达量的丰度变化,可
同时对成百上千种蛋白进行分离并实现不同样本蛋白质含量的精确鉴定。

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合nanoLC-MS/MS纳升色谱,提供2D-DIGE电泳服务技术包裹,可对各种蛋白样本进
行分离和精确定量,欢迎免费咨询。

DIGE实验步骤

DIGE实验步骤
DIGE实验步骤
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DIGE实验步骤
• • • • • • • • 一、DIGE实验原理及流程 二、DIGE双向电泳样本制备 三、DIGE双向电泳样本标记 四、第一向电泳—IEF电泳 五、胶条平衡 五、第二向电泳—SDS-PAGE电泳 六、图片扫描 七、DIGE荧光图片分析
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二、DIGE双向电泳样本制备 双向电泳样本制备
Alklysis buffer(LB) Reagent Tris Thiourea (FW 76.12) Urea (FW 60.06) CHAPs (FW 64.89) Phenol extraction buffer Reagent Sucrose (FM 342.30) KCl(FM 74.55) EDTA(FM 292.25) Tris(FM 121.14) HCl 醋酸铵甲醇溶液Ammonium 醋酸铵甲醇溶液Ammonium acetate in methanol Final concentration 0.7M 0.1M 50mM 0.5M To pH7.5 Final concentration 20mM 2M 7M 2%(W/V)

四、第一向电泳—IEF电泳
• 1:IEF上样蛋白质准备 IEF上样蛋白质准备 每根胶条的上样液的成分为:三管标记的蛋白质(cy2,cy3,cy5)、1%DTT、1%IPG Buffer、 1×溴酚蓝、LB调制最终体积至460μL。将样品溶液混合均匀后,4℃ 12000r/min,离心20min, 吸取上清液450μL进行泡胀。 2:上样 取出水化盘,在底下铺上白色纸巾(方便观察胶条泡胀情况),调节水平备用。从冰箱取出 干胶条复温(如不复温胶条会吸潮)。吸取离心后的样品上清液加到水化盘的槽中,450μL样 液可分3枪加入,第一二枪每枪吸160μL,从槽顶端开始,沿左右边缘加入,将样液加成一条细 线,长约22cm,第三枪吸至管中样液剩余20μL左右即可,加至槽的顶端,将顶端部分覆盖满。 调节室内温度为20℃,让胶条泡胀过夜(10~12h), 3:等点聚焦(IEF) 等点聚焦( 等点聚焦(IEF),等电聚焦程序为:S1 stp 300V 0:45Hr S2 stp 700V 0:45Hr S3 stp 1500V 1:30Hr S4 grd 9000V 3:00Hr S5 stp 9000V 4:00Hr 整个聚焦过程所用总电压:52KVh 4:胶条保存 跑完等电聚焦以后,取出胶条,吸干表面的覆盖油,胶面朝上将胶条放入平衡管中,胶条应 置于-20℃保存。如果需要运输,则要用冰完全包埋平衡管保温。 •

双向电泳的概念和原理

双向电泳的概念和原理

双向电泳的概念和原理双向电泳是一种应用在生物和化学实验中的分子电泳技术,它能够将完整的分子进行分离,从而实现提取特定的分子组份。

一、双向电泳的概念双向电泳是一种分子技术,它能够将分子分开并且分离出它们内部的活性组分。

利用电泳技术,可以把一些我们有利用价值的分子聚集到集簇中,把其它不要的环境分子分离出去。

通常情况下,电泳是通过具有某种特殊电势的电流来将分子分离的。

由于双向电泳技术,可以利用液相层析原理,将不同的分子聚集到不同的集簇中,从而把其它的不需要的或者有害的分子挤出去。

二、双向电泳的原理双向电泳的原理是利用电流来将分子进行分离,因此在实践过程中,首先需要构建一个体系,在该体系中,利用某种特殊的电流,生成一种能够将分子分解的条件。

首先,将样品加入到某种带有类似电流的环境中,当样品中的分子接触到了这种带有电流的环境,就会形成一种吸引力,从而使分子受到电流的作用,接着分子中的活性组分也会朝着电流的方向而移动。

而由于这种电流的作用,活性组分会被吸引到这种电流的反方向,使得活性组分能够从样品中分离出来,这就是双向电泳的原理。

三、双向电泳的应用双向电泳技术在生物和化学实验中都有广泛的应用,在蛋白质纯化实验、肽段分离实验等实验中,都可以利用双向电泳技术实现分子的精确分离。

此外,双向电泳技术在疾病的早期筛查中也可以发挥着重要的作用,比如癌症的筛查,可以利用双向电泳技术来检测出肿瘤细胞中的活性组分,为早期筛查提供重要的依据。

四、双向电泳的优势双向电泳技术有着诸多优势,首先,双向电泳技术具有准确性高的优势,可以把不同组分的分子成功地分离出来;其次,双向电泳技术操作简单,可以节省大量的实验时间;最后,双向电泳技术可以把活性分子完美的纯净,大大提高了实验的效率。

总之,双向电泳是一种广泛应用的分子技术,它能够把完整的分子进行分离,从而实现提取特定的分子组份。

双向电泳技术实用性强,可以应用在生物和化学试验中,为后续实验提供重要的依据和有效的结果。

2D-DIGE(荧光差异双向电泳)

2D-DIGE(荧光差异双向电泳)
2-D DIGE
杨华丽
November 12th, 2015
Contents
1
2-DE
2
2-D DIGE
3
Experiment
4
2-D DIGE video
1. 2-DE
1. 2-DE
1. 2-DE
2. 2-D DIGE
荧光差异双向电泳技术(two dimension difference gel electrophoresis, 2D-DIGE)
2. 2-D DIGE
2. 2-D DIGE
2. 2-D DIGE
2. 2-D DIGE
2. 2-D DIGE
2. 2-D DIGE
2. 2-D DIGE
2. 2-D DIGE
Virtual elimination of gel:gel variation is induced biological change with statistical accuracy capable of revealing differences in abundance
11 2 3 4 5 6
2. 2-D DIGE
3. experiment
3. experiment
3. experiment
3. experiment
3. experiment
3. experiment
3. experiment
3. experiment
3. experiment
2D-DIGE技术是一种新出现的荧光标记的定量蛋 白质组学技术,它比经典的2-DE具有更高的动力 学范围和灵敏性,是2-DE技术的成熟与完善。它 通过三色荧光染料分别对内标和生物样本进行标 记,能够在一张2D胶上对两个样本的多种蛋白质 进行分离,并分别单独成像,应用DeCyder 2D 软件分析图像,得到蛋白表达量的丰度变化,根 据数据分析结果准确地发现差异蛋白。常规可检 测到小于10%的蛋白表达差异而同时统计学可信 度达到95%。

