埃可病毒9型VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

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猪塞内卡谷病毒VP1蛋白原核表达及多克隆抗体制备

·2175·猪塞内卡谷病毒VP1蛋白原核表达及多克隆抗体制备莫红芳1，2，3，石宗承1，陆晶山4，5，何东贤1，2，3，杨延辉2，6，梁淑芳4，5，俸祥仁1，钱平2*，韦巧燕4，5*（1广西农业职业技术大学动物科技学院，广西南宁530007；2华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉430070；3广西大学动物科学技术学院，广西南宁530004；4广西壮族自治区柳州种畜场，广西柳州545003；5武宣县金兴生猪养殖专业合作社，广西来宾545902；6重庆三峡职业学院动物科技学院，重庆404155）摘要：【目的】原核表达猪塞内卡谷病毒（Seneca valley virus ，SVV ）VP1蛋白，制备SVV-CH-HB2016VP1蛋白多克隆抗体并分析其抗原性，为进一步研发SVV 病毒诊断试剂盒和亚单位疫苗提供参考依据。

【方法】对SVV-CH-HB2016VP1基因序列进行密码子优化，构建质粒pUCK/VP1-opt ，双酶切后连接至pET-28a （+）载体，构建原核表达质粒pET-28a-VP1。

将重组质粒pET-28a-VP1转化大肠杆菌BL21（DE3）分子伴侣感受态细胞，经IPTG 诱导表达获得重组VP1蛋白。

采用Western blotting 方法分析VP1蛋白的反应原性，并以包涵体变性和复性方式纯化。

随后将VP1蛋白免疫新西兰白兔，分离血清获得重组VP1蛋白的多克隆抗体。

以间接酶联免疫吸附试验（ELISA ）法测定抗体的效价水平，以Protein A+G Agarose 抗体纯化试剂盒纯化多克隆抗体。

通过Western blotting 和间接免疫荧光抗体试验（IFA ）法验证多克隆抗体与SVV-CH-HB2016毒株反应的特异性。

【结果】成功构建原核表达质粒pET-28a-VP1，在IPTG 终浓度为0.1mmol/L 、37℃诱导4h 条件下，重组VP1蛋白成功表达并主要以包涵体形式存在；Western blotting 分析结果显示，重组VP1蛋白可与His-Tag Mouse mAb 发生特异性结合，具有良好的反应原性；经变性和复性纯化的重组包涵体蛋白纯度和浓度均较高；采用间接ELISA 法检测多克隆抗体的效价为1∶32000；纯化后的抗体无明显杂带，纯度大于90.0%；Western blotting 和IFA 鉴定结果表明，多克隆抗体可特异性识别SVV-CH-HB2016毒株，重组VP1蛋白具有较好的免疫原性。

glipr1基因的原核表达及多克隆抗体制备

glipr1基因的原核表达及多克隆抗体制备生秀梅;陈龙;王正新【摘要】目的克隆表达胶质瘤致病相关蛋白1基因(glor1)并制备多克隆抗体,运用该抗体检测各肿瘤细胞系中GLIPR1的表达.方法通过PCR技术以含glipr1基因的cDNA克隆质粒(pLX304-glipr1)为模板获得glipr1(M)片段,再将此片段克隆至表达载体pET-15b上,并转人大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)进行表达;Ni柱纯化后的GLIPR1(M)蛋白作为抗原免疫家兔,获得多克隆抗体,Western blot法检测其特异性,并检测GLIPR1在A549、PC14、LNCaP、PC3及U87细胞中的表达.结果成功构建了表达载体pET-15b-glipr1(M),并获得了纯化的GLIPR1(M)蛋白,成功制备了兔抗GLIPR1多克隆抗体,特异性高,可用于检测各细胞系中GLIPR1的表达,GLIPR1在U87中的表达最高.结论成功表达了GLIPR1(M)蛋白,并获得了多克隆抗体,为进一步研究GLIPR1的功能和作用机制奠定了基础.【期刊名称】《安徽医科大学学报》【年(卷),期】2016(051)010【总页数】5页(P1436-1439,1444)【关键词】GLIPR1;蛋白表达;多克隆抗体【作者】生秀梅;陈龙;王正新【作者单位】江苏大学医学院生化教研室,镇江212013;The Center for Cancer Research and Therapeutic Development, Dept of Biological Sciences, Clark Atlanta University,Atlanta, GA 30314;江苏大学医学院生化教研室,镇江212013;The Center for Cancer Research and Therapeutic Development, Dept of Biological Sciences, Clark Atlanta University,Atlanta, GA 30314【正文语种】中文【中图分类】R34;Q78胶质瘤致病相关蛋白1基因(glipr1)是从胶质细胞瘤中克隆出来的新基因[1-2]。

