奶牛绿脓杆菌的分离与鉴定

奶牛绿脓杆菌的分离与鉴定
摘要：应用细菌学培养分离技术，从产后死于出血性、败血性坏死肺炎及子宫炎的奶牛肺、子宫子叶组织中分离出一株病原菌；通过细菌形态、染色特性及培养特性观察结合生化实验确定该病原分离株为绿脓杆菌，并通过药敏实验筛选出了环丙沙星、羧苄青霉素等对该菌敏感的药物。

关键词：奶牛;绿脓杆菌;分离鉴定
前言
绿脓杆菌病又称出血性肺炎，是一种人畜共患的传染病，是一种条件性病原菌，对人、畜均有一定程度的危害，因常对肉、蛋、奶的污染引起公共卫生的关注[1，2]。

本病在人主要表现为烧伤，外科的术后感染，但也见于癌症病人或年老体弱者的重症感染。

在动物常见于内脏器官脓肿，如乳牛子宫炎，乳房炎，水貂出血性，特别是幼龄畜禽，常表现为群体的急性暴发而导致大批死亡。

2009年3月14日，阜康某牛场一头奶牛因阴门流出红褐色血液等全身症状经抢救无效而死。

本实验室对病料进行了实验室诊断，通过病原分离培养及形态特征、生化特性鉴定观察结合流行病学、临床症状，诊断为铜绿假单胞菌病既绿脓杆菌病。

1 发病情况及临床症状
2009年3月13日，昌吉某奶牛场一头奶牛于清晨4时开始阴门流出大量血液，但牛无临产症状，兽医对牛进行了引产，该牛产下一母犊为死胎，产后该牛饮食欲废绝，至3月14日胎衣未下，且阴门流出红褐色血液。

14日晚12时该牛出现严重的呼吸困难，且有疼痛表现，兽医对牛进行了强心补液及抗生素治疗，在输液过程中牛因心衰竭呼吸困难而死亡。

2 剖检变化
肺、子宫子叶严重感染，出血性坏死，颜色发黑，切开肺流出黑褐色的液体，小肠黏膜充血、出血严重。

其他器官基本正常。

3 病料采集
无菌采取病死牛的病理变化明显的肺、子宫子叶等器官进行分离鉴定。

4 病原菌分类与鉴定
4.1病原菌的分离培养[3-5]
4.1.1 组织涂片
取病牛的肺及子宫子叶组织分别涂片，革兰氏、瑞特氏、碱性美蓝染色，镜检。

在肺组织革兰氏染色涂片中可见大量两端钝圆，无芽孢及荚膜、单在或
成对革兰氏阴性中等大小杆菌，美兰染色可见着色不均的颗粒或两端浓染中等杆菌。

子宫子叶组织革兰氏染色可见大量革兰氏阴性大、中等杆菌，革兰氏阳性球菌及大杆菌。

4.1.2细菌培养
将采集的肺、子宫子叶组织分别接种于普通肉汤、厌气肝汤，37℃培养24h，观察生长情况。

结果肺组织的肉汤培养物浑浊、在表面形成初期为绿色后期变成淡褐色的薄膜，培养物发绿，染色镜检培养物可见革兰氏阴性中等杆菌。

在对子宫子叶厌气肝汤培养物的染色镜检中可见大量革兰氏阴性大、中等杆菌，革兰氏阳性球菌及大杆菌。

4.1.3纯培养及分离培养
取肺组织肉汤培养物在普通培养基上划线进行纯培养。

取子叶培养物在鲜血琼脂上用焦性没食子酸法进行厌氧纯培养和在普通琼脂上划线进行需氧菌的纯培养。

染色镜检，可见四株菌，即革兰氏阴性大,中等杆菌，革兰氏阳性球菌及大杆菌。

无菌取上述四株菌的单个菌落分别接种于普通琼脂，鲜血琼脂，SS 琼脂，普通肉汤，厌气肝汤，37ºC培养24h，肺组织的培养物在普通琼脂上长出，较大、光滑、扁平、湿润、边缘整齐的菌落，培养物发绿色，肉汤培养物浑浊呈黄绿色。

子叶培养物在SS培养基上长出粉红色、较大、隆起边缘整齐的菌落。

在普通培养基上长出针尖大小的灰白色菌落，在鲜血培养基上进行的厌氧培养长出不容血且边缘不整齐的较大菌落。

4.2动物实验
取上述四株菌的纯培养物经腹腔注射给每只小白鼠0.2ml，每株两只（16g 左右由新疆医科大学动物室提供）。

注射革兰氏阴性中等杆菌的小白鼠在18h 内死亡，其余三种菌未造成实验动物死亡。

剖检死亡小白鼠可见肺充血，出血性坏死，淋巴结出血，水肿，肝、脾肿大有出血点，肠黏膜充血，出血严重，无菌取小白鼠的肺、肝、脾组织涂片，染色镜检，可见于注射菌株相同的细菌。