双向凝胶电泳中三种蛋白质检测方法的比较

双向凝胶电泳中三种蛋白质检测方法的比较

ISS N 100727626C N 1123870ΠQ中国生物化学与分子生物学报Chinese Journal of Biochemistry and M olecular Biology2004年8月20(4):551~556收稿日期:2003207209,接受日期:2003209224国家自然科学基金资助项目(N o.30271617)3联系人 T el :(010)66932211,Fax :(010)66932211,E 2mail :sqwang @马增春,男,1970年12月生,博士研究生Received :July 9,2003;Accepted :September 24,2003Supported by National Natural Science F oundation of China (N o.30271617)3C orresponding author T el :(010)66932211,Fax :(010)66932211,E 2mail :sqwang @・技术与方法・双向凝胶电泳中三种蛋白质检测方法的比较马增春, 高 月, 吕俊萍, 王升启3(军事医学科学院放射医学研究所,北京 100850)摘要 高通量双向电泳是蛋白质组学的核心,双向电泳凝胶上蛋白质点的检测方法应具有灵敏度高、线性范围宽和兼容质谱鉴定等优点.采用差异凝胶电泳(difference gel electrophoresis ,DIGE )技术以Cy3(12(52carboxypentyl )21′2propylindocarbocyanine halide N 2hydroxysuccinimidyl ester )和Cy5(12(52carboxypentyl )21′2methylindodicarbocyanine halide N 2hydroxysuccinimidyl ester )荧光分别标记正常和T NF 2α处理细胞的蛋白质,用Cy2(32(42carboxymethyl )phenylmethyl )23′2ethyloxacarbocyanine halide N 2hydroxysuccinimidyl ester )荧光标记正常和T NF 2α处理细胞蛋白质的等量混合样品作为内标,混合3种荧光标记的蛋白质后,在同一等电聚焦胶条进行聚焦,然后在聚丙烯酰胺凝胶上进行第二向电泳,用3种波长的激光激发扫描得到凝胶图象,DIGE 中多个样品在同一条件下电泳,因而匹配率高,且引入内标使蛋白质点的检测与定量更为准确.DIGE 技术与质谱相结合,实现了高通量和相对准确定量.与硝酸银和考马斯亮蓝染色结果相比较,DIGE 技术具有灵敏度高、线性范围宽和不影响后续质谱鉴定等优点.关键词 荧光标记,双向电泳,图象分析,蛋白质组学中图分类号 Q503Comparison of Three Protein Detect Methods in Tw o 2DimensionalG el E letrophoresisM A Z eng 2chun ,G AO Y ue ,L ΒJun 2ping ,W ANG Sheng 2qi3(Institute o f Radiation Medicine Sciences ,Academy o f Military Medical Sciences ,Beijing 100850,China )Abstract There is an increasing use of tw o 2dimensional gel electrophoresis (2D 2gel )in the proteomics.The22D gel is characterized with higher sensitivity ,linear dynamic ranges and g ood reproducibility.This method isbased on the principle :(1)Normal or T NF 2αtreated protein is labeled with Cy3(12(52carboxypentyl )21′propylindocarbocyanine halide N 2hydroxysuccinimidyl ester )and Cy5(12(52carboxypentyl )21′methylindocarbocyanine halide N 2hydroxysuccinimidyl ester ),and then the mixer of normal and T NF 2αtreated cellular protein is labeled with Cy2(32(42carboxymethyl )phenylmethyl )23′2etyloxacarbocyanine halide N 2hydroxysuccinimidyl ester )as an inner standard.(2)A fter these fluorescence 2labeled proteins are mixed together ,sam ples are running on a same 22D gel using a method referred to a different gel electrophoresis (DIGE ).(3)Images of the 22D gels are obtained using three different excitation filters.The ratio of the different colored fluorescent signals are used to distinguish the different proteins in the sam ple.C om pared with traditional methods such as staining with AgNO 3or C oomassie blue ,the method DIGE has a higher matching rate and m ore accurate result.K ey w ords fluorescent labeling,tw o2dimensional gel electrophoresis,image analysis,proteomics 基因组学在疾病和药物的研究中取得巨大进步,但以基因表达谱为基础的研究与应用有很大局限,这是因为蛋白质是生命活动的直接体现者,由mRNA水平变化并不能推测到蛋白质的变化[1].蛋白质组是指由一个基因组或一种细胞、组织表达的所有蛋白质[2].蛋白质组研究的技术路线主要是高通量双向电泳进行蛋白质的分离,再用专业计算机软件进行图象分析,然后通过质谱技术及蛋白质数据库信息对凝胶上的蛋白质进行分析和鉴定[3].分离后的蛋白质需要染色而检测,银染灵敏度高,在窄线性范围内可半定量,因戊二醛影响不能做质谱鉴定.考马斯亮蓝R2250染色线性范围宽,灵敏度低而不能检测到低丰度蛋白质,染色后不影响质谱鉴定.三色荧光标记DIGE(differential gel electrophoresis)技术的原理为Cy3和Cy5分别标记A和B两个不同样品,Cy2标记A和B的各一半样品,然后混合在同一等电聚焦胶条和聚丙烯酰胺凝胶上电泳,用3种波长的激光激发扫描得到凝胶图象,原理见Fig.1.荧光染色与硝酸银、考马斯亮蓝染色结果相比较,克服了硝酸银染影响质谱鉴定和考马斯亮蓝染色灵敏度低的缺点[4].本实验旨在对双向电泳中3种蛋白质检测方法的灵敏度、匹配率和准确性等特点作一比较.Fig.1 Outline of the basic DIGE technique(when used with three fluors and a single gel)1 材料与方法111 材料11111 试剂 CH APS,Pharmalyte3210,IPG缓冲液、丙烯酰胺(acrylamide),甲叉双丙烯酰胺(methylenebisacrylamide)等双向电泳试剂均购自Amersham pharmacia公司.DNA和RNA酶购自Sigma公司,蛋白质酶抑制剂(Protease inhibitor cocktailtablets),胰酶(Trypsin)购自R oche公司.蛋白质定量标准(Albumin standard)Pierce公司.CyDye DIGE fluor(Cy T M2,Cy T M3,Cy T M5),二甲基甲酰胺、赖氨酸购自Amersham pharmacia公司.