A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及纯化

中国畜牧兽医 2022,49(7):2708-2715C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c in e A 型塞内卡病毒V P 1蛋白的原核表达及纯化杜文琪1,夏立叶1,李桂梅1,2,3,单虎1,2,3(1.青岛农业大学动物医学院,青岛266109;2.山东省新兽药创制协同创新中心,青岛266109;3.山东省兽药诊断试剂工程技术研究中心,青岛266109)摘要:ʌ目的ɔ实现A 型塞内卡病毒(S e n e c av i r u sA ,S V A )V P 1蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达,以建立S V A 抗体液相芯片技术检测方法㊂ʌ方法ɔ根据G e n B a n k 收录的S V A V P 1基因序列(登录号:K Y 747514.1),基于大肠杆菌的密码子偏好性优化合成V P 1基因,克隆到p C o l dT F 载体,构建重组质粒p C o l dT F -V P 1㊂将重组质粒pC o l dT F -V P 1转化大肠杆菌B L 21(DE 3)感受态细胞,进行I P T G 诱导表达㊂通过优化诱导时间及I P T G 浓度得出最佳诱导表达条件㊂采用H i s 标签镍柱纯化V P 1重组蛋白,将纯化后的S V A V P 1蛋白与荧光微球进行偶联,偶联好的微球与阴阳性血清反应,利用L u m i n e x 200系统上机检测背景及阴阳性血清的中值荧光强度(M F I ),从而判断阴阳性,以用于猪血清中S V A 抗体的检测㊂ʌ结果ɔ重组质粒p C o l dT F -V P 1成功转入大肠杆菌B L 21感受态细胞,并以可溶性蛋白形式表达㊂经诱导表达在约82k u 处出现阳性条带㊂当重组菌株诱导条件为16ħ㊁I P T G 终浓度为1.2m m o l /L ㊁诱导时间为3h 时,V P 1蛋白表达量最高;经W e s t e r nb l o t t i n g 分析,可在82k u 处出现明显条带㊂将V P 1蛋白与荧光微球偶联,阴性对照(背景)的平均荧光值为17(<100)㊂测试孔的平均M F I 为2339.5(>2000),证明S V A V P 1蛋白与微球偶联成功,偶联成功的荧光微球可用于检测猪血清中S V A 抗体的检测㊂ʌ结论ɔ本研究在大肠杆菌中成功表达并纯化了S V AV P 1蛋白,初步建立了S V A 抗体液相芯片检测方法,为后续研究奠定了基础㊂关键词:A 型塞内卡病毒(S V A );V P 1蛋白;大肠杆菌;蛋白纯化;可溶性表达;液相芯片中图分类号:S 852.65+1文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2022.07.029 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2021-12-27基金项目:山东省生猪产业技术体系(S D A I T -08-07)联系方式:杜文琪,E -m a i l :976234938@q q.c o m ㊂通信作者李桂梅,E -m a i l :201201054@q a u .e d u .c n P r o k a r y o t i cE x pr e s s i o na n dP u r i f i c a t i o no f S e n e c aV i r u sAV P 1P r o t e i n D U W e n q i 1,X I A L i ye 1,L IG u i m e i 1,2,3,S H A N H u 1,2,3(1.C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,Q i n g d a oA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,Q i n gd a o 266109,C h i n a ;2.N o ve l V e t e r i n a r y P h a r m a c y I n n o v a t i o nC e n t e r of S h a n d o ng P r o v i n c e ,Q i n gd a o 266109,C h i n a ;3.Re s e a r c hC e n t e rf o rE ng i n e e r i n g T e ch n o l o g yi nV e t e r i n a r y M e d i c i n e a n dV e t e r i n a r yD i a g n o s t i c R e a g e n t o f S h a n d o n g P r o v i n c e ,Q i n gd a o 266109,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b je c t i v e ɔT h i ss t u d y w a sa i m e dt oe x pr e s sS e n e c av i r u sA (S V A )V P 1p r o t e i ni n E s c h e r i c h i a c o l i (E .c o l i ),a n de s t a b l i s ht h ed e t e c t i o n m e t h o do fS V A a n t i b o d y b y l i q u i dc h i pt e c h n o l o g y .ʌM e t h o d ɔA c c o r d i n g t o t h eS V A V P 1g e n e s e qu e n c e (K Y 747514.1)f r o m G e n B a n k ,t h e V P 1g e n ew a s s y n t h e s i z e db a s e do n t h e c o d o n p r e f e r e n c e o f E .c o l i ,a n d c l o n e d i n t o p C o l dT F v e c t o r t o c o n s t r u c t t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d p C o l dT F -V P 1.T h e p C o l dT F -V P 1w a s t r a n s f o r m e di n t o E .c o l i B L 21(D E 3)c o m p e t e n tc e l l sa n di n d u c e db y I P T G.T h e i n d u c i n g co n d i t i o n s w e r e s t u d i e db y o p t i m i z i n g th e i n d u c t i o n t i m e a n d I P T Gc o n c e n t r a t i o n .R e c o m b i n a n tV P 1p r o t e i nw a s p u r i f i e d b y n i c k e l c o l u m n .T h e p u r i f i e d S V A V P 1p r o t e i n w a s c o u pl e d w i t h f l u o r e s c e n t m i c r o s p h e r e s ,a n d t h em i c r o s p h e r e sw e r e r e a c t e dw i t hS V An e ga t i v e a n d p o s i t i v e s e r u m.L u m i n e x7期杜文琪等:A型塞内卡病毒V P1蛋白的原核表达及纯化200s y s t e m w a s u s e d t o d e t e c t t h e b a c k g r o u n d a n d t h em e d i a n f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y(M F I)o f t h e n e g a t i v e a n d p o s i t i v e s e r u m.ʌR e s u l tɔT h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d p C o l dT F-V P1w a s s u c c e s s f u l l y t r a n s f o r m e d i n t o E.c o l i B L21c o m p e t e n t c e l l s a n d e x p r e s s e d a s s o l u b l e p r o t e i nw i t h t h em o l e c u l a r w e i g h t o f82k u.T h eV P1p r o t e i nw a s e x p r e s s e da t t h eh i g h e s t y i e l dw h e n i n d u c i n g a t16ħf o r 3ha n d t h e f i n a l c o n c e n t r a t i o no f I P T G w a s1.2m m o l/L.T h ea v e r a g e M F Io fn e g a t i v ec o n t r o l w a s17(<100).T h e a v e r a g eM F I o f t h e t e s tm i c r o s p h e r e sw a s2339.5(>2000),i n d i c a t i n g t h a t S V A V P1p r o t e i nw a s s u c c e s s f u l l y c o u p l e dw i t h t h em i c r o s p h e r e s.T h e c o u p l e d f l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e s c o u l db eu s e dt od e t e c tS V A a n t i b o d y i n p o r c i n es e r u m.ʌC o n c l u s i o nɔV P1p r o t e i no fS V A w a s s u c c e s s f u l l y e x p r e s s e d i n E.c o l i.T h e e x p r e s s i o n c o n d i t i o n sw e r e o p t i m i z e d,t h e t a r g e t p r o t e i nw a s p u r i f i e da n d c o u l db eu s e d t od e v e l o p a l i q u i d c h i p a n a l y s i s f o r d e t e c t i o no f S V Aa n t i b o d y.K e y w o r d s:S e n e c av i r u st y p e A(S V A);V P1p r o t e i n;E s c h e r i c h i ac o l i;p r o t e i n p u r i f i c a t i o n; s o l u b l e e x p r e s s i o n;l i q u i d c h i p猪塞内卡病毒病是由A型塞内卡病毒(S e n e c a v i r u sA,S V A)引起的猪发生水疱性相关疾病的传染性疾病[1]㊂S V A可感染不同品种和年龄的猪,仔猪感染后死亡率高,成年猪感染后症状不明显,育肥猪感染后出现生产停滞,饲料转化率降低㊂S V A最早于2002年在美国首次分离到,早期研究显示该病毒对人和动物无致病性[2-3]㊂2008和2012年分别于加拿大和美国在感染了水疱病的猪中发现了S V A㊂2014和2015年,研究发现S V A感染与母猪水疱病(S V D)的暴发及巴西和美国的新生猪死亡率有关[2]㊂随后美国㊁澳大利亚㊁意大利㊁巴西㊁哥伦比亚㊁泰国等均有相关报道[4]㊂2015年,中国广东地区养猪场出现了猪塞内卡病毒病,随后湖南㊁河南㊁福建㊁黑龙江等地均有相关报道[5]㊂S V A是小核糖核酸病毒科(P i c o r n a v i r i d a e)塞内卡病毒属(S e n e c a v i r u s)中唯一一种病毒,基因组长约为7.3k b,包括1个大的开放阅读框(O R F)㊁5'-端非翻译区(5'-U T R)和多腺苷酸化的3'-端非翻译区(3'-U T R)[6]㊂S V A的衣壳蛋白主要由V P1㊁V P2㊁V P3和V P44种结构蛋白构成,其中V P1和V P2蛋白决定塞内卡病毒的细胞嗜性,V P1和V P3蛋白决定塞内卡病毒的抗原性,此外V P2和V P4蛋白参与塞内卡病毒的核酸包装㊂V