酿酒酵母表面展示表达系统及应用ppt课件
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酿酒酵母表面展示表达系统及应用PPT课件
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5
凝集素展示表达系统
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凝集素展示表达系统
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凝集素展示表达系统
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絮凝素展示表达系统
絮凝素Flo1p 是一种新兴的展示系统,它是酿酒酵母细 胞表面类似凝集素的细胞壁蛋白。 • 目前，已经形成了两种类型的絮凝素展示系统 ： • 一是GPI 系统 ；根据目的蛋白的特性和实验目的确定截去 Flo1p 肽段的长度,然后,目的蛋白的C 端融合到锚定序列 上。 • 二是利用Flo1p 的絮凝结构域的黏附能力创建一个表面展 示系统。
酿酒酵母表面展示表达系统及应 用
报告人：刘顺
2010.11.10
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1
主要内容 1 概念
2
两种系统
3
应用
4
优缺点
.
2
一、概念
酿酒酵母表面展示表达系统： 一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统，
即把异源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列融 合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母细胞内蛋白转运 到膜表面的机制（糖基磷脂酰肌醇，GPI锚定）， 使靶蛋白表达并定位于酵母细胞表面，之后用葡聚 糖酶抽提细胞壁目的蛋白。
.
9
GPI 系统
.
10
絮凝结构域系统
Байду номын сангаас
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11
应用
近几年来，酿酒酵母细胞表面展示表达系统迅速发 展并在多个领域获得应用，展现出广阔的发展前景。 1、作为生物催化剂展示表达各种酶蛋白：
淀粉分解酶、纤维素分解酶、脂酶 2、环境治理中展示表达金属蛋白 3、蛋白质分子的相互作用及组合蛋白库的构建 4、可作为生物传感器的荧光蛋白的展示表达 5、免疫学中的应用
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13
酿酒酵母PPT
• 如果能够彻底阐释清楚酿酒酵母在氮源代谢过程中的复杂调控途径,那么就能通过生物工程手段有目的地对 其进行改造,使得能够优先快速利用精氨酸、尿素,从根本上减少EC前提物质的积累,从而降低甚至消除发酵 食品中的这种有害物质.不光对于氨基甲酸乙酯,对于生物胺、亚硝酸胺等其他的危害物,也能通过NCR的方 法来从根本上减少和降低它们在发酵食品中的残留量.
酿酒酵母氮代谢物阻遏效应及其对发酵食品安全的影响
• 影响我国传统发酵食品安全最为重要的因素,是各种由于发酵过程中含氮化合物的不完全代谢而生成的胺(氨) 类物质,如氨基甲酸乙酯、亚硝胺类和生物胺类等.其中氨基甲酸乙酯具有一定的神经毒性、强烈的肺毒性和 较强的致癌性[1],亚硝胺类和生物胺类会刺激神经、血管,也有较强的致癌性[2].长期摄入微量的胺(氨)类物质 也会显著增加各种癌症的发病率.胺(氨)类物质的存在,严重影响了我国传统发酵食品的安全性,限制了我国传 统发酵食品的出口贸易和食品文化影响力.最为重要的是,我国传统发酵食品中存在的多种生物危害物质与传 统的原料、生产工艺以及微生物生理特性密切相关,是我国特有的食品安全问题,必须通过我国科研人员的自 主研究才能得以妥善解决.
酿酒酵母
汇报人：
目录
CONTENTS
1
酿酒酵母的介绍
2
形态及繁殖方式
3
利弊相结合
4
酿酒酵母的应用
酿酒酵母的介绍
别名：啤酒酵母 界：真菌界 门：真菌门 纲：子囊菌纲 目：酵母目 科：酵母菌科 属：酵母菌属 种：酿酒酵母
酿酒酵母，又称面包酵母或者出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，用 于制作面包和馒头等食品及酿酒。酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5-10μm。其繁 殖的方法为出芽生殖。酿酒酵母与同为真核生物的动物和植物细胞具有很多相同的结构， 又容易培养，酵母被用作研究真核生物的模式生物。 酿酒酵母被认为是最具潜力的大规 模生产菌种。野生型酿酒酵母的主产物为乙醇。
酿酒酵母氮代谢物阻遏效应及其对发酵食品安全的影响
• 影响我国传统发酵食品安全最为重要的因素,是各种由于发酵过程中含氮化合物的不完全代谢而生成的胺(氨) 类物质,如氨基甲酸乙酯、亚硝胺类和生物胺类等.其中氨基甲酸乙酯具有一定的神经毒性、强烈的肺毒性和 较强的致癌性[1],亚硝胺类和生物胺类会刺激神经、血管,也有较强的致癌性[2].长期摄入微量的胺(氨)类物质 也会显著增加各种癌症的发病率.胺(氨)类物质的存在,严重影响了我国传统发酵食品的安全性,限制了我国传 统发酵食品的出口贸易和食品文化影响力.最为重要的是,我国传统发酵食品中存在的多种生物危害物质与传 统的原料、生产工艺以及微生物生理特性密切相关,是我国特有的食品安全问题,必须通过我国科研人员的自 主研究才能得以妥善解决.