考马斯亮蓝R2250、考马斯亮蓝G2250购自AMRESC O公司.DME M培养液,胎牛血清购自GI BC O公司,肿瘤坏死因子T NF2α购自Sigma公司.11112 仪器 Amersham pharmacia公司蛋白质学研究配套仪器:IPG phor等电聚焦仪,Ettan DA LTsix二向垂直电泳仪,MultiT em pⅢ温控循环水浴,Process or Plus Base Unit全自动染色仪,Image Scanner扫描仪,Imagemaster2D Elite图象分析软件,Imagemaster2D Database数据库软件,T yphoon9410扫描仪,Decyder Differential in2gel Analysis Version 4.00106和Biological Variation Analysis图象分析软件.分光光度计DU640来自美国Beckmen coulter.255中国生物化学与分子生物学报20卷112 方法11211 样品制备 人脐静脉血管内皮细胞贴壁80%后,加入2.5ngΠml的T NF2α作用6h后,胰酶消化细胞,用DME M培养液中和胰酶,收集细胞离心,用磷酸盐缓冲液洗涤两次,加入蛋白质酶抑制剂和细胞裂解液(8m olΠL尿素,4%CH APS,40mm olΠL Tris),液氮冻融3次,加入RNA酶和DNA酶消化核酸,离心(12000g,30min)收集上清,得到细胞总蛋白质.11212 蛋白质含量测定 将蛋白质定量标准(Albumin standard)梯度稀释后用考马斯亮蓝G2250染色,波长595nm测定吸收度,做标准曲线.样品稀释100倍测定浓度.11213 荧光标记蛋白质 将Cy2,Cy3,Cy5从220℃取出,室温放置5min,加入25μl二甲基甲酰胺,涡旋混匀30s,离心(12000g,30s),取出2μl加入到3μl二甲基甲酰胺中,配制成工作液.将蛋白质样品调节pH为8.5,正常细胞蛋白质100μg用2μl Cy3标记,T NF2α处理细胞的蛋白质100g用2μl Cy5标记,正常细胞和T NF2α处理细胞的蛋白质各50μg混匀后用2μl Cy2标记,冰浴中反应30min,加入2μl赖氨酸(10mm olΠL)中和未反应的荧光,冰浴10min,加入相同体积的2倍缓冲液(8m olΠL尿素、2%Pharmalytes3210、2%DTT、4%CH APS),冰浴10 min,然后加入DTT和IPG缓冲液制成450μl的一向等电聚焦体系[5].11214 第一向等电聚焦 分别取正常和T NF2α处理细胞的蛋白质制成一向等电聚焦体系.采用胶内泡涨方法,样品和泡涨液(8m olΠL尿素、2%CH APS、20mm olΠL DTT、0.5%IPG缓冲液、痕量溴酚蓝)共450μl,揭下IPG胶条的保护膜,胶面向下,先将IPG 胶条尖端朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中,慢慢下压胶条,并前后移动,避免生成气泡,最后放下IPG胶平端,使溶胀液浸湿整个胶条,从IPG胶条两侧加入Imm obiline DryStrip覆盖油,盖上盖子.将胶条槽放置于等电聚焦上,注意电极接触良好,设置等电聚焦参数:30V,12h;200V,1h;500V,1h; 1000V,1h;8000V,9h.第一向等电聚焦结束时参数为:38μA,78000VhrS[6].11215 第二向S DS凝胶电泳 IPG胶条平衡2次,每次15min.平衡缓冲液包括6m olΠL尿素和30%甘油,可减少电内渗,有利于蛋白质从第一向转移到第二向的转移.第二次平衡步骤中加入260mm olΠL碘乙酰胺,以除去多余的DTT.平衡后的胶条用去离子水润洗后,将胶条的边缘置于滤纸上几分钟,以除去多余的平衡缓冲液.将IPG胶条小心的放置于第二向制好的S DS胶上,并轻压使IPG胶条与S DS胶充分结合,注意胶面之间不能有气泡,用0.5%琼脂糖封顶,进行二向电泳,二向电泳参数为:80mA,40 min;调至120mA,到溴酚蓝染料迁移到胶的底部边缘结束电泳.11216 考马斯亮蓝染色 考马斯亮蓝染色液(011%考马斯亮蓝、50%甲醇、10%冰醋酸)染色6h,考马斯亮蓝脱色液(25%乙醇、8%冰醋酸)脱色12h.11217 硝酸银染色 固定液(乙醇40%、冰醋酸10%)中固定30min,增敏液(乙醇30%、戊二醛1125%、硫代硫酸钠0.2%、醋酸钠6.8%)中反应30 min,双蒸水冲洗3次,每次5min,在硝酸银染色液(硝酸银2.5%、甲醛0.4%)中温育20min,双蒸水冲洗2次,每次1min,显色液(碳酸钠2.5%、甲醛0.2%)中显色2min,立即用1.5%乙二胺四乙酸的终止液终止反应.双蒸水冲洗3次,每次5min,用20%的甘油保存液保存[7].11218 凝胶扫描分析 考马斯亮蓝或硝酸银染色的凝胶用Image Scanner扫描仪扫描,Imagemaster2D Elite4.01图象分析软件,Imagemaster2D Database数据库软件分析电泳结果.荧光标记的凝胶用T yphoon 9410扫描仪扫描,设定PMT值为600,用Decyder Differential in2gel Analysis Version4.00.06和Biological Variation Analysis图象分析软件分析电泳结果,蛋白质点选择的标准为峰斜度小于1.30,峰面积大于270,峰高度大于940.2 结果211 双向电泳中3种蛋白质检测方法的结果比较3种荧光均标记一次提取的正常细胞蛋白质提取样品,标记量为100μg,结果分析Cy2检测点为1063,Cy3检测点为1073,Cy5检测点为1092,Cy2与Cy5的匹配率为94%,Cy2与Cy3的匹配率为96%,考马斯亮蓝染色的凝胶上样量为1mg,一次电泳两块胶检测到的蛋白质点分别为945、916,匹配率为85%.硝酸银染色的凝胶上样量为200μg,一次电泳两块胶检测到的蛋白质点分别为976、967,匹配率为82%.荧光(Cy2、Cy3、Cy5)经过修饰均带有一个正电荷和相同的分子量,其活性反应基团与赖氨酸的ε氨基进行反应,标记后的蛋白质在同一个等电聚焦胶条上电泳,然后将等电聚焦胶条转移到聚丙烯酰胺凝胶上,二向结束后,用488nm、532nm和355第4期马增春等:双向凝胶电泳中三种蛋白质检测方法的比较 635nm 3种波长的激发光进行扫描.3种荧光标记的相同蛋白质在凝胶上表现为一个蛋白质点,所以蛋白质点的匹配率高.双向电泳中硝酸银和考马斯亮蓝染色时,需要在多条等电聚焦胶条上进行第一向聚焦,然后在多块聚丙烯酰胺凝胶上进行第二向电泳,因而在两块以上的凝胶之间进行匹配率比较,其蛋白质点的匹配率降低.双向电泳中3种蛋白质检测方法的扫描结果见Fig.2.Fig.2 C om parision of cell proteins visualised by fluorescence ,colloidal C oomassie blue and silver stainingAll gels ,pH 3-10,100μg and 200μg protein ,were loaded on fluorescence ,colloidal C oomassie blue and silver staining gels ,respectively212 三种蛋白质检测方法在差异蛋白质表达谱中的结果分析用Cy3荧光标记正常细胞的总蛋白质,用Cy5荧光标记T NF 2α(2.5ng Πml )处理的细胞总蛋白质,将正常与T NF 2α处理细胞蛋白质的各一半混合用Cy2荧光标记.双向电泳后扫描分析找到可能有意义并且与考马斯亮蓝和硝酸银染色相重复的差异蛋白质,Fig.3所示,T NF 2α处理细胞中1~4号蛋白质点与正常细胞相比分别升高:4105、1169、3162、3145倍,5、6号点则分别降低1169、1171倍.DIGE 中以Cy2为内标计算比值,即Cy3ΠCy2与Cy5ΠCy2的比值,软件分析认为变化比值大于115可能有真实性变化.实验中找到的差异蛋白质点不多,可能T NF 2α的浓度较低所致,但找到的差异蛋白质均是蛋白质丰度较低的蛋白质点.213 荧光标记凝胶用考马斯亮蓝染色结果荧光标记凝胶找到的差异点可以进行质谱鉴定,但荧光标记凝胶在可见光下不能看到蛋白质点,可以用SY PRO Ruby 再染色,SY PRO Ruby 染色的凝胶图像与Cy 凝胶图像极易匹配,这是因为它们是同一凝胶上蛋白质点的标记,然后在紫外下进行切胶、胶内酶切与质谱鉴定.