P1最具抗原性,可刺激机体产生中和抗体[7],常被用作S V A诊断试剂的研制㊂S V A临床症状与猪水疱病㊁口蹄疫(F M D)等水疱性疾病难以区分,且尚无商品化疫苗,给S V A 的防控工作带来巨大挑战㊂目前,在血清学方面可用于S V A筛查的抗体检测方法主要包括酶联免疫吸附试验(e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y, E L I S A)㊁间接免疫荧光抗体试验(i n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c t a n t i b o d y t e s t,I F A)和病毒中和试验(v i r u sn e u t r a l i z a t i o nt e s t,V N),但耗时久㊁需样本量大㊁花费成本高,且在单个反应中同时检测多种分析物的能力受到限制[8]㊂液相芯片也称为微球体悬浮芯片,是1995年美国L u m i n e x公司基于x MA P(f l e x i b l em u l t i a n a l y t e p r o f i l i n g)技术研发的新型生物芯片技术平台,其检测更加开放灵活,能同时检测多个样品的多个目标,可确保数小时内获得更灵敏的检测结果,且仅需极少量的样品,具有常规方法无法比拟的优势[9]㊂本研究旨在原核表达可溶性S V A的V P1蛋白,将其纯化后与荧光微球进行偶联,初步建立S V A抗体单重液相芯片检测方法,以期为后续完成其评估性试验以及实现S V A与其他相似疾病的鉴别诊断奠定基础㊂1材料与方法1.1材料1.1.1菌株与载体大肠杆菌D H5α和B L21(D E3)感受态细胞(T a K a R a公司);原核表达载体p C o l dT F质粒由青岛农业大学预防兽医学重点实验室保存㊂1.1.2主要试剂 S a n P r e p柱式质粒D N A小量抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司);I P T G(上海蓝季科技发展有限公司);H i s标签蛋白纯化试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司);B r a d f o r d蛋白浓度测定试剂盒㊁增强型H R P-D A B底物显色试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司);抗H i s单克隆抗体㊁预染蛋白质分子质量标准及S D S-P A G E上样缓冲液(北京索来宝科技有限公司);辣根过氧化物酶(H R P)标记的山羊抗小鼠I g G (北京中杉金桥生物技术有限公司);磁珠检测平底9072中国畜牧兽医49卷板㊁96孔板避光封板膜㊁B i o-P l e x偶联试剂盒㊁B i o-P l e x羧基磁珠(M C10044)㊁E D C和S-N H S㊁B i o-P l e x检测反应试剂盒(伯乐生命医学产品(上海)有限公司);生物素化的抗H i s单克隆抗体(6ˑH i s T a g M o n o c l o n a lA n t i b o d y,B i o t i n)(I n v i t r o g e n公司);S V A阳性血清及阴性血清均为青岛农业大学预防兽医学重点实验室保存㊂1.2方法1.2.1重组质粒的构建及鉴定根据G e n B a n k 收录的塞内卡病毒V P1基因序列(登录号: K Y747514.1),在不影响V P1蛋白氨基酸序列的前提下,对该序列进行分析和密码子优化,同时构建p C o l dⅠ-V P1重组载体,由中美泰和生物技术有限公司合成和测序㊂用N e dⅠ和P s tⅠ对p C o l dⅠ-V P1原核表达质粒进行双酶切,37ħ水浴酶切4h,利用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行分离后回收目的基因V P1㊂利用连接酶将目的基因V P1连接于表达载体p C o l dT F中,将连接产物转化大肠杆菌D H5α感受态细胞,涂布于含氨苄青霉素的L B平板过夜培养,挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的L B液体培养基,37ħ㊁220r/m i n振荡培养12h,提取质粒㊂构建p C o l dT F-V P1原核表达质粒,将采用双酶切方法鉴定为阳性的重组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序㊂1.2.2 V P1重组蛋白诱导表达将阳性重组质粒转化大肠杆菌B L21(D E3)感受态细胞,加入L B 液体培养基,37ħ㊁220r/m i n振荡培养1h㊂离心弃部分上清液,取100μL混匀的细菌溶液涂布于含氨苄青霉素的L B平板37ħ过夜培养㊂挑取单菌落于含氨苄青霉素的L B液体培养基中,37ħ㊁220r/m i n振荡培养过夜,菌液于-80ħ保存㊂按1ʒ100比例将空载体菌液和重组蛋白菌液接种于含氨苄青霉素的L B液体培养基中,37ħ㊁220r/m i n振荡培养至D600n m值为0.6~0.8,每管加入终浓度为1m m o l/L的I P T G,16ħ㊁220r/m i n诱导表达9h㊂同时设立对照㊂诱导结束后4ħ㊁12000r/m i n 离心15m i n,分别收集菌体,加入适量P B S重悬菌体,分别取10μL与4ˑS D S-P A G E上样缓冲液混合均匀,煮沸10m i n,进行S D S-P A G E㊂1.2.3 V P1重组蛋白诱导表达条件优化将空载体菌液和V P1重组菌37ħ㊁220r/m i n振荡培养至D600n m值为0.6~0.8㊂V P1重组菌分别加入终浓度为0.4㊁0.6㊁0.8㊁1.0㊁1.2和1.5m m o l/L的I P T G,空载体菌液加入终浓度为1m m o l/L的I P T G,同时设立对照,诱导12h后,收集菌液,处理样品并进行S D S-P A G E,分析最佳I P T G诱导浓度[10-12]㊂将空载体菌液和重组蛋白菌液37ħ㊁220r/m i n 振荡培养至D600n m值为0.6~0.8㊂每管加入终浓度为1.2m m o l/L的I P T G进行诱导,同时设立对照㊂重组蛋白菌液分别于诱导后3㊁6㊁9㊁12㊁22和24h取等量的菌液,处理样品并进行S D S-P A G E,分析最佳的诱导时间[9-10]㊂1.2.4 V P1重组蛋白可溶性分析使用优化的诱导条件培养重组菌体,分别收集菌体加入适量P B S重悬后冰浴超声破碎㊂超声结束后,4ħ㊁12000r/m i n离心15m i n,分别收集上清液和菌体沉淀进行S D S-P A G E[11-12]㊂1.2.5 V P1重组蛋白纯化及S D S-P A G E鉴定在优化的诱导条件下大量扩增重组菌液,如1.2.4所述制备菌液上清㊂用B r a d f o r d法测定蛋白浓度[11]㊂参照H i s标签蛋白纯化试剂盒说明书纯化V P1重组蛋白,收集洗脱峰并进行S D S-P A G E鉴定分析㊂1.2.6 V P1重组蛋白W e s t e r nb l o t t i n g分析将纯化的V P1重组蛋白转移至P V D F膜上5%脱脂奶粉4ħ封闭过夜㊂以抗H i s单克隆抗体作为一抗室温孵育2h,以山羊抗小鼠I g G作为二抗室温室温孵育2h㊂用H R P-D A B显色试剂盒进行显色,用凝胶扫描成像系统进行检测[11-12]㊂1.2.7微球活化和蛋白偶联参照B i o-P l e x胺偶联试剂盒说明书进行两步酰胺反应㊂取100μL 微球(1.25ˑ106珠)转移到偶联反应管中,注意避光㊂旋涡混匀后瞬时离心,于磁力架上沉降1m i n 并弃掉上清,加入100μL清洗缓冲液清洗微球,于磁力架上沉降1m i n并弃掉上清,将微球重新悬浮在80μL微球活化缓冲液中,加入10μL50m g/m L E D C,随后立即加入10μL50m g/m LS-N H S漩涡混匀㊂用铝箔覆盖偶联反应管,在室温下振荡孵育20m i n㊂用P B S清洗并重悬微球㊂加入适量S V A V P1蛋白,用P B S定容至500μL,漩涡混匀后,于4ħ避光过夜偶联㊂将偶联的微球离心并用P B S 清洗,加入250μL的微球封闭缓冲液,在室温下避光振荡孵育30m i n㊂P B S清洗微球后,悬浮在150μL的微球储存缓冲液中㊂1.2.8偶联效率的验证取2个偶联反应管并做好标记,1个作为阴性对照,1个作为测试管㊂每管分别加入10000个偶联的微球㊂测试管加入01727期杜文琪等:A型塞内卡病毒V P1蛋白的原核表达及纯化50μL稀释的生物素抗体,对照管中加入50μL分析缓冲液㊂室温避光反应30m i n㊂并于磁力架上沉降1m i n,缓慢除去上清液㊂将50μL稀释的藻红蛋白(P-p h y c o e r y t h r i n,P E)标记的链霉亲和素(s t r e p t a v i d i n-P E,S A-P E)加入测试管中,在对照管中加入50μL分析缓冲液,室温避光孵育10m i n㊂磁力架上沉降1m i n,缓慢除去上清液㊂将微球重悬于125μL微球贮存缓冲液中,并转移到96孔板中,上机检测㊂结果判定标准:阴性对照(背景)的中值荧光强度(m e d i a n f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y,M F I)<100,偶联微球的荧光值>2000M F I可认为偶联成功㊂1.2.9最佳结合蛋白浓度的确定将不同含量(6㊁9㊁12和15μg/1.25ˑ106珠)的S V A-V P1蛋白与1.25ˑ106珠微球偶联,确定最佳结合的蛋白浓度㊂1.2.10S V A抗体单重液相芯片检测方法的建立偶联好的微球稀释至5000个/孔,96孔平板中每孔加入50μL稀释好的微球,于磁力架静置1m i n,使微球完全沉淀后甩去上清㊂微球清洗缓冲液清洗微球2次,样本孔对应加入50μLS V A阴㊁阳性血清,对照孔中加入50μL分析缓冲液㊂避光贴封板,室温震荡孵育1h㊂结束后,清洗微球,每孔加入50μL稀释好的生物素化的抗H i s单克隆抗体,避光贴封板,室温振荡孵育45m i n,完成后清洗微球,每孔加入50μL稀释好的S A-P E,避光贴封板,室温振荡孵育10m i n,完成后清洗微球,每孔加入125μL储存缓冲液充分重悬微球,上机检测㊂1.3统计分析数据用G r a p h P a dP r i s m6.0软件分析,采用A N O V A分析㊂P<0.01表示差异极显著㊂2结果2.1重组质粒的构建及鉴定重组质粒p C o l dT F-V P1经N e dⅠ㊁P s tⅠ双酶切鉴定,载体片段大小为5769b p,目的片段大小为822b p(图1),与预期大小一致,测序结果与目的基因序列一致,结果证明重组质粒构建成功㊂2.2V P1重组蛋白的诱导表达重组蛋白经I P T G诱导后,对诱导前㊁后菌液及空载体诱导前㊁后菌液进行S D S-P A G E分析,结果显示,在约82k u处有一条目的条带(含标签蛋白52k u)(图2),与预期大小相符,表明V P1重组蛋白初步表达成功㊂M,D L10000D N A M a r k e r;1~5,重组质粒p C o l dT F-V P1 M,D L10000D N A M a r k e r;1-5,R e c o m b i n a n t p l a s m i d p C o l d T F-V P1图1重组质粒p C o l dT F-V P1的双酶切鉴定结果F i g.1R e s t r i c t i o nd i g e s t i o no fr e c o m b i n a n t p l a s m i d p C o l d T F-V P11,未诱导的空载体;2,诱导的空载体;3,未诱导的重组蛋白; 4,诱导的重组蛋白;M,蛋白质分子质量标准1,U n i n d u c e d e m p t y v e c t o r;2,I n d u c e d e m p t y v e c t o r; 3,U n i n d u c e dr e c o m b i n a n t p r o t e i n;4,I n d u c e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n;M,P r o t e i n M a r k e r图2V P1重组蛋白的诱导表达结果F i g.2I n d u c e d e x p r e s s i o no fV P1r e c o m b i n a n t p r o t e i n2.3V P1重组蛋白诱导条件优化由图3可知,当I P T G终浓度为1.2m m o l/L 时,蛋白表达量最高㊂由图4可知,诱导3h后的蛋白表达量最高㊂说明16ħ㊁220r/m i n㊁1.2m m o l/L I P T G诱导3h时表达结果最佳㊂1172中国畜牧兽医49卷M ,蛋白质分子质量标准;1,诱导的空载体;2,未诱导的空载体;3,未诱导的重组蛋白;4~9,I P T G 浓度分别为0.4㊁0.6㊁0.8㊁1.0㊁1.2和1.5m m o l /LM ,P r o t e i n M a r k e r ;1,I n d u c e de m p t y ve c t o r ;2,U n i n d u c e d e m p t y ve c t o r ;3,U n i n d u c e dr e c o m b i n a n t p r o t e i n ;4-9,I P T G