酿酒酵母
汇报人：
目录
CONTENTS
1
酿酒酵母的介绍
2
形态及繁殖方式
3
利弊相结合
4
酿酒酵母的应用
酿酒酵母的介绍
别名：啤酒酵母 界：真菌界 门：真菌门 纲：子囊菌纲 目：酵母目 科：酵母菌科 属：酵母菌属 种：酿酒酵母
酿酒酵母，又称面包酵母或者出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，用 于制作面包和馒头等食品及酿酒。酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5-10μm。其繁 殖的方法为出芽生殖。酿酒酵母与同为真核生物的动物和植物细胞具有很多相同的结构， 又容易培养，酵母被用作研究真核生物的模式生物。 酿酒酵母被认为是最具潜力的大规 模生产菌种。野生型酿酒酵母的主产物为乙醇。
酿酒酵母孢子表面展示系统的构建及应用
而父 于利 ｆ ¨ 涨 酵 母孢 子 来 进 行
未 报 道
腱 示 的 办 法还
酿 涧 酵母 以酣 酸盐 为唯 一或 卡婴碳源 ， 并 辅 以 缺乏氮 源等 特定 条什 下 ， 就会 以孢 子， ｆ ｆ 的力 式 进行
繁 ， ： 胞『 』 、 Ｊ 形 成 孢 孢 子 啭 有 ４层 结 构 ， 山
Ｇ Ｐ Ｏ， Ｅ ． Ｃ １ ． １ ． ３ ． ２ １ ） 能够 々一 地 催化 Ｌ 一 ３ 一 磷 酸 汕 的氰 化 ， ， 卜成 磷 峻 二 羟 丙 酮 （ （ １ ｉ ｈ ｙ （ １ ｒ ０ ｘ ｙ ａ （ ０ ｎ ｅ ｐ ｈ （ ｐ ｈ ａ ｔ ｅ ，Ｄ Ｈ Ａ Ｐ ） Ｇ Ｐ Ｏ普 遍 存 在 于 链 球 菌 、 乳 酸 、 大
摘 要 旨在 建 立 １种酿 酒 酵 母 孢 子 表 面 展 示 系统 ， 并 将 其 应 用 于 稀 有糖 合 成 。 表 面 展 示 系 统 是 运 用 微 生 物 自 身功 能 把 外 源 蛋 白或 多肽 展 示 在 细 胞 表 面 ， 文 中用 磷 酸 甘 油 氧 化酶 （ Ｇ ｆ Ｏ） 来 验 证 酿 酒 酵 母 孢 子 表 面展 示 糸 统 的 可 行性 将 编 码 肺 炎链 球 诗 束 源 的 （ Ｐ ０的基 因 ｇ ｏ ， ｏ 与信 号 肽 序 列 （ ｓ ｓ ） 融 合后连接 到载体 ｐ Ｒ Ｓ ４ ２ ４ 一 Ｔ Ｅ Ｆ ｐ ｒ上 ， 将 重组质 粒 ｐ Ｒ Ｓ ４ ２ ４ 一 Ｔ Ｅ Ｆ ｐ ｒ — 一 ｇ Ｏ ｏ转 化至 酿 酒 酵母 野 生 型 及 缺 陷 型 菌 株 中并 进 行 产 孢 ， 通 过 荧 光观 察 、 ｗ ｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ 分惭 以及 酶 活测 宅 ， 表 明酿 酒 酵 母 缺 陷 型孢 子 可 以 实 现 蛋 白的 表 面 展 示 通过对 Ｇ Ｐ Ｏ孢子表征， 表明Ｇ Ｐ Ｏ孢 子
酿酒酵母表面展示表达系统及应用
４ 能够展示表达 １ ０ 个凝集素蛋白， 更利于高效表达具有
。Ｇ Ｐ Ｉ 锚定区域与细胞蛋白的 Ｃ 端共价相 ?
连， 为蛋白与细胞膜提供稳定的连接。Ｇ Ｐ Ｉ 锚定蛋白的 Ｃ 端包含疏水多肽， 当细胞蛋白被合成， 前体蛋白通过 ? 羧基末端的疏水序列锚定在内质网膜上， 其余蛋白则 位于内质网的内腔中。在极短的时间内， 疏水序列在 Ｐ Ｉ 锚置换， 转酰氨基酶作用下 ω位点裂开并同时被 Ｇ 然后蛋白被运输到高尔基体再通过分泌途径分泌至细 胞膜外。在蛋白水解酶作用下， 分泌信号序列被切除， Ｉ Ｐ Ｌ Ｃ从细胞膜上释放以 Ｇ Ｐ Ｉ 锚定形式与 细胞蛋白被 Ｐ ?
２ ］ 葡聚糖共价相连并被转运至细胞壁外 ［ 。可在许多真 ［ ３ ］ 核生物的质膜蛋白中发现 Ｇ Ｐ Ｉ ， 其结构高度保守。酵
生物活性的复杂蛋白。
１ 酵母细胞表面展示表达系统构成
１ ． １ 载 体 一个成功的表达载体应满足 ４个条件： （ １ ） 具有信 号肽序列， 使已经表达的融合蛋白能够被分泌至细胞 外； （ ２ ） 具有较强的定位结构使融合蛋白固定于细胞表 ３ ） 与外源蛋白融合后， 载体蛋白的定 面而不能脱落； （ 位特性和外源蛋白的生物活性不会改变； （ ４ ） 在宿主菌 株中能稳定存在， 不会被细胞壁膜之间和培养基中的
中国生物工程杂志 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａＢ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， ２ ０ ０ ８ ， ２ ８ （ １ ２ ） ： １ １ ６～ １ ２ ２
酿酒酵母表面展示表达系统及应用
郭 钦１ 张 伟２ 阮 晖１ 何国庆１ （ １浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州 ３ １ ０ ０ ２ ９ ２温州医学院 温州 ３ ２ ５ ０ ３ ５ ）
３ 酿酒酵母细胞表面展示表达系统的应用
。Ｇ Ｐ Ｉ 锚定区域与细胞蛋白的 Ｃ 端共价相 ?
连， 为蛋白与细胞膜提供稳定的连接。Ｇ Ｐ Ｉ 锚定蛋白的 Ｃ 端包含疏水多肽， 当细胞蛋白被合成， 前体蛋白通过 ? 羧基末端的疏水序列锚定在内质网膜上， 其余蛋白则 位于内质网的内腔中。在极短的时间内， 疏水序列在 Ｐ Ｉ 锚置换， 转酰氨基酶作用下 ω位点裂开并同时被 Ｇ 然后蛋白被运输到高尔基体再通过分泌途径分泌至细 胞膜外。在蛋白水解酶作用下， 分泌信号序列被切除， Ｉ Ｐ Ｌ Ｃ从细胞膜上释放以 Ｇ Ｐ Ｉ 锚定形式与 细胞蛋白被 Ｐ ?
