_课件-植物基因工程

本章主要内容：

第一节 目的基因的分离和克隆 第二节 植物基因工程载体 第三节 外源基因导入植物受体的方法 第四节 转基因植物的检测



第二节 植物基因工程载体


1．农杆菌载体系统 2．病毒载体系统
1．农杆菌载体系统 ①根癌诱导原理及Ti质粒



根癌农杆菌诱导的肿瘤称为冠瘿，而发根农杆菌则 诱导发根。这些农杆菌中含有大量质粒，分别称为 肿瘤诱导质粒(Ti质粒)和发根诱导质粒(Ri质粒)，这 两种质粒均可使宿主发病。这两种病均是由Ti或Ri 质粒的一些特殊组分转入植物细胞后与植物染色体 进行功能整合而引起的。 后来的研究表明，在Ti质粒中，只有一小部分，即 T-DNA或称转移DNA，被转入并整合到宿主植物 核基因组中，而诱导形成冠瘿瘤的(Chiton等，1977)。
甜椒在栽培的 过程中，容易受病 毒的感染。我国科 学工作者，采用转 基因技术，培育出 抗病毒的甜椒。
转基因油菜
油菜是人们食用油的主要来源之一。 一般油菜籽的含油量约为40％左右。 通过转基因技术，培育出来的油菜籽， 可以大大地提高它的出油率。而且油 的纯度质量更好。
转基因玉米
玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也 可以用作食品和工业的原料以及作饲料，浑身是 宝。人们称它是含金的植物。如今培育出转基因 玉米，品质更好，产量更高。



已报道的克隆到CaMV载体中的基因都只有较短的核苷 酸序列，插入位点都在ORFⅡ上，外源基因的表达多受 病毒启动子的调节。

②双联体病毒
双联体病毒组中的每个成员均需具备两个元件，尽管这 两个元件不必存在于同一个分子上，但它们必须是任意 有功能的双联体病毒载体系统的组成部分。这两个元件 就是一个复制起点和一个病毒复制必需蛋白。 到目前为止，大多数双联体病毒载体都很简单，只缺失 外壳蛋白编码基因，可用报告基因或其他感兴趣的基因 取代。 双联体病毒表达载体可以用于原生质体、培养细胞、叶 圆片及植物体等几种不同系统中外源基因的转移、扩增 及表达。

①花椰菜花叶病毒(Caulimo viruses)
CaMV的基因组由一个8kb的松弛的环状分子组成。基因 组有两个区域，一个是ORFⅡ，编码昆虫传播因子；另 一个是ORFⅦ，功能还不清楚。 将这两个区域缺失掉，用感兴趣的基因取代之。Brisson 等(1984)用CaMV载体在芜青甘蓝细胞中获得了由细菌二 氢叶酸还原酶基因编码的外源蛋白。这一结果证明 CaMV基因组确实能被改建成植物基因工程病毒载体并 把外源基因转入植物细胞。
较容易而且效率高。 3). 二元载体不会带入大量的无用的多余的DNA序列.因为 一元载体的T-DNA区中含中间载体,他们会随同外源基因 一起被转入植物细胞中.


2．病毒载体系统
目前，用于开发载体及转化的病毒有三种，他们主要采 用基因插入和基因取代的方法构建载体：

①花椰菜花叶病毒(Caulimo viruses) ②双联体病毒 ③RNA病毒
ß -葡萄糖苷酸酶基因（gus）
gus基因编码ß -葡萄糖苷酸酶,存在于某些细菌体内， 该酶是一种水解酶，能催化许多ß-葡萄糖苷酸类物质的 水解。绝大多数的植物细胞内不存在内源的gus活性， 许多细菌及真菌也缺乏内源gus活性，因而gus基因被广 泛应用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，尤其是 在研究外源基因瞬时表达的转化实验中，gus基因应用最 多。
二、 基因枪法（微弹轰击法）
工作原理：将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒 表面，然后在高压的作用下将微粒高速射入受体 细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞后， 整合到植物染色体上并得到表达，从而实现外源 基因的转化。
操作步骤： 制备DNA微弹 准备靶外植体材料 弹轰击 培养轰击后的外植体 DNA微
②Ti质粒的构成 Ti质粒的基因结构：T-DNA区、Vir区、 Onc区和Ori区共4个区段。 1 、Vir区(毒性区) 在Ti质粒T-DNA区的上游的一组基 因。表达产物激活T-DNA向植物细 胞转移，使植物引发肿瘤。 2、 Onc区 含有农杆菌之间接合转移有关的基
因.
3、Ori区(复制起始区)
该基因编码一种乙酰转移酶，属抗生素标记基 因，它通过对庆大霉素的乙酰化而使其失活。 该选择系统目前也有一定的应用，例如矮牛、 烟草和番茄。
1.1.3.潮霉素磷酸转移酶（HTP）基因 （hpt）
潮霉素是一种很强的细胞抑制剂，对许多植物都 有很强的毒性。潮霉素磷酸转移酶可通过对潮霉 素磷酸化而使其失活。
1.1.4.膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）
该基因是从吸水链霉菌中克隆的一种基因，其对 应的选择试剂为膦丝菌素（basta）,膦丝菌素可抑 制谷氨酰胺合成酶的活性，从而导致非转化细胞 发生氨的致死性累积。
1.2、报告基因
报告基因是指其编码产物能够被快速测定、常 用于判断外源基因是够成功地导入体细胞，是否 启动表达的一类特殊用途的基因。它应用不依赖 于外界选择压力的存在，这一点也是它与选择基 因的区别之处。 将报道基因与表达载体的启动子序列相连， 并转染到细胞内，然后检测细胞内报告蛋白的含 量或活性，即报道基因技术。 可在基因表达的时空调控、受体特性、药物筛 选和基因导入系统等研究中可广泛应用。
电激法介导基因转化
原理：利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上 “电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道,从而促进 外源DNA进入原生质体。 特点： 转化率高； 操作简便 ； 容易造成原生质体损伤。
显微注射介导的基因转化
原理：利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体的细胞 质或细胞核，从而实现外源基因的转移。 优点： 方法简单、转化率高； 纯物理方法，适用于各种植物和材料，无局限性； 对受体细胞无毒害，有于转化细胞生长发育； 培养过程无需特殊选择系统。
第四章 植物基因工程在育种上的 应用
王艳娜
世界上第一种 基因移植作物 是一种含有抗 生素药类抗体 的烟草，1983 年得以培植出 来。
转基因番茄
1994年，美国研制 成功抗干旱、早熟、 保鲜的转基因番茄商 品化之后，我国也相 继成功培育出优良品 种的转基因番茄，以 满足人们的需求。
转基因甜椒