c o n c e n t r a t i o n sw e r e 0.4,0.6,0.8,1.0,1.2a n d1.5m m o l /L ,r e s p e c t i v e l y图3 诱导剂I P T G 浓度的优化F i g .3 O pi t i m i z a t i o no f I P T Gc o n c e n t r a t i on M ,蛋白质分子质量标准;1,诱导的空载体;2,未诱导的空载体;3,未诱导的重组蛋白;4~9,诱导时间分别为3㊁6㊁9㊁12㊁22和24hM ,P r o t e i n M a r k e r ;1,I n d u c e de m p t y ve c t o r ;2,U n i n d u c e d e m p t y ve c t o r ;3,U n i n d u c e dr e c o m b i n a n t p r o t e i n ;4-9,T h e i n d u c t i o n t i m ew e r e 3,6,9,12,22a n d24h ,r e s p e c t i v e l y 图4 诱导时间的优化F i g .4 O p i t i m i z a t i o no f i n d u c i n gt i m e 2.4 V P 1重组蛋白可溶性鉴定V P 1重组蛋白可溶性分析结果显示,在约82k u 处有目的条带,上清和沉淀中均有表达,且上清中表达量较高(图5),说明该蛋白具有可溶性㊂2.5 V P 1重组蛋白的纯化根据最佳诱导条件诱导V P 1重组蛋白大量表达并用蛋白纯化试剂盒进行纯化,分别收集洗脱峰进行S D S -P A G E 分析,结果显示在约82k u 处有目的条带(图6),表明成功纯化V P 1重组蛋白㊂M ,蛋白质分子质量标准;1,诱导的空载体;2,未诱导的空载体;3,未诱导的重组蛋白全菌液;4,未诱导的重组蛋白上清;5,未诱导的重组蛋白沉淀;6,诱导的重组蛋白全菌液;7,诱导的重组蛋白上清;8,诱导的重组蛋白沉淀M ,P r o t e i n M a r k e r ;1,I n d u c e d e m p t y ve c t o r ;2,U n i n d u c e d e m p t y ve c t o r ;3,U n i n d u c e d r e c o m b i n a n t p r o t e i nw h o l eb a c t e r i a l s o l u t i o n ;4,U n i n d u c e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n s u p e r n a t a n t ;5,U n i n d u c e dr e c o m b i n a n t p r o t e i n p r e c i pi t a t i o n ;6,I n d u c e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n w h o l e b a c t e r i a ls o l u t i o n ;7,I n d u c e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n s u p e r n a t a n t ;8,I n d u c e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n p r e c i pi t a t i o n 图5 V P 1重组蛋白可溶性分析F i g .5 S o l u b l e a n a l ys i s o fV P 1r e c o m b i n a n t p r o t e in M ,蛋白质分子质量标准;1,未诱导的空载体;2,诱导的空载体;3,未诱导的重组蛋白;4,诱导的重组蛋白上清;5,流穿液;6,洗涤液;7~9,分别为洗脱液1㊁2和3M ,P r o t e i n M a r k e r ;1,U n i n d u c e de m p t y ve c t o r ;2,I n d u c e d e m p t y ve c t o r ;3,U n i n d u c e dr e c o m b i n a n t p r o t e i n ;4,I n d u c e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n s u p e r n a t a n t ;5,F l o w -t h r o u g h ;6,W a s h i n g s o l u t i o n ;7-9,E l u e n t 1,2a n d3,r e s p e c t i v e l y 图6 V P 1重组蛋白的纯化F i g.6 P u r i f i c a t i o no fV P 1r e c o m b i n a n t p r o t e i n 2.6 V P 1重组蛋白W e s t e r nb l o t t i n g 分析W e s t e r nb l o t t i n g 检测结果显示,纯化后重组V P 1蛋白能被H i s 单克隆抗体识别,在约82k u 处有目的条带(图7),与S D S -P A G E 中重组V P 1蛋白大小一致㊂2.7 偶联效率验证偶联效率验证结果显示,阴性对照(背景)的平均M F I 为17(<100);测试孔的平均M F I 为2339.5(>2000),证明S V A V P 1蛋白与微球偶联成功㊂21727期杜文琪等:A 型塞内卡病毒V P 1蛋白的原核表达及纯化M ,蛋白质分子质量标准;1,未诱导的空载体;2,诱导的空载体;3,未诱导的重组蛋白;4,诱导的重组蛋白M ,P r o t e i n M a r k e r ;1,U n i n d u c e de m p t y v e c t o r ;2,I n d u c e d e m p t y v e c t o r ;3,U n i n d u c e dr e c o m b i n a n t p r o t e i n ;4,I n d u c e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n图7 V P 1重组蛋白的W e s t e r nb l o t t i n g 分析F i g .7 W e s t e r nb l o t t i n g a n a l y s i s o fV P 1r e c o m b i n a n t p r o t e i n 2.8 最佳结合蛋白浓度的确定将不同含量(6㊁9㊁12和15μg/1.25ˑ106珠)的S V A -V P 1蛋白与1.25ˑ106珠微球偶联,结果显示当蛋白浓度<12μg/1.25ˑ106珠时,样品中的M F I 随着V P 1蛋白浓度增加而逐渐升高,当蛋白浓度为12μg/1.25ˑ106珠时,平均M F I 达到2689.0,进一步升高蛋白浓度并不能增加M F I㊂不同蛋白浓度下,背景对照的平均M F I 均<100,由此确定出最佳结合的蛋白浓度为12μg/1.25ˑ106珠微球(表1)㊂2.9 S V A 抗体单重液相芯片检测方法的建立由图8可知,背景对照M F I 的平均值为23.5,S V A 阳性血清M F I 的平均值为10172,极显著高于阴性血清M F I 的平均值162.5(P <0.01),说明V P 1蛋白偶联的荧光微球可用于S V A 抗体的检测㊂表1 不同浓度蛋白M F IT a b l e 1 M F I o f p r o t e i nw i t hd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s 蛋白浓度P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n /(μg /1.25ˑ106珠)背景对照1B a c k g r o u n d c o n t r o l 1背景对照2B a c k gr o u n d c o n t r o l 2样品1S a m p l e 1样品2S a m p l e 2629.027.0 807.0810.0918.016.01849.01859.51217.017.02580.52797.51528.028.51635.51701.0①B C ,背景对照;N C ,阴性血清;S V A -4ˑ,4倍稀释阳性血清㊂②与B C 相比,**,差异极显著(P <0.01)①B C ,B a c k g r o u n dc o n t r o l ;N C ,N e ga t i v es e r u m ;S V A -4ˑ,4-f o l d d i l u t e d p o s i t i v e s e r u m.②C o m p a r e d w i t h B C ,**,E x t r e m e l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.01)图8 S V A 阳性血清及阴性血清M F I 检测F i g .8 T h eM F I o f S V A p o s i t i v e a n dn e ga t i v e s e r a 3 讨论猪塞内卡病毒病被认为是一种新兴的家畜传染病,近年来持续引发关注[13]㊂作为猪水疱病的新病原体,S V A 在不同地区㊁国家迅速进化和传播,但早期的塞内卡病毒分离株对猪没有明显致病性,而近年来从巴西㊁美国㊁中国㊁加拿大㊁哥伦比亚和泰国等国家的相关病例报道可发现其致病性显著增强[14-19],表明塞内卡病毒正朝着更强毒力的表型进化,应引发高度关注㊂为了更好地防控和检测塞内卡病毒病,开展塞内卡病毒病检测技术的相关研究十分必要[20]㊂对于S V A 的防控有赖于对其准确快速的检测,血清学方法因操作简单㊁成本较低,常用于流行病学研究或监测㊂然而传统的E L I S A ㊁I F A 和V N检测方法耗时久㊁所需样本量大㊁且在单个反应中很难同时将S V A 感染与其他类似疾病区分开来,因此亟需建立一种灵敏㊁快速且高通量的抗体检测技术㊂新型液相芯片技术的主要优势在于在简单检测3172中国畜牧兽医49卷的基础上增加了另一个维度,致力于多重分析技术㊂近年来,研究者致力于液相芯片检测技术在动物疫病检测方面的研究和应用,肖丽等[21]建立同步检测伪狂犬病病毒(P R V)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(P R R S V)抗体的双重液相芯片检测方法,与E L I S A法相比P R V和P R R S V抗体的最高血清检出稀释倍数分别提高66和32倍㊂本研究在检测抗原的选择上,S V A V P1蛋白具有高度保守性,且最具抗原性,可刺激机体产生中和抗体[22-23],可作为首选㊂在表达系统的选择上,大肠杆菌作为最常用的原核表达系统,广泛用于同源和异源蛋白质的表达㊂重组蛋白在大肠杆菌中包含可溶性和包涵体两种表达形式㊂由于包涵体难溶且不具天然生物活性,在纯化过程中操作繁琐且成本较高㊂因此本研究采用冷休克表达载体p C o l dT F对于V P1蛋白进行表达,以期增加蛋白产量㊁纯度及可溶性㊂本研究利用原核表达载体对S V A V P1蛋白进行了表达,并探索研究了诱导表达过程中诱导时间㊁I P T G浓度几个重要诱导条件,利用优化后的最佳诱导表达条件,可在短时间内对V P1蛋白大量表达,提高了V P1重组蛋白的表达效率㊂本试验借助重组载体多克隆位点携带的H i s标签对重组V P1蛋白成功进行了纯化㊂为了提高V P1蛋白的纯化效率,在蛋白纯化试验中将B i n g d i n g B u f f e r的咪唑浓度由10m m o l/L降至5m m o l/L,洗脱液中的咪唑浓度为500m m o l/L,获得了纯化效率较高的V P1重组蛋白㊂纯化后S V A V P1蛋白与微球偶联成功,本研究探讨了V P1蛋白与荧光微球偶联的最佳蛋白浓度,应用偶联成功的荧光微球,通过液相芯片检测技术可对塞内卡病毒阳性血清进行检测,初步建立了S V A抗体液相芯片检测技术㊂本试验结果为实现区分塞内卡病毒病与其他类似症状的疾病及血清学检测方法的建立奠定了基础㊂4结论本研究利用p C o l d T F原核表达载体对S V A V P1蛋白进行了高效可溶性表达与纯化,纯化后的V P1重组蛋白与荧光微球偶联后,结合液相芯片技术可用于猪血清中塞内卡病毒抗体的检测㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] Z HA N G X,Z HUZ,Y A N GF,e t a l.R e v i e wo f S e n e c av a l l e y v i r u s:A c a l lf o ri n c r e a s e d s u r v e i l l a n c e a n dr e s e a r c h[J].F r o n t i e r s i n M i c r o b i o l o g y,2018,9:8.[2] S E G A L E 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塞尼卡病毒VP1蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