２ ］ 葡聚糖共价相连并被转运至细胞壁外 ［ 。可在许多真 ［ ３ ］ 核生物的质膜蛋白中发现 Ｇ Ｐ Ｉ ， 其结构高度保守。酵
生物活性的复杂蛋白。
１ 酵母细胞表面展示表达系统构成
１ ． １ 载 体 一个成功的表达载体应满足 ４个条件： （ １ ） 具有信 号肽序列， 使已经表达的融合蛋白能够被分泌至细胞 外； （ ２ ） 具有较强的定位结构使融合蛋白固定于细胞表 ３ ） 与外源蛋白融合后， 载体蛋白的定 面而不能脱落； （ 位特性和外源蛋白的生物活性不会改变； （ ４ ） 在宿主菌 株中能稳定存在， 不会被细胞壁膜之间和培养基中的
中国生物工程杂志 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａＢ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， ２ ０ ０ ８ ， ２ ８ （ １ ２ ） ： １ １ ６～ １ ２ ２
酿酒酵母表面展示表达系统及应用
郭 钦１ 张 伟２ 阮 晖１ 何国庆１ （ １浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州 ３ １ ０ ０ ２ ９ ２温州医学院 温州 ３ ２ ５ ０ ３ ５ ）
３ 酿酒酵母细胞表面展示表达系统的应用
酵母细胞表面展示
2. 酵母表面展示系统弥补了噬菌体展示技术的此项不足 ,能使复 杂真核蛋白得到展示, 同时又保留了噬菌体表面展示技术的便于 筛选、 扩增等优点 。
酵母细胞展示系统在高通量筛选应用中的优点
1. 酿酒酵母的蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动物细胞非常 相似，因而比原核细胞更能正确表达和展示人的蛋白质。 2. 与噬菌体不同，酵母是个足够大的颗粒，可用流式细胞仪 进行筛选和分离，这就使得基于特异定量亲和力改变的突变体 分离成为可能。 3. 由于酵母展示的蛋白质是紧密锚定在细胞壁上，可以耐受 SDS等的抽提，同时酵母有发酵特性且生长快，因此在工业上具 有很好的应用前景。 4. 在应用过程中，细胞表面展示技术结合流式细胞仪在筛选 的高通量和测定单细胞水平的酶动力学之间达成很好平衡。甚 至在高密度的固体形态或微量滴定量L板测活，也能准确定量酶 的活力。
絮凝素展示表达
絮凝素展示表达系统利用絮凝素基因与外源蛋白融合,并将 融合蛋白展露表达在细胞表面，此系统又包括两个子统: GPI锚定系统和絮凝结构域锚定系统。
• GPI锚定系统是利用絮凝素 FLo1p的 C -末端含有的GPI 信号锚定外源蛋白,此系统 与凝集素展示相似。
• 絮凝结构域锚定系统是利用 FLo1p的中间絮凝功能结构 域与外源蛋白融合，通过絮 凝功能结构域识别酵母细胞 壁中的甘露聚糖链并非共价 作用诱导细胞粘附、聚集成 可逆性絮状物。
酵母细胞表面展示技术在高通量筛选 中的应用
1 2 3
高通量筛选的概念
高通量筛选的技术过程
酵母细胞展示在HTS中的主要应用
高通量筛选（HTS）又称大规
模集群式筛选，是由高容量化合 物库、自动化操作、高灵敏度检 测、高特异筛选模型、高效率数 据处理5个子系统有机组合而成， 是一种新型的筛选技术。
酵母表面展示技术及其应用
糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定系统
根据4段重复序列的位置不同,利用Flo1 蛋白C端含有GPI锚定附着信号的区域 , 建立了6个锚定长度不同的GPI展示系统。 根据目的蛋白的特性和展示目的选用锚 定长度不同的GPI展示系统,将目的蛋白 的C端融合到锚定序列上。
第8页
二、酵母展示系统类型
絮凝结构域锚定系统
cell-surface
应用 Application
受体 Receptor
筛选特异配体 、研究抗体结合位点
Protein recognition
抗原 Antigen
未知功能的目的基因产物 Unknown functional
product of target gene 特定病理过程相关蛋白 Protein related to specific pathological process
三、酵母表面展示技术优点
04
a-凝集素系统中外源蛋白通过二硫键与细胞壁相连, 因此可用还原 剂将二硫键打断,使目的蛋白从细胞表面解离，分离纯化方便。
05 对展示在细胞表面的单个克隆的突变特性、酶的活性无需进行蛋 白质的水溶性表达和纯化,可以直接在全细胞基础上测定，活性测 定方便。
第 11 页
四、酵母表面展示技术应用
α-凝集素 (Agα)系统
α-凝集素由Ag α1基因编码, 仅有1个核心亚基。其C端的320个氨 基酸残基 (富含丝氨酸和苏氨酸的支持区及GPI锚定蛋白附着信号 区 )与细胞壁葡聚糖共价结合,使其锚定在细胞壁上。目的蛋白的C 端与α-凝集素的N端融合,实现目的蛋白的细胞表面展示。
第6页
二、酵母展示系统类型
展示的融合蛋白相对分子质量范围大，分子数量多；研究发现相
02 对分子质量在0.93×106 Da 和136×106 Da之间的分子均可展示 于酵母菌表面,且每个酵母表面可展示104～105 个分子。
根据4段重复序列的位置不同,利用Flo1 蛋白C端含有GPI锚定附着信号的区域 , 建立了6个锚定长度不同的GPI展示系统。 根据目的蛋白的特性和展示目的选用锚 定长度不同的GPI展示系统,将目的蛋白 的C端融合到锚定序列上。
第8页
二、酵母展示系统类型
絮凝结构域锚定系统
cell-surface
应用 Application
受体 Receptor
筛选特异配体 、研究抗体结合位点
Protein recognition
抗原 Antigen
未知功能的目的基因产物 Unknown functional
product of target gene 特定病理过程相关蛋白 Protein related to specific pathological process