也可以用考马斯亮蓝染色,如Fig.4所示,考马斯亮蓝染色可以找到荧光标记凝胶上的大部分蛋白质点.3 讨论双向凝胶电泳(tw o 2dimensional gelelectrophoresis ,22DE )的基本原理是蛋白质首先根据其等电点在pH 梯度胶中等电聚焦,然后按照分子量的大小进行S DS 2PAGE 第二次电泳分离.22DE 可最大程度的分离蛋白质,分离的蛋白质点可全面分析,因而22DE 成为蛋白质组研究的核心.分离后的455中国生物化学与分子生物学报20卷Fig.3 22D electrophoresis pattern of cell extracts from ECV304cell line (A )and T NF 2αtreated cells (B )S pots found to be differential ex pressed have been ann otated.T hree dimension pattern of differential ex pressed spots that circled by red curve were pictured in (C)Fig.4 22D electrophoresis pattern of fluorescence (A )and colloidal C oomassie (B )22D electrophoresis gel were scanned ,after that stained by colloidal C oomassie555第4期马增春等:双向凝胶电泳中三种蛋白质检测方法的比较 蛋白质需要染色而检测,银染检测限为015~112 ng,在窄线性范围内可半定量,但因银的氧化而不能做质谱鉴定.考马斯亮蓝R2250染色线性范围宽,染色后不影响质谱鉴定,但不能检测到低丰度蛋白质.考马斯亮蓝或硝酸银染色后的凝胶必须利用图象分析软件才能正确分析,分析过程包括:图形处理、斑点检查与量化、背景过滤、22DE匹配与比较、构造合成凝胶以及统计分析等.因为样品制备、电泳条件、凝胶染色等无法完全一样,在用软件来控制蛋白质斑点的中心和边缘的界定时仍有人为因素,因此必须慎重下结论[9].将三色荧光标记蛋白质组学技术与硝酸银和考马斯亮蓝染色的技术相比较发现:Cy标记的双向电泳凝胶灵敏度高,可检测到低丰度蛋白质,在疾病的发病机制和新药药理毒理中,起作用的蛋白质往往是低丰度蛋白质.三色荧光标记蛋白质在同一块胶上进行电泳,实验具有较好的重复性.当进行多样本检测时,以Cy2来标记所有样品中的蛋白质为内标,每块凝胶中Cy2标记样品均为所测样品的等量混合物,如两个样品则均为1Π2的混合,3个样品则为1Π3的混合,依次类推,理论上在一块凝胶上所有样品蛋白均有Cy2来标记,胶内对Cy2标记点进行匹配,匹配率可达100%,将结果以Cy2为内标计算比值,即Cy3ΠCy2与Cy5ΠCy2的比值,然后作统计分析,这样避免了胶与胶之间的误差,可反映蛋白质的真实改变程度,降低了假阳性或假阴性,硝酸银和考马斯亮蓝染色凝胶中没有内标,无法避免胶与胶之间的误差.三色荧光凝胶扫描后,用Decyder Differential in2gel Analysis Version4.00.06和Biological Variation Analysis图象分析软件可进行三维图象分析,仪器和软件自动进行图形处理、斑点检查与量化、背景过滤、22DE匹配与比较、构造合成凝胶以及统计分析等.中间没有人为因素的干扰并且实现高通量和实验的准确性.荧光标记蛋白质不影响后续的蛋白质鉴定.DIGE技术应用在研究中已发现一些有意义的差异蛋白质[10],但未有3种蛋白质检测方法比较且用三维图象进行扫描结果分析的研究报道.在3种蛋白质的检测方法中,硝酸银染色适合确定蛋白质点的有无,考马斯亮蓝R2250染色适合目标蛋白质为高丰度且样品量大的情况,DIGE因为荧光与蛋白质定量结合,在同一凝胶下电泳和后期PMT扫描和三维图象分析的自动化等特点,保证了蛋白质检测的灵敏度和准确度,DIGE技术适合用于差异蛋白质表达谱的分析.在荧光标记中有以下注意问题:CyDye DIGE fluor与赖氨酸的ε氨基进行反应,在提取总蛋白质加入溶液时不应有Pharmalytes 和DTT等含有伯氨基的试剂,Tris的浓度控在40 mm olΠL以下.溶解和稀释荧光所用的二甲基甲酰胺的纯度必须大于99.8%,二甲基甲酰胺易降解产生氨基化合物.荧光标记中荧光与蛋白有严格的比例,蛋白质与荧光的比例为100μg∶800pm ol.荧光只与样品中5%的蛋白质进行反应,保证不同蛋白质只与相同荧光的一个分子反应,比例高灵敏度下降,比例低则导致一个蛋白被标记多个荧光分子.95%未标记蛋白与标记蛋白分子量只差464,在1215%的聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现为一个点.参考文献(R eferences)1 Flory M R,G riffin T J,M artin D,Aebers old R.Advances in quantitative proteomics using stable is otope tags.Trends Biotechnol, 2002,20(12):23~282 Hum phery2Smith I,C ordwell SJ,Blackstock W Pl.Proteome research: com plementarity and limitations with respect to the RNA and DNA w orlds.Electrophoresis,1997,18:1217~12423 R ohiff C.Proteomics in m olecular medicine:Applications in central nerv ous systems dis orders.Electrophoresis,2000,21:1227~12344 Patton W.A thousand points of light:The application of fluorescence detection technologies to tw o2dimensional gel electrophoresis and proteomics.Electrophoresis,2000,21:1123~11445 T onge R,Shaw J,M iddleton B,R owlins on R,Rayner S,Y oung J, P ognan F,Hawkins E,Currie I,Davis on M.Validation and development of fluorescence tw o2dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology.Proteomics,2001,1:377~396 6 G org A,Obermaier C,Boguth G.Recent developments in tw o2 dimensional gel electrophoresis with imm obilized pH gradients:wide pH gradients up to pH12,longer separation distances and simiplified procedures.Electrophoresis,1999,20:712~7177 H ochstrasser D F,Harrington M G,H ochstrasser A C,M iller M J, M erril C K.M ethods for increasing the res olution of tw o2dimensional protein electrophoresis.Anal Biochem,1988,173:424~4358 K lose J.G enotypes and phenotypes.Electrophoresis,1999,20:643~652 9 Vihinem M.Bioin formatics in proteomics.Biomol Engineering,2001, 18:241~24810 Hu Y,W ang G,Chen G Y,Fu X,Y ao S Q.Proteome analysis of Saccharomyces cerevisiae under metal stress by tw o2dimensional differential gel electrophresis.Electrophoresis,2003,24(9):1458~1470655中国生物化学与分子生物学报20卷。