中国病原生物学杂志2020年11月第15卷第11期Journal o f Pathogen Biology Nov. 2020. Vol. 15, No. 11• 1299•D()I：10. 13350/j. cjpb. 201112•论著•塞尼卡病毒VP1蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体制备<孟媛m，张金勇2,姜宇航％于成东王政w，于桐L，李亭玉u，高旭1…，鲁会军> •，金宁一=…(1.延边大学农学院，吉林延吉133002;2.军事科学院军事医学研究院军事兽彪研究所，僉林长春130122)【摘要】目的利川原核表达系统表达塞尼卡病#(Seneca Valley vims，SVV)V P l蛋并用纯化的蛋白免疫小鼠，制备V P1多克隆抗体。

方法P C R扩增S W V P1蛋d基因，并将其克隆至pET-28a( +)载体，构建P E T-28a-V P l重组质粒。

将重组质粒转化至B L21(D E3)p L y S s大肠埃希菌•使用I P T G诱导表达目的蛋白并优化表达条件，利用H i s标签镍离子蛋白纯化柱纯化蛋d。

用纯化后的蛋白免疫小鼠•制备多克隆抗体，并用接毒后的B H K-21细胞进行Western blot验证。

结果P C R扩增S V V V P1目的基因片段为792 b p，与预期相符。

成功构建p E T-28a-V P l重组质粒，转化至D E3后经I P T G诱导表达相对分子质量单位约为35X10:<的目的蛋白•以37 C、0.8 m m o l/L诱导剂诱导4 h表达量最高，且重组蛋白以包涵体形式表达。

用H i s标签Ni2’ -N T A金厲螯合蛋白质纯化柱纯化蛋白并免疫小鼠，制备的抗血清能与接毒后的B H K-21细胞裂解产生及纯化的V P1蛋白反应。

结论原核表达了塞尼卡病毒V P1蛋白，制备f抗小鼠多克隆抗体，该抗体具有免疫反应性。

【关键词】塞尼卡病毒；V P1蛋白；纯化；多克隆抗体【中图分类号】■【文献标i只码】【文章编号】1673-5234(2020)1卜1299-05[^Journal o f Pathogen B io lo g y.2020 N o v；15(11)：1299 —1303» 1309.]Expression, purification, and preparation of a polyclonal antiliody for the VP1 protein of the Seneca Valley virus MENG Yuan1.2，ZHANG Jin-yong2，JIANG Yu-hang、YU Cheng-dong1.」，WANG Zheng1.2，YU Tong1.2，LI Ting-yu' " »C j A O Xu1?LU Hui-jun .JIN Ning-yi' (1. Yanbian U niversity^ Y a n ji •J ilin ^China133002；2.Institute o f M ilita ry Veterinary M edicine ^A cadem y o f M ilita ry Sciences)(Alistracl]Objective T o optimize conditions for expression of the V P1protein of the Seneca Valley virus (S V V)in a prokaryotic expression system and to immunize mice with the purified protein in order to prepare V P1 polyclonal antibodies. M e t hods T h e V P1 gene of the S V V w as amplified and transfected into a pET-28a( )vector，and the recombinant plasmid p E T-28a-VP1 w a s constructed and transformed into B L21(D E3)pLyS>s Escherichia coli.Expression of the recombinant V P1protein w a s induced with I P TG. T h e V P1protein w a s purified on a His-tag nickel ion protein purification column. T h e purified protein w a s used to immunize mice to prepare polyclonal antibodies. Inoculated B H K-21 cells were tested for the antibodies using W e s tern blotting. Results T h e target gene, V P1of the S W,w a s successfully amplified. T h e V P1gene w a s 792 bp in length.which agreed with expectations. T h e recombinant plavsmid p E T-28a-V P l w a s successfully constructed. Expression of the r e c o mbinant protein w a s induced, and the M r of the target protein about 35 X 10'. T h e level of recombinant protein expression w a s highest at 37’C with 0. 8 mmol/1- I P T G after 4 h. In addition, the recombinant protein w a s expressed in the form of inclusion bodies. T h e protein w a s purified on a His tag Ni -N T A metal chelating protein purification column. Western blotting w a s used to detect the response of inoculated B H K-21cells to the purified target proteia A band of interest wa s detected at around 35 kDa. Conclusion T h e V P1protein of the S V V was expressed in a prokaryotic expression s y s t e m» and polyclonal antibodies a- gainst the V P1protein were prepared in mice.Seneca Valley virus；V P1protein；purification；polyclonal antibody塞尼卡病毒（Seneca Valley virus，SVV)是一种具有二十面体结构，直径27〜30 n m的单链正链无褒膜RNA病毒1。

A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备农作荣;王豪;牛晨霞;全东群;曾悦;任同伟;王玉旭;陈樱;欧阳康;黄伟坚;韦祖樟【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2022(30)1【摘要】A型塞内卡病毒(SVA)是一种新发传染病病原。

研究旨在对SVA的衣壳蛋白VP1进行原核表达,并制备其多克隆抗体。

以SVA广西分离株SVA-GX01(GenBank登录号:MK039162)RNA为模版,通过RT-PCR扩增结构蛋白VP1基因,构建重组质粒pET-32a-VP1并转化表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。

在非变性条件下,将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。

纯化的多克隆抗体进行间接ELISA测定效价,同时进行Western blot与间接免疫荧光分析。

结果表明,重组蛋白pET-32a-VP1在大肠杆菌BL21(DE3)以可溶性与包涵体两种形式表达,分子量约为49 kDa。

纯化后多克隆抗体效价高达1∶64000。

Western blot与间接免疫荧光(IFA)分析显示,多克隆抗体能跟SVA抗原特异性结合。

重组SVA-VP1蛋白及其多克隆抗体的成功制备为猪塞内卡病毒血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。

【总页数】7页(P120-126)【作者】农作荣;王豪;牛晨霞;全东群;曾悦;任同伟;王玉旭;陈樱;欧阳康;黄伟坚;韦祖樟【作者单位】广西大学动物科学技术学院动物传染病与分子免疫学实验室【正文语种】中文【中图分类】S659.6【相关文献】1.Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP1基因的原核表达及多克隆抗体的制备2.柯萨奇病毒B 组5型VP1蛋白的外源表达及多克隆抗体的制备3.A型塞内卡病毒VP2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备4.A型塞内卡病毒VP1结构蛋白在昆虫杆状病毒中的表达与鉴定5.A型塞内卡病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

鸡贫血病毒衣壳蛋白VP1基因的克隆、原核表达和纯化

鸡贫血病毒衣壳蛋白VP1基因的克隆、原核表达和纯化吴艳红;陈建龙;李丛丛;何成强;李云龙【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2007(28)1【摘要】根据GenBank中CAV哈尔滨分离株基因序列,设计出针对CAV VP1大片段(608 bp)的引物,利用PCR方法从CAV基因组序列中扩增出VP1基因的大片段(608 bp),按照正确的读码框克隆到原核表达载体pET32a(+)上,得到含VP1大片段的pET32a(+)重组子,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达,经SDS-PAGE和Western blotting检测发现有分子质量约42 ku的融合蛋白表达,与预期分子质量大小一致,通过Ni亲和层析柱纯化出融合蛋白,经Western blotting鉴定,融合蛋白与His单抗能够结合.CAV VP1基因的克隆表达及其融合蛋白的纯化为后续制备多克隆抗体和单克隆抗体提供了良好的抗原来源,也为研究VP1与其他CAV蛋白之间的相互关系奠定了基础.【总页数】4页(P46-49)【作者】吴艳红;陈建龙;李丛丛;何成强;李云龙【作者单位】山东师范大学生命科学学院动物抗性实验室,山东济南,250014;山东省济南第一中学,山东济南,250011;山东师范大学生命科学学院动物抗性实验室,山东济南,250014;山东师范大学生命科学学院动物抗性实验室,山东济南,250014;山东师范大学生命科学学院动物抗性实验室,山东济南,250014【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2;Q785【相关文献】1.鸡贫血病毒衣壳蛋白基因的原核表达 [J], 郭淑华2.鸡贫血病毒衣壳蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备 [J], 王晓艳;文刚;高玉龙;高宏雷;王笑梅3.施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备 [J], 张永宁;吴绍强;吕继洲;冯春燕;王彩霞;袁向芬;邓俊花;林祥梅;Wernike Kerstin1型口蹄疫病毒VP1基因的克隆、原核表达及纯化 [J], 独军政;常惠芸;丛国正;林彤;邵军军;魏小娟;刘在新;谢庆阁5.鸡贫血病毒(CAV)vp1基因的克隆及与其他CAV vp1基因的比较(英文) [J], 张刚;何成强;安利国;李云龙因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

肠道病毒所致各系疾病研究报告

肠道病毒所致各系疾病研究报告疾病别名：肠道病毒所致各系统感染所属部位：腹部就诊科室：急诊科,传染科,消化内科病症体征：斑丘疹，斑疹，步态不稳，抽搐疾病介绍：肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒（COX-SACKIE VIRUS），埃可病毒（ENTERO CYTOPATHIC HUMAN OR-PHAN VIRUS，ECHO VIRUS），以及近年来新发现的新肠道病毒68～71型，这里主要叙述柯萨奇病毒和埃可病毒和新肠道病毒与人类疾病的关系，这些病毒在世界各地广泛地引起散发或流行性发病，波及全身各个系统，日益为人们所重视，在儿童时期尤为多见，临床表现复杂多样，虽大都属轻症，但也可危及生命，可引起无菌性脑膜炎，类脊髓灰质炎，心肌炎，流行性胸痛，出疹性疾病，疱疹性咽峡炎，呼吸道感染，婴儿腹泻以及流行性急性眼结膜炎等症状体征：一：肠道病毒感染临床表现复杂多样，加以健康人群粪便带病毒者不少，因此诊断必需十分慎重，一般要符合以下几点才能确诊。