4.3 生化鉴定
取上述致死小白鼠菌株的普通琼脂培养物进行氧化酶实验，结果为阴性。

取培养物接种ATB EXPRESSION细菌自动鉴定及药敏测试仪ID 32E试条上37℃培养24h，上机鉴定，其结果如下。

ATB 鉴定系统编号：05-03-24-06
ID 32 E V2.0
ODC（鸟氨酸脱羧酶） + ADH（精氨酸双水解酶） + LDC（赖氨酸脱羧酶）–
URE（脲酶） + LARL（L-阿拉泊糖醇）- GAT （半乳糖酸盐）+
5KG（5-铜基-葡萄糖酸钠）– LIP（脂肪酶） + RP（酚红）–
BGLU（ß-葡萄糖甙酶）– MAN （甘露醇）– MAL（麦芽糖）-
IND （吲哚产生）–ßNAG N-乙酰-ß葡萄糖甙酶）–ßGAL（ß-半乳糖甙酶）–GUL （葡萄糖）– SAC （蔗糖）– LARA（L-阿拉伯糖） + DARL（D-阿拉伯糖醇）– aGLU（a-葡萄糖）- aGAL(a-半乳糖甙酶)–
TRE（海藻糖） - RHA （鼠李糖）– INO （肌醇）–
ADO（侧金盏花醇）– PLE –ßGUR（ß-葡萄糖酸酶）–
CEL（纤维二糖）– SOR （山梨醇）– aMAL（a-麦芽糖甙酶）–MNT（酸丙二） + AspA （L-天门冬素芳胺酶）–
================================================================== 非常好鉴定结果
铜绿假单胞菌……………………………………………%id=99.9
次选择
荧光假单假胞菌…………………………………………%id=0.1
4.4 药敏实验
取上述革兰氏阴性致病菌的纯培养物作药敏实验（药敏纸片由北京天坛药物生物技术开发公司提供，批好：200404）。

结果是羟苄青霉素、环丙沙星、诺氟沙星效果明显，氧氟沙星、庆大霉素效果不明显，头孢拉定、氨苄西林、青霉素等没有效果。

5 防制
5.1加强饲养管理，立即停止饲喂发霉麸皮，避免因不断摄入发霉饲料产生的有毒物质引起中毒，为绿脓杆菌的感染提供机会。

5.2牛舍内应用福尔马林彻底消毒，搞好环境卫生。

5.3据报道：绿脓杆菌对庆大霉素、多粘霉素、羧苄青霉素和磺胺嘧啶、新霉素、链霉素、卡那霉素敏感[6]，用于治疗本病。

本实验室的药敏结果显示，该菌对环丙沙星最敏感，其次为羧苄青霉素、诺氟沙星。

氧氟沙星，庆大霉素效果不明显。

对头孢拉定、氨苄西林、青霉素等药物不敏感。

6 讨论
6.1 经观察临床症状，病理剖检变化，实验室细菌鉴定，确诊为绿脓杆菌病。

前期临床兽医未能确诊病因，用青霉素等本菌有耐药性的药物治疗，使病情进一步扩散的直接原因。

6.2 绿脓杆菌，广泛存在于水、土壤、空气、动物的肠道和皮肤，为一种条件性致病菌。

若家畜体内外有创伤，该菌会在入侵之处定居下来，并迅速分裂繁殖，再多数情况下形成居灶性脓肿，故该菌是一些疾病如脑膜炎，奶牛乳房炎、子宫炎、霉形体病、鸡痘的继发菌。

有报道，该菌与葡萄球菌，大肠杆菌混和感染。

该牛可能患有子宫炎，后来进行引产，助产使子宫感染进一步加重，且有球菌与大肠杆菌混合感染，是诱发绿脓杆菌迅速繁殖扩散，使肺部及子宫重度感染造成出血性败血性坏死，而使奶牛死亡。

6.3 因幼畜免疫系统尚不健全，病原菌即可沿着淋巴系统进入机体内，并在组织中扩散蔓延，最后进入血液中引起菌血症[6]。

在集约化饲养不断扩大的当今世代，绿脓杆菌原发病的发病率显著上升，往往会造成幼小家畜的大群暴发。

所以应注意家畜因创伤感染及乳房炎、子宫炎等疾病引起环境污染、注射污染。

作好隔离、消毒、治疗，环境卫生，加强饲养管理是防制该病的关键。

谢辞
本论文是在自治区动物防疫监督总站的肖开提老师和动物医学学院的米克热木老师的亲切关怀和耐心指导下完成的。

各位老师在我大学的生活和学习期间倾注了大量心血，使我从中获益并顺利完成论文，老师们的严肃认真的态度使我受用终生，广博的学识，严谨的学术作风，务实的工作作风也使我毕生难忘，在此表示崇高的敬意和诚恳的感谢。

此外，要特别感谢同学们对我的关心，鼓励和帮助。

真诚地感谢五年的学习，生活中给予我关心和帮助而未提及的所有老师，同学和朋友！
最后，特别要感谢最敬爱的父母和家人，是他们在我身后默默的支持和关爱着我，使我能够有信心和力量去面对学习和生活中的困难，谨以此文献给他们，表达我对他们深深的感谢。

参考文献
[1] 蔡宝祥. 家畜传染病学.北京：中国农业出版社，2001.
[2] 费恩阁. 动物传染病学.吉林：吉林科学技术出版社，1995.
[3] 扬本升，刘玉斌.动物微生物学. 吉林：吉林科学技术出版社，1995.
[4] 汪诚天，叶祝年.兽医实验检验手册.上海：上海科学技术出版社，1984.
[5] 王世若. 兽微生物学及免疫学.吉林：吉林科学技术出版社，1990.
[6] 张道永，胡景韶.绿脓杆菌研究进展.四川畜牧兽医.1995，(3),55-58.。