三、酵母表面展示技术优点
04
a-凝集素系统中外源蛋白通过二硫键与细胞壁相连, 因此可用还原 剂将二硫键打断,使目的蛋白从细胞表面解离，分离纯化方便。
05 对展示在细胞表面的单个克隆的突变特性、酶的活性无需进行蛋 白质的水溶性表达和纯化,可以直接在全细胞基础上测定，活性测 定方便。
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四、酵母表面展示技术应用
α-凝集素 (Agα)系统
α-凝集素由Ag α1基因编码, 仅有1个核心亚基。其C端的320个氨 基酸残基 (富含丝氨酸和苏氨酸的支持区及GPI锚定蛋白附着信号 区 )与细胞壁葡聚糖共价结合,使其锚定在细胞壁上。目的蛋白的C 端与α-凝集素的N端融合,实现目的蛋白的细胞表面展示。
第6页
二、酵母展示系统类型
展示的融合蛋白相对分子质量范围大，分子数量多；研究发现相
02 对分子质量在0.93×106 Da 和136×106 Da之间的分子均可展示 于酵母菌表面,且每个酵母表面可展示104～105 个分子。
酿酒酵母表面展示表达系统及应用PPT课件
•12
•2
二、两种系统
•
酿酒酵母细胞壁主要由外层的甘露糖ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ白和内层的葡
聚糖骨架组成，两者通过共价健相连。外层甘露糖蛋白有
两种类型：
• 一种是通过非共价健与酵母细胞壁松散相连并能被ＳＤＳ 提取出来的低分子量蛋白；
• 一种是必须被葡聚糖酶酶解细胞壁的β-１，3-和β-１，６葡聚糖层后才能被ＳＤＳ抽提的高分子量蛋白，包括凝集 素、絮凝素、Sed1p、Cwp1p、 Cwp 2p和Tip1p、Tir1p 、Srp1p等。后者的结构中大多都含有GPI锚定区域
•11
问题和展望
优点 1、可克隆较大外源蛋白 2、对表达的外源蛋白质进行有效的折叠、糖基化和形成二硫键,并与葡
聚糖共价结合，耐SDS 抽提 3、酵母生产快,容易培养，展示蛋白能稳定地在子代细胞中表达 4、表达的蛋白可用荧光激活细胞分选仪(FACS) 进行灵敏而方便地检测
和筛选 缺点： 1、天然活性不够，表达的蛋白可能不完整 2、表达量也不够,而且酒精往往会抑制生长 3、多拷贝载体不稳定，整合载体则拷贝数低，表达的蛋白量少
• 其中分别由AGα1、AGa1／AGa2和Flo1表达异源蛋白的 凝集素和絮凝素酵母细胞展示表达系统应用较多。
•3
凝集素展示表达系统
α凝集素和ａ凝集素是酵母细胞壁上的两种甘露糖 蛋白，它们在酿酒酵母的交配型α（ＭＡＴα ）和 交配型ａ（ＭＡＴａ）单倍体细胞之间介导细胞 与细胞的性粘附，使细胞融合形成双倍体 。
•8
GPI 系统
•9
絮凝结构域系统
•10
应用
近几年来，酿酒酵母细胞表面展示表达系统迅速发 展并在多个领域获得应用，展现出广阔的发展前景。 1、作为生物催化剂展示表达各种酶蛋白：
•2
二、两种系统
•
酿酒酵母细胞壁主要由外层的甘露糖ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ白和内层的葡
聚糖骨架组成，两者通过共价健相连。外层甘露糖蛋白有
两种类型：
• 一种是通过非共价健与酵母细胞壁松散相连并能被ＳＤＳ 提取出来的低分子量蛋白；
• 一种是必须被葡聚糖酶酶解细胞壁的β-１，3-和β-１，６葡聚糖层后才能被ＳＤＳ抽提的高分子量蛋白，包括凝集 素、絮凝素、Sed1p、Cwp1p、 Cwp 2p和Tip1p、Tir1p 、Srp1p等。后者的结构中大多都含有GPI锚定区域
•11
问题和展望
优点 1、可克隆较大外源蛋白 2、对表达的外源蛋白质进行有效的折叠、糖基化和形成二硫键,并与葡
聚糖共价结合，耐SDS 抽提 3、酵母生产快,容易培养，展示蛋白能稳定地在子代细胞中表达 4、表达的蛋白可用荧光激活细胞分选仪(FACS) 进行灵敏而方便地检测
和筛选 缺点： 1、天然活性不够，表达的蛋白可能不完整 2、表达量也不够,而且酒精往往会抑制生长 3、多拷贝载体不稳定，整合载体则拷贝数低，表达的蛋白量少
• 其中分别由AGα1、AGa1／AGa2和Flo1表达异源蛋白的 凝集素和絮凝素酵母细胞展示表达系统应用较多。
•3
凝集素展示表达系统
α凝集素和ａ凝集素是酵母细胞壁上的两种甘露糖 蛋白，它们在酿酒酵母的交配型α（ＭＡＴα ）和 交配型ａ（ＭＡＴａ）单倍体细胞之间介导细胞 与细胞的性粘附，使细胞融合形成双倍体 。
•8
GPI 系统
•9
絮凝结构域系统
•10
应用
近几年来，酿酒酵母细胞表面展示表达系统迅速发 展并在多个领域获得应用，展现出广阔的发展前景。 1、作为生物催化剂展示表达各种酶蛋白：
《酵母及其应用》课件
过程。
酵母在面包制作中的应用
蓬松纹理
酵母发酵使面团蓬松起来，形成松软的纹理，让面包口感更好。
香气和风味
酵母发酵过程中产生的挥发性化合物赋予面包独特的香气和风味。
长保新鲜
酵母生产的乳酸和醋酸抑制了面包中细菌和真菌的生长，延长了面包的保鲜期。
酵母在饮料制作中将葡萄汁转化为葡萄酒，赋予其丰富的果香和风味。
《酵母及其应用》PPT课
件
欢迎来到《酵母及其应用》PPT课件！本课件将深入探讨酵母的定义、特点以
及在食品、酿造、面包制作、饮料制作、药物生产和环境修复中的广泛应
用。
酵母的定义和特点
1
微生物之王
酵母是一类单细胞真菌，以其广泛存在和快速繁殖而被称为微生物之王。
2
多样性和功能性
酵母种类繁多，具有多种在工业和科研领域中有益用途的特性。
3
生命之源
酵母是生命起源和进化中关键的生物体，对于理解生命的奥秘有重要意义。
酵母在食品加工中的应用
面包制作
啤酒酿造
奶酪制作
酵母是制作美味面包和其他烘焙
酵母在啤酒酿造过程中发酵产生
酵母在奶酪制作过程中发酵产生
食品的关键成分，它们发酵产生
酒精和二氧化碳，并赋予啤酒独
乳酸或酒精，帮助奶酪获得特定
2
梅子酒制作
酵母发酵使梅子的糖分解成酒精和二氧化碳，制作出美味的梅子酒。