1、从病人体液(胸水、心包液、脑脊液、血液、疱浆液等)或活检(或尸检)组织中分离出病毒有诊断价值，但单从咽拭或粪便中分离到病毒不能确诊。

2、疾病恢复期(起病后3～4周)血液中抗体效价较疾病早期有4倍或4倍以上增高，则有新近感染的可能。

以中和抗体测定最为可靠。

3、临床上出现流行性肌痛、疱疹性咽峡炎、婴儿急性心肌炎、无菌性脑膜炎、急性流行性眼结膜炎等症候群。

从咽拭子或粪便中重复分离到同一型病毒，且从周围同样疾病者中也检出相同的病毒，而病毒分离率远高于未接触病人的对照组，则有诊断的参考价值。

二、各系统疾病(一)脑部1、瘫痪性疾病自从广泛应用脊髓灰质炎疫苗后，发现肠道病毒引起的麻痹症不算少见，柯萨奇A7、9、10，B1～5，埃可4、6、9、11、14、30均可引起。

但肠道病毒71为主要能引起流行性瘫痪的非脊髓灰质炎病毒。

此病毒可引起乳鼠肌炎及猴发生瘫痪。

上海也曾见到由柯萨奇病毒B1、B5型及埃可病毒9型引起的瘫痪病例。

衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1的原核表达及提纯研究的开题报告

衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1的原核表达及提纯研究的开题报告题目：衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1的原核表达及提纯研究背景和研究意义：衣原体是革兰氏阴性细菌，被认为是一种特殊的细胞寄生物，它们存在于人类和其他动物的许多器官中。

衣原体噬菌体phiCPG1是一种噬菌体，可以感染衣原体。

衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1是该噬菌体中的主要结构蛋白，它的表达和纯化对研究噬菌体感染衣原体的机制以及噬菌体作为抗生素的应用具有重要意义。

研究内容：本研究的主要内容是对衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1进行原核表达和提纯。

在表达载体pET28a中克隆目标基因vp1，通过诱导表达和Ni-NTA亲和层析纯化得到目的蛋白。

蛋白的质量和纯度通过SDS-PAGE和Western blot进行检测，同时利用动态光散射仪（DLS）测定蛋白颗粒的粒径。

研究目标：1.成功构建含vp1基因的表达载体pET28a；2.成功在原核表达系统中表达vp1蛋白；3.通过Ni-NTA亲和层析技术纯化vp1蛋白，获得高质量、高纯度的目的蛋白；4.测定蛋白颗粒的粒径，为后续研究衣原体噬菌体的结构及其与衣原体的相互作用提供基础数据。

研究方法：1.基因克隆：将vp1基因克隆到表达载体pET28a中，得到含vp1基因的重组质粒。

2.原核表达：将重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）细胞中，将细胞在IPTG的诱导下表达vp1蛋白。

3.蛋白纯化：通过Ni-NTA亲和层析纯化vp1蛋白。

4.蛋白检测：用SDS-PAGE及Western blot检测蛋白质量和纯度。

5.蛋白颗粒粒径测定：使用动态光散射仪测定蛋白颗粒的粒径。

预期成果及意义：1.成功构建了vp1基因的表达载体，为后续研究衣原体噬菌体结构和与衣原体的相互作用提供基础数据。

2.成功原核表达和纯化vp1蛋白，为后续研究衣原体噬菌体的结构和机制提供实验基础。

3.通过测定蛋白颗粒的粒径，评估并优化蛋白的纯化条件，为后续应用提供可靠数据。

禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白亚单位疫苗的制备方法[发明专利]

专利名称：禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白亚单位疫苗的制备方法专利类型：发明专利
发明人：郭伟伟,王红,徐宝娟,李昌友,宫晓
申请号：CN201210047003.1
申请日：20120328
公开号：CN102533629A
公开日：
20120704
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白亚单位疫苗的制备方法。

本发明是通过合成了禽脑脊髓炎VP1基因的引物，构建并获得了一株带有该基因的高效表达载体的重组菌，实现了禽脑脊髓炎VP1蛋白在大肠杆菌中的高效表达，可溶性蛋白表达量约占菌体总蛋白的60％，该表达产物为胞液中可溶性蛋白，具有天然VP1蛋白的抗原活性。

利用该重组菌作为生产菌株制备成的禽脑脊髓炎VP1亚单位疫苗能有效地保护禽类免遭禽脑脊髓炎病毒的攻击。

申请人：青岛易邦生物工程有限公司
地址：266032 山东省青岛市南京路369号
国籍：CN
代理机构：北京君智知识产权代理事务所
代理人：郑明
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211232365_AAV9衣壳蛋白VP的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2023.04.028·论著/免疫学技术与方法·AAV9衣壳蛋白VP的原核表达、纯化及多克隆抗体制备①张浩李舒月张雄洲谈恒星杨建林曹春雨吕亚丰（三峡大学医学院，肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室，宜昌 443000）中图分类号R392-33 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2023）04-0833-05［摘要］目的：表达腺相关病毒（AAV）9型衣壳蛋白VP，制备抗VP蛋白的多克隆抗体。

方法：使用PCR技术从AAV9病毒包装质粒中扩增AAV9衣壳蛋白VP，同源重组法构建衣壳蛋白表达质粒pET30a-AAV9-VP。

质粒转化表达菌E.coli BL21（DE3）后，IPTG诱导目的蛋白VP表达，亲和层析法纯化VP蛋白，将纯化后的蛋白免疫日本大耳白兔，3次免疫后获得针对VP蛋白的兔多克隆抗体。

以Western blot和细胞免疫荧光法检测抗体的应用，ELISA检测所得抗体的效价。

结果：成功构建pET30a-AAV9-VP表达质粒，在大肠杆菌BL21中，IPTG可诱导VP蛋白表达。

亲和层析法纯化获得高纯度的VP蛋白。

该蛋白在日本大耳兔体内能够诱导产生多克隆抗体，ELISA检测抗血清效价达到1∶512 000。

结论：成功原核表达和纯化AAV9衣壳蛋白VP并制备了兔多克隆抗体。

制备的抗AAV9 VP抗体能够特异性识别和结合AAV衣壳蛋白，并可有效用于Western blot和细胞免疫荧光分析，为后续深入研究AAV9在基因治疗中的作用及AAV9载体开发提供了研究基础。

［关键词］原核蛋白纯化；腺相关病毒9；多克隆抗体Prokaryotic expression，purification and polyclonal antibody preparation of AAV9 capsid protein VPZHANG Hao， LI Shuyue， ZHANG Xiongzhou， TAN Hengxing， YANG Jianlin， CAO Chunyu， LYU Yafeng. Three Gorges University Medical College， Hubei Key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotherapy， Yichang 443000， China［Abstract］Objective：To express the recombinant proteins of adeno-associated virus （AAV）9 capsid VP and prepare the polyclonal antibodies against VP. Methods：AAV9 capsid protein VP coding sequence was amplified from AAV9 plasmid by PCR，and capsid protein expression plasmid pET30a-AAV9-VP was constructed by homologous recombination. After transforming it into E.coli BL21 （DE3）， IPTG was used to induce expression of VP， and the VP was purified by Ni-NTA resin affinity chromatography，the purified protein was used as antigen to immunize Japanese white rabbits to prepare polyclonal antibodies. The rabbit polyclonal antibody against VP protein was obtained after three times of immunization. Specificity of anti-sera was detected by Western blot and cell immunofluorescence， ELISA was used to detect titer of anti-VP antibody. Results：The pET30a-AAV9-VP expression plasmid was successfully constructed. IPTG can induce the expression of VP in E.coli BL21 bacteria. Ni-NTA resin affinity chromatography can effectively purify VP protein， and the VP can induce polyclones effectively in Japanese white rabbits， the antibody titer detected by ELISA was reaches 1∶512 000. Conclusion：Successful expression and purification of AAV9 capsid protein VP and preparation of rabbit polyclonal antibodies. The AAV9 VP antibody can specifically recognize and bind to the AAV capsid protein and can be effec‐tively used for Western blot and immunofluorescence analysis. It provides a research foundation for development of AAV9 vector and the in-depth study of the role of AAV9 in gene therapy.［Key words］Prokaryotic expression；Adeno-associated virus 9；Polyclonal antibody①本文为国家自然科学基金项目（81772833）；肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室（三峡大学）基金项目（2021KZL01）。

O型口蹄疫病毒VP1蛋白表达及单克隆抗体的制备

O型口蹄疫病毒VP1蛋白表达及单克隆抗体的制备disease virus, FMDV）属于Picornaviridae家族，是一种非包膜的正链RNA病毒，可以感染有蹄动物，尤其是牛、猪、绵羊和山羊等。