蛋白质的双向电泳

蛋白质的双向电泳

分子量 提取的总蛋 白溶液 小 通过双向电泳使得不同等电点和分子量的 蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同 位置从而实现蛋白质的双向分离
2DE图谱
硝酸银染色图谱 考马斯亮蓝染色图谱
双向电泳(DIGE)示意图
样品1: Cy3标记 将标记的 样品混合 样品2: Cy5标记
双向电泳分离
荧光扫描仪扫描ຫໍສະໝຸດ 图像重叠分析蛋白质双向电泳
蛋白质组学(proteomics)

概念:是从整体角度分析生物体蛋白质组动 态变化的一门科学 研究内容:蛋白质的识别、定量;蛋白质的 定位、修饰;蛋白质之间的相互作用并根据 这些研究最终确定它们的功能

技术流程
提出 生物学问题 实验组和对照组 样品制备 凝胶图像分析
双向电泳(2DE/DIGE)
胶条平衡


等电聚焦结束后进行SDS-PAGE电泳 之前需进行胶条平衡,以便于被分离 的蛋白质与SDS充分结合,保证SDSPAGE电泳的顺利进行 步骤:一般采用两步平衡法,用含 SDS、DTT、尿素和甘油等的缓冲液 先平衡一次,再用碘乙酰胺取代DTT 后再平衡一次
SDS-PAGE电泳

使得蛋白质按照分子量的大小不同而 分离,与普通SDS-PAGE相似 在双向电泳系统中无需浓缩胶,因为 第一向等电聚焦已经使得蛋白得到浓 缩
DIGE图谱
样品制备

双向电泳的最关键步骤之一
制备原则:尽可能多地提取出总蛋白质, 尽可能简单的操作步骤,注意防止样品 提取过程中的各种化学修饰,去除样品 中核酸、盐离子等干扰物质。

等电聚焦



通过10000V高压使得蛋白质按照其等电 点特性进行聚焦 步骤:胶条水化、低压除盐、高压聚焦、 低压维持 聚焦时间:聚焦时间太短,会导致水平 和垂直条纹,过长会造成蛋白图谱变性, 在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢 失。最佳时间的确定需要根据蛋白样品 类型、蛋白载样量、PH范围和胶条长度 来确定。

蛋白质组学技术原理及操作步骤

蛋白质组学技术原理及操作步骤

蛋白质组学技术原理及操作步骤(immobilized pH gradient, IPG)凝胶,根据蛋白质电荷差异分离出不同pI值的蛋白质带,再将此胶条置于含SDS的聚丙烯酰胺凝胶上,根据蛋白质分子量而加以分离。

目前,一般通过此法可以分离得到1000~3000个蛋白质样品,多时可以分离得到11000个蛋白质样点,分辨率可达到ng级。

新近出现的差异凝胶电泳是2D-PAGE的一大革新,DIGE可选用不同的荧光染料在同一块2D凝胶内标记不同蛋白质,为更好地分离蛋白质提供了条件。

1、双向凝胶电泳双向凝胶电泳的原理是*向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离,第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离,把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。

由于双向电泳技术在蛋白质组与医学研究中所处的重要位置,它可用于蛋白质转录及转录后修饰研究,蛋白质组的比较和蛋白质间的相互作用,细胞分化凋亡研究,致病机制及耐药机制的研究,疗效监测,新药开发,癌症研究,蛋白纯度检查,小量蛋白纯化,新替代疫苗的研制等许多方面。

近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的有使用价值的核心方法。

2、电喷雾质谱(ESI-MS)ESI- MS是利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电,在N2气流的作用下,液滴溶剂蒸发,表面积缩小,表面电荷密度不断增加,直至产生的库仑力与液滴表面张力达到雷利极限,液滴爆裂为带电的子液滴,这一过程不断重复使终的液滴非常细小呈喷雾状,这时液滴表面的电场非常强大,使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子形式进入质量分析器。