3
发酵饮料
酵母在发酵饮料的制作中起着至关重要的作用，如小麦啤酒、苹果酒等。
酵母在药物生产中的应用
抗生素制作
疫苗制备
胰岛素生产
酵母可以用来生产多种抗生素，
酵母在基因工程中被用作产生疫
酵母表达系统-PPT课件
2）基因剂量
外源基因表达存在基因剂量效应 筛选多拷贝整合子
载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数 与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。
体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子 采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子 构建高拷贝整合型表达载体
3）整合位点
外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均 可高效表达
高拷贝整合元件： A、高度重复序列：rDNA 提供多个整合位点 B、缺陷型标记基因：Leu2d
提高选择压力
C、抗性标记；neo 提高选择压力
甲醇酵母系统胞内表达载体
需要带入ATG
表达载体类型
单位点
甲醇酵母系统胞内表达载体
需要带入ATG
多位点
表达载体类型
甲醇酵母系统分泌表达载体
信号肽：PHO1
甲醇酵母系统分泌表达载体
KM71:His+Muts
3’His4
3） 多基因插入事件（串联整合）
宿主株:GS115、KM71
可插入位点： 5’AOX1
3’AOX1
TT
转化子： GS115:His+Mut+ KM71:His+Muts
4） 基因取代（GS115，AOX1+）
转化子：His4+Muts
汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体
信号肽：MFα
甲醇酵母系统分泌表达载体
信号肽：MFα 标记：Kan
4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策
载体稳定性 基因剂量
整合位点
甲醇利用表型 mRNA5’端 AT含量分泌信号 表达产物稳定性
1）载体稳定性
同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高 YRp型载体的稳定化： 选择—非选择培养交替数十代可得稳定的整合子 ，但费时，整合位点不确定。 采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚
酵母及其应用ppt课件
外膜：含磷脂代谢的酶 内膜和嵴：呼吸链组分，ATP合成酶、 琥珀酸脱氢酶等
。 膜间腔：腺苷酸激酶、磷酸腺苷酸激酶 嵴间腔：TCA循环的酶等
.
内质网
内质网 ： 是存在于细胞质中的、由膜构成的、 呈游离或广泛互相连续的囊泡状的结构 。
种类: 粗糙型内质网 （rough ER） 光滑型内质网（smooth ER）
.
线粒体
1.一种半自主的细胞器，呈球形或棒状, 0.31×0.5—3um，分散在细胞质中。 双层单 位膜包围的 细胞器；其中含脂类、蛋白质、 少量RNA和环状DNA。
2.其DNA可自主复制，不受核DNA控制。决定 线粒体的某些遗传性状。
3.生物氧化中心、能量转换的基地
.
线粒体的功能
▪ 构造
外膜、内膜、嵴、膜间腔、嵴间腔
调节渗透压
.
海藻糖
海藻糖由两分子的吡喃葡萄糖单体以α-1,1糖苷键连接 而成 主要应用： 1：食品方面：改善食品风味、抗氧化、保鲜、延长保 藏期等。 2：生物工程方面：酶保护剂、医药药品的保存等。 3：农业领域：抗旱、抗寒植物、 4：其他方面：化妆品（保湿）等
.
其他结构
质粒 2 um质粒是一个环状、周长2 um的6kb双链DNA分子。可用于研究基因 调控、染色体复制的理想系统，也可作为酵母菌转化的有效载体，并组 建基因工程菌。
生理功能： 起物质传递的作用，另外还有合成脂类和
脂蛋白，与出芽起始有关。
.
核糖体
位于游离的细胞质中或附着在内质网上。 化学组成：与细菌类似 结构：核糖体的沉降系数为80s，它由60s和40s的两个亚基组成
。功能是按照mRNA的指令将氨基酸合成蛋白质多肽链。
.
高尔基体 (高尔基复合体)
。 膜间腔：腺苷酸激酶、磷酸腺苷酸激酶 嵴间腔：TCA循环的酶等
.
内质网
内质网 ： 是存在于细胞质中的、由膜构成的、 呈游离或广泛互相连续的囊泡状的结构 。
种类: 粗糙型内质网 （rough ER） 光滑型内质网（smooth ER）
.
线粒体
1.一种半自主的细胞器，呈球形或棒状, 0.31×0.5—3um，分散在细胞质中。 双层单 位膜包围的 细胞器；其中含脂类、蛋白质、 少量RNA和环状DNA。
2.其DNA可自主复制，不受核DNA控制。决定 线粒体的某些遗传性状。
3.生物氧化中心、能量转换的基地
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线粒体的功能
▪ 构造
外膜、内膜、嵴、膜间腔、嵴间腔
调节渗透压
.
海藻糖
海藻糖由两分子的吡喃葡萄糖单体以α-1,1糖苷键连接 而成 主要应用： 1：食品方面：改善食品风味、抗氧化、保鲜、延长保 藏期等。 2：生物工程方面：酶保护剂、医药药品的保存等。 3：农业领域：抗旱、抗寒植物、 4：其他方面：化妆品（保湿）等
.
其他结构
质粒 2 um质粒是一个环状、周长2 um的6kb双链DNA分子。可用于研究基因 调控、染色体复制的理想系统，也可作为酵母菌转化的有效载体，并组 建基因工程菌。
生理功能： 起物质传递的作用，另外还有合成脂类和
脂蛋白，与出芽起始有关。
.
核糖体
位于游离的细胞质中或附着在内质网上。 化学组成：与细菌类似 结构：核糖体的沉降系数为80s，它由60s和40s的两个亚基组成
。功能是按照mRNA的指令将氨基酸合成蛋白质多肽链。
.