该病毒的VP1蛋白是它的主要外壳蛋白之一，具有重要的生物学功能。

本文将介绍O型口蹄疫病毒VP1蛋白的表达及制备单克隆抗体的相关探究进展。

口蹄疫是一种高度传染性的动物疾病，对农业和经济造成了巨大的损失。

为了控制和防止口蹄疫的传播，探究人员一直在努力开发有效的疫苗和药物。

口蹄疫病毒的VP1蛋白是病毒颗粒的主要成分之一，也是引起免疫应对的主要抗原。

因此，探究VP1蛋白的表达和制备具有重要的理论和实践意义。

目前，常用的VP1蛋白表达方法有原核表达系统和真核表达系统。

在原核表达系统中，探究人员通常将VP1基因克隆进入大肠杆菌的表达载体中，并通过诱导表达蛋白。

在真核表达系统中，探究人员通常将VP1基因克隆到哺乳动物的表达载体中，使其在哺乳动物细胞中表达蛋白。

这两种方法各有优缺点，探究人员选择合适的方法依据试验的需要。

对于VP1蛋白的制备，无论是原核表达系统仍是真核表达系统，都需要对表达蛋白进行纯化。

通常接受亲和纯化的方法，如利用His标签或GST标签将VP1蛋白与亲和基质结合，然后通过洗脱和浓缩等步骤纯化蛋白。

此外，也可以接受离心沉降、离子交换等方法对蛋白进行分离纯化。

纯化后的VP1蛋白可以用于后续的免疫学探究和动物试验。

除了VP1蛋白的表达和纯化，制备单克隆抗体也是重要的探究内容。

制备单克隆抗体过程包括抗原免疫、脾细胞融合、细胞培育和筛选等步骤。

在制备过程中，探究人员起首将纯化的VP1蛋白作为免疫原进行小鼠的免疫，使小鼠产生抗VP1蛋白的抗体。

然后，从免疫小鼠的脾脏中提取脾细胞和骨髓细胞，与魔鬼鱼瘤细胞进行融合形成杂交瘤细胞。

接下来，筛选合适的杂交瘤细胞，培育并收集细胞上清液，即为含有单克隆抗体的培育液。

最后，通过亲和层析等方法纯化单克隆抗体。

我国人细小病毒B19VP1独特区基因片段的克隆及表达

我国人细小病毒B１９VP１独特区基因片段的克隆及表达摘要】目的构建人细小病毒B１９中国株结构蛋白VP１基因片段的重组表达载体,获得大量表达的VP１蛋白.方法从我科保存的人细小病毒B１９中国株结构蛋白VP１基因片段的重组克隆载体中获得VP１基因片段,将该片段亚克隆入表达载体pRSETA,构建VP１－pRSETA表达载体,并转化至感受态大肠杆菌BL２１中,经IPTG诱导使蛋白表达,在不同表达时间收获细菌,给予不同诱导剂浓度及在不同温度下进行诱导表达,利用蛋白电泳检测VP１蛋白表达情况;超声裂解诱导表达的细菌,收集上清和沉淀进行蛋白电泳,分析表达蛋白的溶解性.结果成功构建了融合蛋白VP１－pRSETA 的重组表达质粒,表达的融合蛋白经１５％SDS－PAGE电泳证实大小为２．２kd结论获得人细小病毒B１９中国株结构蛋白VP１基因片段的原核表达载体及其产物,对进一步研究其纯化及制备单克隆抗体和疫苗有重要意义.【关键词】人细小病毒B１９;VP１基因片断;载体构建;诱导表达【中图分类号】R４５７【文献标识码】B【文章编号】１００１－５３０２(２０１５)０９－０８８８－０１１材料和方法１．１材料１．１．１含有B１９病毒中国株VP１基因片段重组载体VP１－pQE３０的大肠杆菌JM１０９由我科保存,该质粒保存前在上海基康公司用ABI３７００自动测序仪测序,为正确的重组质粒.１．１．２pRSET A 载体购自Invitrogen公司,大肠杆菌BL２１、DH５α为本室保存.１．１．３胶回收试剂盒,质粒提取试剂盒为华舜生物工程公司产品,限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司,DNA连接酶购自Promega公司.２方法２．１B１９病毒中国株VP１基因片段的获得将含有B１９病毒中国株VP１基因片段重组载体VP１－pQE３０的JM１０９菌株复苏,增菌后提质粒,进行BamHI和PstI双酶切,酶切产物用１％琼脂糖凝胶电泳进行分析,将VP１片段经胶回收纯化.２．２pRSETA载体的酶切和纯化将含有pRSETA质粒的DH５α菌株复苏,增菌后提质粒,进行BamHI和PstI双酶切,酶切产物进行１％琼脂糖凝胶电泳,将pRSETA 载体经胶回收纯化.２．３原核表达载体的构建将上述酶切并纯化的产物进行连接反应,反应体系为:VP１６μL,pRSETA载体２μL,１０×buffer２μL,DNA 连接酶１μL,去离子水９μL,１８℃反应１６小时.２．４原核表达载体的鉴定随机挑取３个白色菌落,经BamH１、PstI双酶切,酶切产物进行１％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,确认质粒构建成功.２．５诱导融合蛋白的表达将VP１－pRSETA转化感受态大肠杆菌BL２１,将转化成功的大肠杆菌BL２１经方法４酶切鉴定后,３７℃振荡过夜培养,再按１:５０的比例接种LB 培养基,３７℃剧烈振荡培养３小时,加入IPTG 诱导融合蛋白的表达.采用不同的IPTG浓度,３７℃分别进行诱导表达４小时;给予IPTG１mM,３７℃进行诱导表达,在不同时间(１、２、３、４、５、６小时)收集细菌;给予IPTG１mM,在３７℃,３０℃,２５℃下分别进行诱导表达４小时,将收集的细菌进行１５％SDSPAGE,检测目的蛋白的表达情况.２．６表达产物溶解性分析大量诱导VP１－pRSETA 转化的大肠杆菌BL２１进行表达,收集细菌,经超声破碎,４℃,５５００rpm/分钟离心１０分钟,分别收集上清和沉淀,同时进行１５％SDS－PAGE.３结果３．１VP１片段和pRSETA 载体的酶切和纯化将VP１－pQE３０和pRSETA 经BamH１、PstI双酶切的产物进行１％琼脂糖凝胶电泳,分别切取４８０bp和２．９kb附近的条带,进行胶回收.３．２表达载体的构建将构建的原核表达载体VP１－pRSETA经BamH１、PstI双酶切,酶切产物经１％琼脂糖凝胶电泳,证实载体构建成功３．３诱导表达和表达的优化在约２２KD 附近,诱导后的细菌有大量融合蛋白表达.采用不同的IPTG浓度诱导表达４小时,０．０１mM 至２mM 均有表达,诱导剂浓度为０．５mM 时,表达率最高,为１９．６％(表１);固定IPTG浓度为１mM 进行诱导表达,１小时后即有表达,５小时后表达率最高,为１９．９％(表２);IPTG 浓度为１mM 进行诱导表达４小时,３７℃下表达率最高,３０℃下有表达,２５℃下几乎无表达.表１不同诱导剂浓度诱导的蛋白表达率４表达产物的溶解性在大约２２KD附近,诱导后全菌液有大量融合蛋白表达,超声破碎后的上清中均有融合蛋白,沉淀中融合蛋白的量较大,提示蛋白主要存在于包涵体中,也有部分可溶性表达．５讨论pRSET载体是pUC来源的高效原核表达载体,具有T７启动子和一段编码N末端融合蛋白的序列.该序列包括ATG翻译起始密码子,编码可作为翻译蛋白的金属粘连区域的６个组氨酸残基的序列,使转录过程稳定进行的序列,抗Xpress表位和肠激酶裂解识别序列.其中金属粘连区域可使重组蛋白通过固相金属亲和层析法获得纯化蛋白,而肠激酶裂解识别位点可使N末端融合蛋白与纯化的重组蛋白分离.插入的DNA即位于该融合蛋白序列的下游.因此,将VP１蛋白克隆至pRSETA 载体中,既有利于VP１蛋白的高效、稳定表达,又有利于VP１蛋白的进一步制备和纯化.本实验中,作者构建了VP１－pRSETA原核表达载体,经限制性内切酶双酶切和DNA 电泳证实构建成功.将构建成功的VP１－pRSET A 原核表达载体转化感受态BL２１,在IPTG诱导下可表达融合蛋白,经SDS－PAGE证实为２２KD的融合蛋白.进一步可利用pRSET载体的６－His标签对所表达的融合蛋白进行纯化.原核表达系统常受到目的基因本身的结构特点、转录水平的调节和蛋白质水平等诸多因素的影响.克隆化基因表达水平低下的原因可能归于RNA不稳定、过早终止、无效翻译及蛋白质不稳定.在许多情况下,蛋白质不稳定的问题可通过提高外源蛋白的合成量进行克服.首先要选择可高效表达外源蛋白的原核表达载体和菌株,其次可通过改变诱导物的量、诱导温度等策略来改变合成的动力学.本实验中,作者通过蛋白电泳观察了不同的诱导剂浓度、不同诱导温度和不同的诱导时间等条件下,细菌表达融合蛋白的情况,探索最佳的诱导表达条件,使VP１蛋白的表达达到最高量.结果提示VP１融合蛋白能在大肠杆菌BL２１中稳定表达,其最佳条件是,阳性克隆菌过夜后,增菌３－４小时开始诱导表达,IPTG 浓度０．５mM,于３７℃诱导５小时.我们还对诱导表达后的细菌进行了超声破碎,并分别对上清和沉淀进行了SDS－PAGE,结果提示在沉淀和上清中均有VP１融合蛋白的表达,主要在沉淀中,提示VP１蛋白主要表达在包涵体中.因此,下一步进行纯化时,首先要制备包涵体,再对包涵体进行纯化.参考文献[１]张国成,许东亮,王晓明等．国人细小病毒B１９感染相关疾病谱．第四军医大学学报,１９９９,(６):４９５－４９８．[２]张国成,孙新,许东亮等．我国人细小病毒B １９VP１和VP２部分基因序列测定及变异分析．第四军医大学学报,２００２,２３(４):２９７－２９９．[３]卢银平,曹伟,洪梅等．人细小病毒B１９感染与习惯性流产的关系探讨[J]．中国妇幼保健,２００７,２２(３０):４３３４－４３３５．[４]柳红,杨来智,何莉等．人细小病毒B１９,B族链球菌和解脲支原体与早产关系的研究[J]．中国妇幼保健,２００７,２２(７):９２０－９２１．[５]许东亮,张国成,聂晓晶等．小儿血液系统疾病人细小病毒B１９感染的研究[J]．陕西医学杂２０１４．０９．００１．。