ESI-MS从液相中产生离子,一般说来,肽段的混合物经过液相色谱分离后,经过偶联的与在线连接的离子阱质谱分析,给出肽片段的的氨基酸序列,但是分析时间一般较长。

3、等电聚焦等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。

双向电泳法

双向电泳法

双向电泳法双向电泳法(Bidimensional Electrophoresis,2-DE)是一种常用的蛋白质分离技术,可以同时分析样品中上千种蛋白质。

本文将详细介绍双向电泳法的原理、步骤和应用。

原理双向电泳法结合了等电聚焦(IEF)和SDS-PAGE两种技术,通过两个维度的分离将复杂的蛋白质混合物分解为一系列单独的斑点。

在第一维度中,根据蛋白质的等电点(pI)进行分离;在第二维度中,根据蛋白质的分子量进行分离。

通过将这两个维度的分离结果叠加,可以获得高分辨率的蛋白质图谱。

双向电泳法的关键步骤如下:1.等电聚焦(IEF):在第一维度中,使用等电聚焦技术将样品中的蛋白质按照其等电点进行分离。

等电聚焦是一种基于蛋白质在电场中向氧化物离子(OH-)或氢离子(H+)方向移动的分离方法。

在等电聚焦过程中,蛋白质会在pH梯度中向其等电点迁移,直到净电荷为零。

通过控制pH梯度和应用的电压,可以将蛋白质在等电聚焦过程中分离开。

2.SDS-PAGE分离:在第二维度中,将第一维度的等电聚焦凝胶与SDS-PAGE凝胶垂直叠加。

在SDS-PAGE凝胶中,蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶的孔隙随着电场的作用向阳极迁移。

由于SDS(十二烷基硫酸钠)的存在,蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的迁移速度与其分子量成反比。

因此,蛋白质在SDS-PAGE 凝胶中会根据其分子量进行分离。

3.染色和分析:经过双向电泳分离后,凝胶可以通过染色方法显示出一系列斑点,每个斑点代表一个蛋白质。

常用的染色方法包括银染法、荧光染色、贵金属染色等。

对于银染法,它在灵敏度和线性范围上具有优势。

染色后可以使用成像设备捕捉图像并进行定量分析。

通过对斑点的比较和定量,可以识别不同样品之间的差异和变化。

步骤双向电泳法的步骤如下:1.样品制备:将待分析的生物样品(如细胞提取物)进行蛋白质提取,并使得蛋白质在石蜡中可溶解。

常用的方法包括总蛋白提取、亲和层析、激光捕获等。

2.等电聚焦(IEF):将蛋白质样品与具有连续pH梯度的凝胶进行接触。

二维差异凝胶电泳(2D-DIGE)技术在昆虫学研究中的应用

二维差异凝胶电泳(2D-DIGE)技术在昆虫学研究中的应用

二维差异凝胶电泳(2D-DIGE)技术在昆虫学研究中的应用摘要随着科学技术的迅猛发展,现代生物学技术已经发展到后基因组时代,蛋白质组学是在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其活动规律的新兴学科。

二维差异凝胶电泳(Two dimension difference gel electrophoresis,2D-DIGE)技术是在双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)基础上发展起来的一种新兴的荧光标记的定量蛋白质组学技术,是分析和鉴定基因功能的强有力工具,比经典的2-DE技术具有更高的动力学范围和灵敏性。

该文就2D-DIGE 技术的发展以及在昆虫研究上的应用前景进行了展望。

关键词二维差异凝胶电泳;蛋白质组学;昆虫1 研究背景随着大量生物体全基因组序列的揭示,特别是人类基因组测序计划的完成,标志着生命科学研究取得了极其重要的阶段性成果,同时也标志着生命科学正式进入崭新的后基因组时代[1-2],研究的重心也从揭示遗传信息结构的基因组学转移到功能基因组学上来,蛋白质组学作为高通量的蛋白质分析方法,也将对功能基因的研究做出巨大贡献。

蛋白质作为基因表达的产物与生命活动的执行者,直接体现了生命现象的复杂性和多变性。

因此,只有对实现最终功能的蛋白质进行分析鉴定,才能更好地描述细胞活动或行使功能的动力学过程,才能更贴近对生命现象和本质的掌握。

二维差异凝胶电泳(Two dimension difference gel electrophoresis,2D-DIGE)技术是分析和鉴定昆虫基因功能的强有力工具,其是在双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)基础上发展起来的一种新兴的荧光标记的定量蛋白质组学技术,在生物学各个领域得到广泛的应用[3-6]。

2D-DIGE在昆虫免疫调节、生理发育、昆虫毒理学以及传毒媒介昆虫的传毒机制等领域的应用也变得越来越广泛,其研究结果受到科学家们的高度重视。

2013.12.12 实验 蛋白质组学实验技术相关理论介绍(一)双向电泳(2DE)实验技术

2013.12.12 实验 蛋白质组学实验技术相关理论介绍(一)双向电泳(2DE)实验技术

第二向SDS-PAGE 垂直电泳
第二向SDS-PAGE 垂直电泳步骤
配制凝胶及准备第二向电泳系统 在SDS 平衡缓冲液中平衡固相pH干胶条 将平衡好的固相pH 干胶条放置在SDS 凝胶 上 进行电泳 染色、显影

平衡固相pH干胶条

平衡缓冲液(75 mM Tris-HCl, pH 8.8): 使固相pH 干胶条的pH 值维持在电泳适合 的范围内;由缓冲液、尿素、甘油、还原 剂、SDS 和染料组成。

稳定的同位素虽然其化学性质相同,但质 量数却存在差异。 ITRAQ就是利用这一原 理,用稳定同位素分别标记不同的样品, 将标记和未标记的样品以等量混合,酶解 后再用质谱技术检测它们的相对丰度。作 为一种新的蛋白质绝对和相对定量技术, 具有很好的精确性和重复性。
二维凝胶差异电泳技术DIGE

DIGE技术中将样品和对照品的蛋白质用激发波长 不同而化学性质类似的两种荧光染料标记,混合
二维凝胶差异电泳技术digedige技术中将样品和对照品的蛋白质用激发波长不同而化学性质类似的两种荧光染料标记混合二维电泳分离然后采用不同波长扫描通过观察一个蛋白质点两种荧光密度的差异变化得特定蛋白质点的差异表达信息
双向电泳(2DE) 实验技术
中国医学科学院 北京协和医学院 医学生物学研究所 病毒免疫室 赵婷 2013.12.12
IEF注意事项:
Ettan IPGphor Ⅲ系统是高压设备,如果安 全装置失效,可能引起致命电休克。因此, 操作开始前必须锁上安全盖,否则就不会加 电。 每个IPG 胶条的电流限度建议值为50μA, 如超过可能会烧毁胶条并损坏仪器。 常规胶条槽和Manifold 胶条槽采用陶瓷制成, 应小心操作。
基质辅助激光解析质谱成像技术 MALDI MSI

2D-DIGE(荧光差异双向电泳)