高尔基体 (高尔基复合体)
细菌与酵母表面展示技术ppt课件
• 迄今，已有多个运用α-凝集素的C端作为交融蛋白的报道。 第一个经过此系统表达的异源蛋白是α-半乳糖苷酶。
•
Schreuder等未来自瓜儿豆
胶的α-半乳糖苷酶的基因插入
到酿酒酵母转化酶分泌信号和
α-凝集素C端部分编码序列之间
。α-半乳糖苷酶和α-半乳糖苷酶
-α-凝集素〔α-Gal-ACI〕交融蛋
与α-凝集素类似的衔接锚定在细胞壁上。与α-凝集
素不同，α-凝集素由两个亚单位的糖蛋白பைடு நூலகம்成。
•
酵母外表展现系统运用在酿酒酵母的α-凝集
素将外源蛋白质展现与细胞外表。α-凝集素由中心亚
单位(Agalp)和结合亚单位(Aga2p)两个亚单位组成，
Agalp
•
共725个氨基酸，合成后被分泌到细胞外，与酵母
谢谢欣赏
1.目的蛋白-α-凝集素外表展现系统
• 此系统将目的蛋白作为N端，与α-凝集素C端部分交融， 目的蛋白经α-凝集素展现酵母细胞外表。α-凝集素共价衔 接到细胞壁的葡聚糖上，其锚定部位由蛋白质C端320个氨 基酸组成，富含Ser/Thr残基。Ser/Thr富集区因广泛存在的 O-糖基化而拥有的一个杆状构象，可作为空间支持无发扬 作用。
• 酵母是个足够大的颗粒，可用流式细胞仪进展挑 选和分别，这就使得基于特异定量亲和力改动的 的突变体分别成为能够。由于酵母展现的蛋白质 是严密锚定在细胞壁上，可以耐受SDS等的抽取， 同时酵母有发酵特性且生长快，因此在工业上具 有很好的运用前景。
• 前景：
• 外表展现技术日新月异，酵母展现系统在不断的完善和改 良，在多个领域得到广泛运用。由于其是真核细胞展现系统， 对于哺乳动物蛋白质，尤其是人的蛋白质的展现具有独特的 优越性，置信随着此技术的不断完善，在蛋白质分子的研讨 方面发扬越来越重要的作用。
•
Schreuder等未来自瓜儿豆
胶的α-半乳糖苷酶的基因插入
到酿酒酵母转化酶分泌信号和
α-凝集素C端部分编码序列之间
。α-半乳糖苷酶和α-半乳糖苷酶
-α-凝集素〔α-Gal-ACI〕交融蛋
与α-凝集素类似的衔接锚定在细胞壁上。与α-凝集
素不同，α-凝集素由两个亚单位的糖蛋白பைடு நூலகம்成。
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酵母外表展现系统运用在酿酒酵母的α-凝集
素将外源蛋白质展现与细胞外表。α-凝集素由中心亚
单位(Agalp)和结合亚单位(Aga2p)两个亚单位组成，
Agalp
•
共725个氨基酸，合成后被分泌到细胞外，与酵母
谢谢欣赏
1.目的蛋白-α-凝集素外表展现系统
• 此系统将目的蛋白作为N端，与α-凝集素C端部分交融， 目的蛋白经α-凝集素展现酵母细胞外表。α-凝集素共价衔 接到细胞壁的葡聚糖上，其锚定部位由蛋白质C端320个氨 基酸组成，富含Ser/Thr残基。Ser/Thr富集区因广泛存在的 O-糖基化而拥有的一个杆状构象，可作为空间支持无发扬 作用。
• 酵母是个足够大的颗粒，可用流式细胞仪进展挑 选和分别，这就使得基于特异定量亲和力改动的 的突变体分别成为能够。由于酵母展现的蛋白质 是严密锚定在细胞壁上，可以耐受SDS等的抽取， 同时酵母有发酵特性且生长快，因此在工业上具 有很好的运用前景。
• 前景：
• 外表展现技术日新月异，酵母展现系统在不断的完善和改 良，在多个领域得到广泛运用。由于其是真核细胞展现系统， 对于哺乳动物蛋白质，尤其是人的蛋白质的展现具有独特的 优越性，置信随着此技术的不断完善，在蛋白质分子的研讨 方面发扬越来越重要的作用。
酵母表面展示技术.pptx
第3页/共12页
• 载体蛋白
酵母细胞表面包被着一层坚硬的细胞壁，由内 层的葡聚糖骨架和外层的甘露糖蛋白构成。甘 露糖蛋白主要包括两类蛋白质：一种以非共价 方式松散地结合于细胞壁，可以用SDS 抽提； 另一类蛋白必需以 β-1,3 或β-1,6 葡聚糖酶消 化细胞壁后才能抽提，这类蛋白常含有 GPI 锚 定区域。α-凝集素和絮凝素以及细胞壁蛋白如 Cwp1p，Cwp2p，Tip1p 等都属于 GPI 家族 蛋白，外源蛋白与它们融合后可被共价锚定于 细胞表面，这些蛋白是常用的酵母表面展示载 体蛋白。
第6页与外源蛋白融合，并将融合蛋白展露表达 在细胞表面，此系统又包括两个子系统: GPI锚定系统和絮凝结构域锚定系统。 GPI锚定系统是利用絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信号锚定外源蛋白，此系 统与凝集素展示相似; 絮凝结构域锚定系统是利用Flo1p的中间絮凝功能结构 域与外源蛋白融合，通过絮凝功能结构域识别酵母细胞壁中的甘露聚糖链并以 非共价作用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物
第10页/共12页
• 酵母表面展示与酶技术 • 酶的固定化是指借助物理或者化学方法将酶固定于特殊
的相，使得酶与整体流体分开，但是仍然能够进行底物 和效应物分子交换并发挥其催化效能的一种技术。与游 离酶相比，固定化酶提高了酶的稳定性，并使酶能够反 复回收利用。但是，传统的固定化方法也会产生一些不 利因素，例如由于增加固定化操作，导致酶固定化过程 中的活性收率损失；另外由于固定化操作需用载体，因 而增加了载体成本费和固定化操作费用。利用表面展示 技术将具有催化活性的酶展示于酵母等微生物细胞表面 就形成了全细胞催化剂，与传统的细胞内酶和外分泌酶 不同，表面展示的酶以共价或非共价方式固定于细胞外 表面，这种独特的空间定位使其相对自由酶而言有许多 优良的特性，如温度、有机溶剂稳定性、可多次重复使 用等，这些特点与传统的固定化酶技术相似，但无需额 外的蛋白纯化和固定的操作，有着良好的应用前景。
• 载体蛋白
