TDGF-1基因下调对人鼻咽癌细胞生长迁移侵袭的影响

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重组腺病毒介导的人AWP1基因转移对人源肝癌细胞增殖的影响

步研究Ａ１因功能提供依据。方法ＷＰ基
ＰＲ鉴定。用空病毒Ａ — ｕｌＣｄＮｌ和重组腺病毒Ａ —ａ— ＷＰ分别感染人源肝癌细胞ＳｄｆｇＡ１ｌＭＭＣ７２，－７１并于感染后２、２ｈ第５天和第７４ｈ７、
天收集细胞计数，绘制细胞生长曲线，计算细胞倍增时间。结果
重组腺病毒Ａ —ａ —ＷＰ能够感染ＳｄｆｇＡ１ｌＭＭＣ７２－７１细胞；依据细胞
生长曲线计算的ＳＭＭＣ７２细胞倍增时间分别为：ＭＭＣ７２一１７Ｓ一７１细胞约为５ｄ而Ａ —ｕｌ染后其生长被抑制，；ｄＮｌ感倍增时问约为６ｄ；Ａ —ａ—ＷＰ感染后，ｄｆｇＡ１ｌ其倍增时间约为３ｄ。结论重组ｆｇＡ１ｌ —ＷＰ腺病毒转染ＳＣ７２ａＭＭ－７１细胞过表达的Ａｌ蛋白可能具有促ｗＰ
ｎｖｒｓｏｈｅｐｒｌｅａｉｎｏｅｔｃｒｉｏｅｌＯａｏｆｒｈｒｉｖｓｉａｅｔｉｌｇｃｆｃｉｎｏｏｉｕｎｔｏｉｒｔｏｆｈｐａｏａｃｎｍａｃｌｓＳｓｔｕｔｅｎｅｔｇｔｈｅｂｏｏｉｕｎｔｏｆＡＷＰ１．ＭｅｈｏＲｅｏｆｔｄｓｃｍｂｉａｔａｅｎｎｄ —
［摘
一
要］目的
以重组腺病毒作为Ａ１ａｓｃｔｄｗｔＰＫ）ＷＰ（ｓｏｉｅｉＲ１的转基因载体，ａｈ研究ＡｌｗＰ对人肝癌细胞增殖的影响，为进重组腺病毒质粒ｐｄｆｇＡ１染２３细胞进行重组腺病毒的包装和扩增，Ａ —ａ— ｗＰ转ｌ９并进行

RNA干扰IGF-1受体和EGF受体表达对鼻咽癌裸鼠移植瘤细胞周期的影响

ＡＳＲＢＴＡＣＴ：ｊｃｖｏｔｄｅｃｌｌｒｒｌｅａｏｔｕｆｕａａｏｈｒｇａａｃｏａｘｎＯｂｅｆｅＴｕｙｔｅｕａｏｉｒｔｎｓｔｓｍｎｎｓｐａｙｅｌｒｉｍｅ — ｉｓｈｌｐｆｉａｏｈｎｃｎ
摘要：目的探讨ＲＡ干扰ＩＦ１受体和ＥＦ受体表达对鼻咽癌裸鼠移植瘤的增殖状态和鼻咽癌ＣＥＮＧ．ＧＮ２细胞的细胞周期趋势的影响及其作用机制。方法应用免疫组织化学ＳＰ方法和形态计量技术对鼻咽癌裸鼠－移植瘤（实验组和对照组）组织切片进行ＰＮＣＡ染色、ＨＥ染色以及流式细胞仪检测鼻咽癌ＣＥＮ２细胞（实验组
和对照组）在细胞各期的细胞比例和增殖指数。结果实验组鼻咽癌皮下移植瘤ＰＮＣＡ标记指数为２．９±１．７１０
２，分裂像计数为１．Ｏ４．７质粒对照组和正常对照组鼻咽癌皮下移植瘤ＰＮ０核８８７４；－ＣＡ标记指数别为３．７４６４－
鼻咽裸鼠移植瘤细胞周期的影响，Ｉ田ＨＩ ■ ｌ＾０癌
卢硕孟小萍周绪红。袁玉林，，，，涛李俊叶林峰彭，，
（．武汉大学基础医学院人体解剖学教研室，１湖北武汉大学基础医学院法医学教研室；．汉大学中南医院耳鼻咽喉科）．３武
指数为３．０６，两对照组鼻咽癌ＣＥ６２４．５而－Ｎ２细胞分别为５．９４００２０．８和５．５４．８结论ＥＦ和ＩＦ－５３００。－ＧＲＧ一