2D-DIGE(荧光差异双向电泳)
2D-DIGE技术是一种新出现的荧光标记的定量蛋
白质组学技术,它比经典的2-DE具有更高的动力
学范围和灵敏性,是2-DE技术的成熟与完善。它 通过三色荧光染料分别对内标和生物样本进行标 记,能够在一张2D胶上对两个样本的多种蛋白质 进行分离,并分别单独成像,应用DeCyder 2D 软件分析图像,得到蛋白表达量的丰度变化,根 据数据分析结果准确地发现差异蛋白。常规可检 测到小于10%的蛋白表达差异而同时统计学可信 度达到95%。
1. 用三色荧光染料标记样品是否会改变蛋白质的分子质量和等电点。
答:不会。这三种荧光染料是电荷和分子量匹配的,并且都是带一价正电荷,标记
的是蛋白质赖氨酸的ε-氨基。由于ε-氨基上带有一价正电荷,当染料与蛋白质发生 反应时就可以发生电荷取代,所以不会改变各蛋白质的等电点。虽然被标记蛋白质
的分子质量有所改变,但样品中所有蛋白质的相对分子质量都等量增加了,所以依
2. 2-D DIGE
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每个标记蛋白只携带一个染 料标记,呈现一个蛋白质点
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杨 华 丽
November 12th, 2015
Contents
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2-DE
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Experiment
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2-D DIGE video
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DDIGE(荧光差异双向电泳)总结

DDIGE(荧光差异双向电泳)总结

2D-DIGE技术是一种新出现的荧光标记的定量蛋
白质组学技术,它比经典的2-DE具有更高的动力
学范围和灵敏性,是2-DE技术的成熟与完善。它 通过三色荧光染料分别对内标和生物样本进行标 记,能够在一张2D胶上对两个样本的多种蛋白质 进行分离,并分别单独成像,应用DeCyder 2D 软件分析图像,得到蛋白表达量的丰度变化,根 据数据分析结果准确地发现差异蛋白。常规可检 测到小于10%的蛋白表达差异而同时统计学可信 度达到95%。
1. 用三色荧光染料标记样品是否会改变蛋白质的分子质量和等电点。
答:不会。这三种荧光染料是电荷和分子量匹配的,并且都是带一价正电荷,标记
的是蛋白质赖氨酸的ε-氨基。由于ε-氨基上带有一价正电荷,当染料与蛋白质发生 反应时就可以发生电荷取代,所以不会改变各蛋白质的等电点。虽然被标记蛋白质
的分子质量有所改变,但样品中所有蛋白质的相对分子质量都等量增加了,所以依
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Experiment
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定量蛋白质组学研究中的荧光 差异凝胶电泳技术(Ettan DIGE)

定量蛋白质组学研究中的荧光 差异凝胶电泳技术(Ettan DIGE)

要开展蛋白质组学研究,双向电泳是你必须了解掌握的最基础的蛋白质分离技术,正如普通凝胶电泳对于核酸纯化。

可是一提起双向电泳,多数人还是会直皱眉头----别摇头摆手又叹气啦,今天的双向电泳早已深入改进了,特别是其中最热门的荧光差异凝胶电泳技术(DIGE ),因为消除了传统双向电泳的一些弊端,已经使得好多实验室对双向电泳重拾信心,并逐渐得到越来越多的科学家的认同。

要知道基于双向电泳的蛋白质组分析文献每年都稳步增长,采用DIGE 技术进行研究的科研论文的比重从2004年的不到2%猛增到2008年的19.6%呢。

来吧,放下偏见,不要错过,跟着生物通重新认识这功能强大的DIGE 吧。

前尘往事一直备受争议的双向电泳何以这么不招人待见呢?长话短说。

生物样品中蛋白质的复杂多样性远超核酸,使得单向电泳无法满足蛋白样品分离分析的需求。

1975年O`Farrell 首次介绍了双向电泳技术,采用等电聚焦和SDS-PAGE 在等电点和分子量两个方向上对蛋白质进行分离,使得原本密密麻麻都挤在一条泳道上的蛋白质得以在另外一个方向上有效分开。

这个在当时极具创意的设计虽然被写进了教科书中成为经典技术,可惜在随后的实际应用中却遇到种种问题。

由于当时第一向电泳的基质是采用两性电解质配置pH 梯度胶,两性电解质的不稳定性导致等电点聚焦结果严重受到实验室条件和操作手法等偶然因素的影响,第二向电泳结果就更不用说了----即使不是差之毫厘缪之千里,这种不确定性也导致了双向电泳结果可重复性差,稳定性差。

不单各实验室之间的结果难以比较,即使同一实验室的结果也不怎么确定。

我们都知道,实验的可重复性是实验可信度的重要指标,也是同行评议的重要基础。

这种不稳定导致的争议可想而知。

用不确定的方法研究不确定的未知,会“负负得正”吗?不可能。

再加上操作和结果分析的极其复杂,难怪一提起双向电泳,人人皱眉。

直到上世纪九十年代,安玛西亚公司(通用电气生命科学的前身)推出了商品化的固相pH 梯度胶条,极大的提高了等电聚焦的可重复性,这才使得国际上不同实验室间双向电泳实验结果比较成为可能。

2D-DIGE技术在蛋白质组学中的应用

2D-DIGE技术在蛋白质组学中的应用

2D-DIGE技术在蛋白质组学中的应用杜俊变;王丽惠;段江燕【摘要】双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)作为一种新型的蛋白质组分析技术,已经被广泛应用于动物、植物、微生物以及人类差异蛋白的研究.在动物医学方面,采用DIGE技术,通过对不同类型,不同个体的细胞、组织、或经过不同处理和不同生长条件下蛋白质表达差异分析,在研究疾病的分子机理、分子诊断、药物作用机理、毒理学等方面都有广泛的应用.在植物学方面,该技术可以用来分离和分析植物亚细胞结构蛋白质组以及在生物和非生物胁迫下,植物细胞中蛋白质表达的差异性,从而建立差异蛋白相互作用网络图,从而为研究伤害机制提供一定的依据.%Two-way fluorescence difference gel electrophoresis (2D-DIGE) as one of new analytical techniques was widely used in study of animals , plants , microbes and proteins of human differences. In animal medicine , using DIGE technology , through different types of cells in different individuals, organizations, or through different treatments and different protein expression under different growth conditions analyzed in the study of molecular mechanisms of disease, molecular diagnostics, drug mechanism, drug science has a wide range of application areas. In botany , the technology can be used to isolate and analyze the subcellular structures of plant proteins as well as in biotic and abiotic stress, plant cells differencesin protein expression in order to establish differences in protein interaction network graph, and thus to study the damage mechanism to provide some basis.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2011(028)003【总页数】5页(P84-87,96)【关键词】2D-DIGE;蛋白质组【作者】杜俊变;王丽惠;段江燕【作者单位】山西师范大学生命科学学院,山西,临汾,041000;海南大学材料与化工学院生物工程系,海口,570228;山西师范大学生命科学学院,山西,临汾,041000【正文语种】中文【中图分类】Q51从生物体的不同器官,组织,细胞以及亚细胞结构中将成千上万种蛋白质进行提取和分离是蛋白质组学研究的前提工作。