酵母细胞表面包被着一层坚硬的细胞壁，由内 层的葡聚糖骨架和外层的甘露糖蛋白构成。甘 露糖蛋白主要包括两类蛋白质：一种以非共价 方式松散地结合于细胞壁，可以用SDS 抽提； 另一类蛋白必需以 β-1,3 或β-1,6 葡聚糖酶消 化细胞壁后才能抽提，这类蛋白常含有 GPI 锚 定区域。α-凝集素和絮凝素以及细胞壁蛋白如 Cwp1p，Cwp2p，Tip1p 等都属于 GPI 家族 蛋白，外源蛋白与它们融合后可被共价锚定于 细胞表面，这些蛋白是常用的酵母表面展示载 体蛋白。
第6页与外源蛋白融合，并将融合蛋白展露表达 在细胞表面，此系统又包括两个子系统: GPI锚定系统和絮凝结构域锚定系统。 GPI锚定系统是利用絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信号锚定外源蛋白，此系 统与凝集素展示相似; 絮凝结构域锚定系统是利用Flo1p的中间絮凝功能结构 域与外源蛋白融合，通过絮凝功能结构域识别酵母细胞壁中的甘露聚糖链并以 非共价作用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物
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• 酵母表面展示与酶技术 • 酶的固定化是指借助物理或者化学方法将酶固定于特殊
的相，使得酶与整体流体分开，但是仍然能够进行底物 和效应物分子交换并发挥其催化效能的一种技术。与游 离酶相比，固定化酶提高了酶的稳定性，并使酶能够反 复回收利用。但是，传统的固定化方法也会产生一些不 利因素，例如由于增加固定化操作，导致酶固定化过程 中的活性收率损失；另外由于固定化操作需用载体，因 而增加了载体成本费和固定化操作费用。利用表面展示 技术将具有催化活性的酶展示于酵母等微生物细胞表面 就形成了全细胞催化剂，与传统的细胞内酶和外分泌酶 不同，表面展示的酶以共价或非共价方式固定于细胞外 表面，这种独特的空间定位使其相对自由酶而言有许多 优良的特性，如温度、有机溶剂稳定性、可多次重复使 用等，这些特点与传统的固定化酶技术相似，但无需额 外的蛋白纯化和固定的操作，有着良好的应用前景。
酵母菌表面展示操作步骤概述
酵母菌表面展示操作步骤概述酵母菌表面展示是一种生物学研究和应用领域常用的技术，它通过将目标蛋白质在酵母菌表面进行展示，使其易于高效地表达、分离和纯化。
本文将对酵母菌表面展示的操作步骤进行概述，以帮助读者了解和掌握该技术。
步骤一：构建目标蛋白质基因的表达载体首先，需要将目标蛋白质的基因克隆到适当的酵母菌表达载体中。
常用的载体包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和毕赤酵母（Pichia pastoris）。
在构建载体时，应确保目标蛋白质的基因序列正确无误，并与载体正确连接。
步骤二：转化酵母菌将构建好的表达载体转化到酵母菌中。
转化可以使用电穿孔法、乙醇法、锂酸法等多种方法进行。
转化后的酵母菌需要在适当的培养基上进行培养，以确保其正常生长和表达目标蛋白质。
步骤三：筛选表达蛋白质的阳性克隆经过一段时间的培养后，可以进行表达蛋白质阳性克隆的筛选。
一种常用的筛选方法是通过使用特定抗体或其他与目标蛋白质的结合能力相关的探针进行免疫检测或筛选。
步骤四：表达蛋白质的定性和定量分析对阳性克隆进行表达蛋白质的定性和定量分析，以确定其表达水平和活性。
常用的方法包括Western blot、ELISA、流式细胞术等。
步骤五：优化表达条件根据定性和定量分析的结果，可以进行表达条件的优化。
优化表达条件包括培养基成分的调整、温度、pH值、诱导剂的浓度和诱导时间等因素的优化，以提高目标蛋白的表达效率和活性。
步骤六：表达蛋白质的分离和纯化经过优化的表达条件后，可以进行目标蛋白质的分离和纯化。
常用的方法包括亲和层析、离子交换层析、为基础的层析等。
根据目标蛋白质的特性和需求，选择合适的纯化方法进行分离和纯化。
步骤七：确认目标蛋白质的展示效果经过分离和纯化后，需要确认目标蛋白质在酵母菌表面的展示效果。
常用的方法包括免疫荧光染色、流式细胞术等。
通过这些方法可以确定目标蛋白质是否成功地在酵母菌表面进行了展示。
总结：酵母菌表面展示是一种常用的生物学研究和应用技术，通过将目标蛋白质在酵母菌表面进行展示，以方便其高效表达、分离和纯化。
酿酒酵母表达系统
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酿酒酵母表面展示表达系统及应用
报告人：刘顺
2010.11.10 1
主要内容1概念2两种系统3 应用
4
优缺点
2
一、概念
酿酒酵母表面展示表达系统： 一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统，
即把异源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列融 合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母细胞内蛋白转运 到膜表面的机制（糖基磷脂酰肌醇，GPI锚定）， 使靶蛋白表达并定位于酵母细胞表面，之后用葡聚 糖酶抽提细胞壁目的蛋白。
13
14
3
二、两种系统
•
酿酒酵母细胞壁主要由外层的甘露糖蛋白和内层的葡
聚糖骨架组成，两者通过共价健相连。外层甘露糖蛋白有
两种类型：
• 一种是通过非共价健与酵母细胞壁松散相连并能被ＳＤＳ 提取出来的低分子量蛋白；
• 一种是必须被葡聚糖酶酶解细胞壁的β-１，3-和β-１，６葡聚糖层后才能被ＳＤＳ抽提的高分子量蛋白，包括凝集 素、絮凝素、Sed1p、Cwp1p、 Cwp 2p和Tip1p、Tir1p 、Srp1p等。后者的结构中大多都含有GPI锚定区域
5
凝集素展示表达系统
6
凝集素展示表达系统
7