农杆菌介导低拷贝整合（多为单拷贝整合）转化效率 较高。 基因枪法纯物理转化，不存在物种的限制。 农杆菌介导存在宿主范围的局限性。
第四节 转基因植物的检测
1、转化细胞的筛选 当采用某种转基因方法处理外植体后，通常外 植体中仅仅只有几个少数细胞获得转化，只有 采取有效的筛选方法，才能高效准确的筛选到 转化细胞。一般情况下，转化载体上除了带有 目的基因外，大多还携带选择基因，以供转化 细胞筛选使用。


理想报告基因的基本要求：
（1）、受体细胞不存在相应的内源等位基因的活性。 （2）、它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞。 （3）、具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测 特性。 最常用的报告基因：ß -葡萄糖苷酸酶基因（gus）; 氯霉素乙酰转移酶基因； 荧光素酶基因; 分泌型碱性磷酸酶 ; 荧光蛋白家族
调控Ti质粒自我复制。


③农杆菌载体的构建
A．一元载体系统 有两种载体系统，即共整合载体(如pGV 3850共合体)和 末端拼接载体(split-end vector，SEV)系统。
中间载体与卸甲载体通过同源重组形成SEV载体
中间载体与卸甲载体通过同源重组进行共整合


B．双元载体系统
双元载体系统由两个能在根癌农杆菌中自主复制的质粒 组成：一个是在 T-DNA边界之间带有目的基因的穿梭 载体(但更多是一个双元载体)；一个是辅助(helper)Ti质 粒，该质粒带有vir基因，其产物有助于将DNA转移到植 物细胞。
转化筛选细胞的方法主要有两种： （1）、根据选择基因的特点在筛选选择培养 基中加入能抑制非转化细胞生长的有毒物质 （如抗生素、除草剂等），选择基因通常为一 种解毒基因，可以解除培养基中有害物质对细 胞生长的抑制作用，这样只有转化细胞才能生 长繁殖； （2）、受体细胞为营养缺陷型细胞，在选择 性培养基中不能生殖，而选择培养基可以补偿 这种缺陷，使转化细胞在选择性培养基上正常 生长。
第三节 外源基因导入到植物受体的 方法
原生质体介导法
基因枪法
根癌农杆菌介导法
一、原生质体介导法
概念：以原生质体为受体，借助于特定的化学或 物理手段将外源ＤＮＡ直接导入植物细胞 的方法。 主要方法: PEG介导的基因转化 脂质体（liposome)介导的基因转化 电激法 激光导入法 显微注射法
双元Ti载体系统，由质粒A（辅助Ti质粒）和质粒B（双元载体）共同组成

标准双元载体的组成成分：
(1)多克隆位点； (2)广谱宿主范围的质粒复制起始点(如RK2)； (3)细菌和植物中的选择标记； (4)T-DNA边界序列(右边界序列是绝对必需的)。

双元载体的优点：
1)． 双元载体不需要在活体内进行同源重组。 2). 在农杆菌中，获得带有植物目的基因的双元载体系统比
1.1、植物基因工程中的选择基因
植物基因工程中的基因主要是一类编码可使抗 生素或除草剂失活的蛋白酶基因。最常用的有 新霉素抗性基因（neor）、庆大霉素抗性基因 （gentr）、潮霉素磷酸转移酶（HTP）基因 （hpt）,以及膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）等。
1.1.1、新霉素抗性基因（neor）





③RNA病毒
RNA病毒大致可分为三类:



第一类为单链RNA病毒，包括两种基本形式。一种形式 是单一型病毒(monopartite)， 其基因组RNA包括全部遗 传信息，当作为一个单顺反子被翻译时通常很大，如烟草 花叶病毒(TMV)。另一种形式是混合型病毒(multipartite)， 正如其名称所示，基因组RNA分为若干部分，每一部分 或被包装在同一个颗粒中或被包装在不同的颗粒中，如雀 麦草花叶病毒(BMV)三个独立的颗粒包含了四个RNA分 子。 第二类即亚基因组RNA(如BMV的RNAⅣ)，它们不可能 被用作载体，因为它们在感染植物中不能自我复制。 第三类为卫星RNA，最有可能被用作载体，因为它对病 毒完全是可有可无的。