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Identical standard but volumes different
This is gel:gel variation
Internal standard
2-D DIGE: with the internal standard
Standard (CyTM2) Sample 1 (Cy3) Sample 2 (Cy5)
Gel A
Standard (Cy2)
Sample 3 (Cy3)
Sample 4 (Cy5)
Gel B
Standard and sample volumes are the same
2-D DIGE: with the internal standard
Internal standard
Standard (CyTM2) Sample 1 (Cy3)
Gel 1
• Boundaries are used for quantitation relative to pooled internal standard • Matching between gels via pooled internal standard
Gel 2
Internal standard
2-D DIGE :内标
什么是内标? 内标为实验中的每张胶上的每个蛋白质都提供了一个参考点。理想情况 下,内标中最好含有来源于所有样本的每一个蛋白质。最好的办法就是 将所有的样本等量混合来形成内标。
C1
C2
C3
T4
T5
T6
Pooled sample (internal standard)
2-D DIGE 内标使用
Internal standard
Standard (CyTM2) Sample 1 (Cy3)
Sample 2 (Cy5)
Gel A
Standard (Cy2)
Sample 3 (Cy3)
Sample 4 (Cy5)
Gel B
Applies this normalisation to all spots in the gels
2-D DIGE 可以实现……
2-D DIGE 是一套完整的系统,用于检测蛋白表达中真实
的生物学差异,并对差异进行精准定量。
常规检测到小于10%的蛋白表达差异而统计学可信度
达到95%。
How to upgrade & Benefits ?
9
November 2012
EttanTM DIGE 工作流程
2-D DIGE: with the internal standard
Internal standard
Standard (CyTM2) Sample 1 (Cy3)
Sample 2 (Cy5)
Without internal standard
Gel A
With internal standard
Typhoon 为DIGE 优化设计
1. 激光器与滤光片完美匹 配减少交叉干扰
2. 激光器与PMT消除荧光 染料强度差异
减少荧光染料差异和交叉干扰
488 nm 532 nm 633 nm
Cy2
Cy3
Cy5
消除荧光染料灵 敏度和强度的区 别
670 BP 30 580 BP 30
严格分离激发光 与发射光
Correct experimental design
内标 Gel B 内标
Gel A
Control 1 Treated 4 Control 2 Treated 1 Treated 2 Control 3 Treated 3 Control 4
Pooled internal standard on all gels Single dye for standard Randomised sample labelling No gel replicates required More biological replicates possible
2-D DIGE: without internal standard
Sample 1 (CyTM3) Sample 2 (Cy5)
Gel A
Sample 3 (Cy3)
Sample 4 (Cy5)
Conclusion
Gel B
Samples 3 and 4 show increased abundance to each other and over the same protein in samples 1 and 2
传统双向电泳方法
Control Rat 1 Control Rat 2 Control Rat 3 Control Rat 4
24 Gels
Treated Rat 1 Treated Rat 2 Treated Rat 3 Treated Rat 4
2-D DIGE 节约时间
减少6倍工作
Control Rat 1 Control Rat 2 Control Rat 3 Control Rat 4
混合内标样品 用 Cy2标记 Cy2
样品1 用Cy3标记
Cy3
样品2 用Cy5标记
Cy5
2D 分离
用Typhoon多功 能扫描成像系统 采集凝胶图像 用DeCyder全自动差异 分析软件进行图像分析 和数据定量
样品被分别 标记后混合
从2-D 升级为2D DIGE
• 荧光染料 — 内标的使用 • 精确图像获取-- Typhoon FLA9500扫描仪 • 2-D DIGE 分析软件– 共找点, 内标作用的实现
2D-DIGE 荧光差异双向电泳
Why 2D-DIGE?
2
November 2012
当传统双向电泳面临新的要求时……

重复性


定量精确性
灵敏度 线性动态范围 质谱兼容与否
2-D DIGE - 精准的定量技术,检测到更多低丰度蛋白
Total number of DIGE publications ~1500 publications Top 5 categories of DIGE publications: 1. 2. 3. 4. 5. Human medicine Proteomics Molecular biology Plants Environment
Байду номын сангаас
400
520 BP 40
500
600
DeCyder™ 差异分析软件
GEL A GEL B GEL C
Sample 2
DIA In-gel co-detection Sample 1
Sample 4
DIA Sample 3
Sample 6
DIA Sample 5
Internal Std
Master BVA Cross-gel matching
Internal Std
Internal Std
Protein difference ratios
2-D DIGETM蛋白质组学技术平台
标记荧光 样品制备 双向电泳分离
图像采集
蛋白质组学平台
自动酶解 自动切点
全自动 软件分析
Questions?
Treated Rat 1 Treated Rat 2 Treated Rat 3 Treated Rat 4
胶间重复:每组每只大鼠的样本要重复三次,降低系统误差 生物重复:每组要有不同大鼠样本的重复,排除生物学差异
传统2D:2×3×4=24 gels DIGE:2×4/2=4 gels
2-D DIGE 定量结果更准确
消除实验中系统误差
Gel to gel variation
Large gel-to-gel variation
Small gel-to-gel variation
6 replicate gels made from the same sample (SYPRO™ Ruby)
Data courtesy of Jörgen Östling, AstraZeneca R&D Mölndal, Sweden. June 2004
Standard (Cy2)
Sample 3 (Cy3)
Sample 4 (Cy5)
Gel B
These data would lead the researcher to draw very different conclusions Virtual elimination of gel:gel variation reveals induced biological change with statistical accuracy
Gel C
内标 Gel D 内标
Co-detection within gels, and matching between gels
Image 1: Pooled internal standard Boundaries transferred to image 2 and 3 Image 2: Sample 1 Image 3: Sample 2
Internal standard
2-D DIGE: with the internal standard
Standard (CyTM2) Sample 1 (Cy3) Sample 2 (Cy5)
Gel A
Standard (Cy2)
Sample 3 (Cy3)
Sample 4 (Cy5)
Gel B
Sample 2 (Cy5)
Gel A
Standard (Cy2)
Sample 3 (Cy3)
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