凝集素展示表达系统
8
絮凝素展示表达系统
絮凝素Flo1p 是一种新兴的展示系统,它是酿酒酵母细 胞表面类似凝集素的细胞壁蛋白。 • 目前，已经形成了两种类型的絮凝素展示系统 ： • 一是GPI 系统 ；根据目的蛋白的特性和实验目的确定截去 Flo1p 肽段的长度,然后,目的蛋白的C 端融合到锚定序列 上。 • 二是利用Flo1p 的絮凝结构域的黏附能力创建一个表面展 示系统。
• 其中分别由AGα1、AGa1／AGa2和Flo1表达异源蛋白的 凝集素和絮凝素酵母细胞展示表达系统应用较多。
4
凝集素展示表达系统
α凝集素和ａ凝集素是酵母细胞壁上的两种甘露糖 蛋白，它们在酿酒酵母的交配型α（ＭＡＴα ）和 交配型ａ（ＭＡＴａ）单倍体细胞之间介导细胞 与细胞的性粘附，使细胞融合形成双倍体 。
12
问题和展望
优点 1、可克隆较大外源蛋白 2、对表达的外源蛋白质进行有效的折叠、糖基化和形成二硫键,并与葡
聚糖共价结合，耐SDS 抽提 3、酵母生产快,容易培养，展示蛋白能稳定地在子代细胞中表达 4、表达的蛋白可用荧光激活细胞分选仪(FACS) 进行灵敏而方便地检测
和筛选 缺点： 1、天然活性不够，表达的蛋白可能不完整 2、表达量也不够,而且酒精往往会抑制生长 3、多拷贝载体不稳定，整合载体则拷贝数低，表达的蛋白量少
9
GPI 系统
10
絮凝结构域系统
11
应用
近几年来，酿酒酵母细胞表面展示表达系统迅速发 展并在多个领域获得应用，展现出广阔的发展前景。 1、作为生物催化剂展示表达各种酶蛋白：
淀粉分解酶、纤维素分解酶、脂酶 2、环境治理中展示表达金属蛋白 3、蛋白质分子的相互作用及组合蛋白库的构建 4、可作为生物传感器的荧光蛋白的展示表达 5、免疫学中的应用
报告人：刘顺
2010.11.10 1
主要内容1概念2两种系统3 应用
4
优缺点
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一、概念
酿酒酵母表面展示表达系统： 一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统，
即把异源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列融 合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母细胞内蛋白转运 到膜表面的机制（糖基磷脂酰肌醇，GPI锚定）， 使靶蛋白表达并定位于酵母细胞表面，之后用葡聚 糖酶抽提细胞壁目的蛋白。
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二、两种系统
•
酿酒酵母细胞壁主要由外层的甘露糖蛋白和内层的葡
聚糖骨架组成，两者通过共价健相连。外层甘露糖蛋白有
两种类型：
• 一种是通过非共价健与酵母细胞壁松散相连并能被ＳＤＳ 提取出来的低分子量蛋白；
• 一种是必须被葡聚糖酶酶解细胞壁的β-１，3-和β-１，６葡聚糖层后才能被ＳＤＳ抽提的高分子量蛋白，包括凝集 素、絮凝素、Sed1p、Cwp1p、 Cwp 2p和Tip1p、Tir1p 、Srp1p等。后者的结构中大多都含有GPI锚定区域
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凝集素展示表达系统
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凝集素展示表达系统
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凝集素展示表达系统
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絮凝素展示表达系统
絮凝素Flo1p 是一种新兴的展示系统,它是酿酒酵母细 胞表面类似凝集素的细胞壁蛋白。 • 目前，已经形成了两种类型的絮凝素展示系统 ： • 一是GPI 系统 ；根据目的蛋白的特性和实验目的确定截去 Flo1p 肽段的长度,然后,目的蛋白的C 端融合到锚定序列 上。 • 二是利用Flo1p 的絮凝结构域的黏附能力创建一个表面展 示系统。
• 其中分别由AGα1、AGa1／AGa2和Flo1表达异源蛋白的 凝集素和絮凝素酵母细胞展示表达系统应用较多。
4
凝集素展示表达系统
α凝集素和ａ凝集素是酵母细胞壁上的两种甘露糖 蛋白，它们在酿酒酵母的交配型α（ＭＡＴα ）和 交配型ａ（ＭＡＴａ）单倍体细胞之间介导细胞 与细胞的性粘附，使细胞融合形成双倍体 。
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问题和展望
优点 1、可克隆较大外源蛋白 2、对表达的外源蛋白质进行有效的折叠、糖基化和形成二硫键,并与葡
聚糖共价结合，耐SDS 抽提 3、酵母生产快,容易培养，展示蛋白能稳定地在子代细胞中表达 4、表达的蛋白可用荧光激活细胞分选仪(FACS) 进行灵敏而方便地检测
和筛选 缺点： 1、天然活性不够，表达的蛋白可能不完整 2、表达量也不够,而且酒精往往会抑制生长 3、多拷贝载体不稳定，整合载体则拷贝数低，表达的蛋白量少
9
GPI 系统
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絮凝结构域系统
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应用
近几年来，酿酒酵母细胞表面展示表达系统迅速发 展并在多个领域获得应用，展现出广阔的发展前景。 1、作为生物催化剂展示表达各种酶蛋白：
淀粉分解酶、纤维素分解酶、脂酶 2、环境治理中展示表达金属蛋白 3、蛋白质分子的相互作用及组合蛋白库的构建 4、可作为生物传感器的荧光蛋白的展示表达 5、免疫学中的应用