PBDC1蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

PBDC1蛋白的表达及其多克隆抗体的制备戚武林;胡江江;曹玲玲;赵辅昆;张世馥【摘要】目的原核表达、纯化PBDC1蛋白,制备PBDC1多克隆抗体.方法将PBDC1基因克隆到pET-28a(+)质粒中,构建成重组质粒pET-28a(+)-PBDCI.将此重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)后,IPTG诱导其在宿主菌中大量表达,并进行SDS-PAGE检测.经镍离子亲和柱纯化得到PBDC1融合蛋白,并以此免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.结果经质谱鉴定,获得了高纯度的PBDC1蛋白.经Western blot验证,获得了抗PBDC1蛋白的多克隆抗体.结论成功获得抗PBDC1蛋白的多克隆抗体,为研究PBDC1在红系分化中的功能提供了有利工具.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2014(034)002【总页数】4页(P222-225)【关键词】PBDC1蛋白;多克隆抗体【作者】戚武林;胡江江;曹玲玲;赵辅昆;张世馥【作者单位】浙江理工大学生命科学学院蛋白质组学与分子酶学研究室,浙江杭州310018;浙江理工大学生命科学学院蛋白质组学与分子酶学研究室,浙江杭州310018;浙江理工大学生命科学学院蛋白质组学与分子酶学研究室,浙江杭州310018;浙江理工大学生命科学学院蛋白质组学与分子酶学研究室,浙江杭州310018;浙江理工大学生命科学学院蛋白质组学与分子酶学研究室,浙江杭州310018【正文语种】中文【中图分类】Q511多糖生物合成域1蛋白(polysaccharide biosynthesis domain-containing 1，PBDC1)含有198个氨基酸，分子质量约为22.2 ku。

在丁酸钠(sodium butyrate，SB)［1－2］诱导小鼠红白血病(murine erythroleukemia，MEL)细胞［3］分化的差异蛋白质组中，发现了PBDC1蛋白含量在细胞红系分化过程中逐渐下调。

塞内卡病毒A VP1蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备与初步应用

塞内卡病毒A VP1蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备与初步应用彭宛清;钱炳旭;廖凯;董雨豪;薛峰;尼博;薛青红;戴建君【期刊名称】《中国兽医科学》【年(卷),期】2022(52)7【摘要】塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)感染猪可引起口鼻、蹄和冠状动脉带等部位出现水疱,严重危害猪的健康。

VP1蛋白是SVA重要的结构蛋白,含有病毒主要的抗原表位并可诱导猪产生中和抗体。

本研究采用原核表达系统,将VP1基因分别克隆入表达载体pET32a和pGEX6P1中构建重组质粒,通过优化诱导表达条件,利用亲和层析介质纯化,成功制备了重组蛋白VP1-His和VP1-GST。

以纯化的VP1-His蛋白免疫BALB/c小鼠,以纯化的VP1-GST蛋白建立间接ELISA,成功筛选获得3株稳定分泌抗VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株3A2、5D12和6G10,经Western-blot及间接ELISA鉴定,3株单克隆抗体具有良好的特异性,其腹水效价分别为1∶51200、1∶25600、1∶12800。

应用效价最高的3A2抗体初步建立了检测猪血清中抗SVA抗体的竞争ELISA。

临床样品检测结果表明,建立的竞争ELISA具有高敏感性,高特异性和高准确性。

VP1蛋白单克隆抗体的制备为SVA致病机制的研究提供了材料支撑;竞争ELISA的建立对于SVA感染的防控具有重要意义。

【总页数】8页(P867-874)【作者】彭宛清;钱炳旭;廖凯;董雨豪;薛峰;尼博;薛青红;戴建君【作者单位】南京农业大学动物医学院;中国动物卫生与流行病学中心;中国兽医药品监察所;中国药科大学【正文语种】中文【中图分类】S852.659.6【相关文献】1.A型塞内卡病毒VP2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备2.A型塞内卡病毒VP1结构蛋白在昆虫杆状病毒中的表达与鉴定3.A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备4.A型塞内卡病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定5.A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及纯化因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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了ＥＣＨＯ９的ＶＰ１蛋白并制备出抗ＶＰ１多克隆抗体，有助于ＥＣＨＯ９的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究。关键词：埃可病毒９型；病毒性脑炎；ＶＰ１基因；多克隆抗体
中图分类号：Ｒ３７３．２４文献标识码：Ａ文章编号：１００４— ８６８５（２０１５）０７— ０９５１— ０４
Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｘｐｒｅｓｓａｎｄｐｕｒｉｆｙｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎＶＰ１ｏｆｅｃｈｏｖｉｒｕｓｔｙｐｅ９（ＥＣＨＯ９），ａｎｄｐｒｅｐａｒｅ
邱晓枫，黄志成，张国忠，濮小英，潘劲草，王咪咪
杭州市疾病预防控制中心，浙江杭州３１００２１
摘要：目的
原核表达并纯化埃可病毒９型（ＥＣＨＯ９）ＶＰ１蛋白，免疫兔子制备多克隆抗体，鉴定重组蛋白的免疫活性，
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ０ｆＶＰ１ｐｒｏｔｅｉｎｏｆｅｃｈｏｖｉｒｕｓ９ｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｐｏｌｙｅｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇＶＰ１一ｓｐｅｃｉｉｆｃｐｏｌｙｅｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｎｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｉｍｍｕｎｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｅｘｐｒｅｓｓｅｄｐｒｏｔｅｉｎｉｎｏｒｄｅｒｔｏｂｕｉｌｄａｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｗｏｒｋｏｆｖａｃｃｉｎｅａｎｄｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａｎｔｉｇｅｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅ１ｇｅｎｅｗａｓａｍｐｌｉｉｆｅｄｂｙＰＣＲａｎｄｃｌｏｎｅｄ
ｉｎＥｃｏｌｉＢＬ２１ｈｒｂａｏｉｎｒｇｐＥＴ２８ａ—ＶＰ１，ｐｕｉｒｉｆｅｄｆｒｏｍｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓ，ｒｅｎａｔｕｒｅｄ，ａｎｄｓｕｂｓｅｑｕｅｎｌｔｙｕｓｅｄｔｏｉｍｍｕｎｉｚｅｒａｂ．ｂｉｔｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔａｎｔａｎｔｉｓｅｒａｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄｏｒｆａｎｔｉ —ＶＰ１ｔｉｔｅｒ，ｂｉｎｇｄｉｎｇｃａｐａｃｉｔｙａｎｄｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙｂｙＥＬＩＳＡ，Ｗｅｓｔｅｎｒｂｌｏｔａｓ－ｓａｙｓ．Ｔｈｒｏｕｇｈｖｉｒｕｓｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｔｅｓｔ，ｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｔｏｎｅｕｔｒａｌｉｚｅＥｃｈｏ９ｏｆａｎｔｉｓｅｒａ．ＲｅｓｕｌｔｓＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＶＰ１
ＱＩＵＸｉａｏ— ｆｅｎｇ，ＨＵＡＮＧＺｈｉ —ｃｈｅｎｇ，ＺＨＡＮＧＧｕｏ— ｚｈｏｎｇ，ＰＵＸｉａｏ— ｙｉｎｇ，ＰＡＮＪｉｎ—ｃａｏ，ＷＡＮＧＭｉ —ｍｉＨａｎｇｚｈｏｕＣｅｎｔｅｒｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ，ａｎｇ３１００２１，Ｃｈｉｎａ
ｉｎｔｏｖｅｃｔｏｒｏｆｐＥＴ２８ａｔｏｍａｋｅｐＥＴ２８ａ—ＶＰ１ｏｒｆｔｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＶＰ１．ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＶＰ１ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
中国卫生检验杂志２０１５年 பைடு நூலகம்月第２５卷第７期
ＣｈｉｎＪＨｅｌａｔｈＬａｂＴｅｃ，Ａｐｒ．２０１５，Ｖ０１．２５，Ｎｏ．７
・９５１・
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实验研究・
埃可病毒９型ＶＰ１蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
为ＥＣＨＯ９血清学检测试剂和疫苗研究提供依据。方法ＰＣＲ方法扩增１基因，构建原核表达质粒ｐＥＴ２８ａ —ＶＰ１并转化到大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉＢＩ２１），诱导表达并纯化ＶＰ１重组蛋白，免疫兔子制备抗ＶＰ１多克隆抗体，ＥＬＩＳＡ检测抗ＶＰ１抗体效价，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定抗体特异性。病毒中和试验鉴定抗体中和ＥＣＨＯ９病毒的能力。结果ＶＰ１重组蛋白在大肠杆菌ＢＬ２１中高效表达，制备的抗ＶＰ１抗体效价为１：１０。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测结果显示，抗ＶＰ１多克隆抗体可以识别原核表达的ＶＰ１蛋白。中和试验显示抗体对ＥＣＨＯ９病毒有中和作用，其效价为１：１０。结论本研究成功原核表达