TMSG-1基因沉默对人乳腺癌MCF-7细胞体外侵袭能力的影响

TMSG-1基因沉默对人乳腺癌MCF-7细胞体外侵袭能力的影响程庆;陈苏芳;王歧本;赵文健;资源【期刊名称】《湘南学院学报（医学版）》【年(卷),期】2016(018)003【摘要】目的研究靶向沉默肿瘤转移抑制基因1(tumor metastasis suppressor gene-1,TMSG-1,亦称LASS2基因)对人乳腺癌MCF-7细胞体外侵袭能力的影响,初步探讨其作用机制.方法构建TMSG-1的特异性干扰片段,通过脂质体转染技术,将靶向TMSG-1的siRNA转染MCF-7细胞,运用实时荧光定量PCR检测转染后TMSG-1 mRNA的表达,筛选有效的siRNA片段;选用最佳沉默片段siRNA-2和阴性对照siRNA-NC转染MCF-7细胞并设置空白对照组.采用Western印迹法和明胶酶谱法分析MCF-7细胞上清液中基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)的表达及生物活性;采用V-ATP酶活性检测试剂盒来测定细胞内V-ATP 酶的活性;应用划痕修复实验检测MCF-7细胞体外迁移能力;Transwell体外侵袭实验检测细胞侵袭能力.结果实时荧光定量PCR检测结果发现,不同转染序列对TMSG-1基因的沉默效果不同,siRNA-2组和siRNA-3组中TMSG-1基因mRNA 的量与对照组、siRNA-NC组和siRNA-1组比较,表达明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05),本实验选用siRNA-2组用于后续试验;Western印迹法检测结果显示,空白对照组、siRNA-NC组与siRNA-2组3组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05);明胶酶谱法检测结果显示:siRNA-2转染组细胞培养上清液中MMP-2的活性是空白对照组的1.76倍,差异有统计学意义(P＜0.05),是siRNA-NC组的1.81倍,差异有统计学意义(P＜0.05);细胞内V-ATP酶的活性检测结果显示:转染siRNA-2组V-ATP酶活性明显高于空白对照组和siRNA-NC组(P＜0.05);划痕修复实验结果显示:siRNA-2转染组的迁移能力明显高于空白对照组和无关阴性对照siRNA组(P ＜0.05);Transwell侵袭小室实验检测结果显示,转染siRNA-2组细胞数目明显多于siRNA-NC组和空白对照组(P＜0.05).结论靶向沉默TMSG-1的siRNA能有效下调其表达,提高MCF-7细胞的体外侵袭能力.【总页数】6页(P1-6)【作者】程庆;陈苏芳;王歧本;赵文健;资源【作者单位】湘南学院医学技能实验中心,湖南郴州423000;湘南学院医学技能实验中心,湖南郴州423000;湘南学院医学技能实验中心,湖南郴州423000;湘南学院病理研究所,湖南郴州423000;湘南学院病理研究所,湖南郴州423000【正文语种】中文【中图分类】R737.9【相关文献】1.印甲薪对人乳腺癌细胞株MCF-7体外侵袭能力的作用研究 [J], 李毅;吴胤瑛;李恩孝;董丹凤2.RNAi沉默Rab5a基因对乳腺癌细胞MCF-7侵袭能力的的影响 [J], 查尼尔;李志高;谷新悦3.短发夹RNA沉默促肝细胞再生磷酸酶-3基因表达对乳腺癌MCF-7细胞生长和侵袭能力的影响 [J], 钟琰;吴爱国;纪术峰;沈三弟4.RNAi 介导 ObR基因沉默对人乳头状甲状腺癌 K1细胞增殖与侵袭能力的影响[J], 王帅;孔霞;张国安;侯森;崔文5.慢病毒介导CK18基因沉默对人乳腺癌BT549细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响 [J], 张青;黄钱;张春燕;刘晓燕;曾凡才;甘淋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

TRIM59靶向调控PPMIB对鼻咽癌侵袭和迁移的作用

鼻咽癌（NPC）是一种上皮细胞的恶性肿瘤［1］，中国是世界鼻咽癌发病率和死亡率水平较高的国家之一，我国鼻咽癌的死亡率占全国恶性肿瘤死亡率的 2.81%，发
收稿日期：2021-02-21 基金项目：安徽省高等学校自然科学研究项目（KJ2019A0400， KJ2020A0568）作者简介/通信作者：王文忠，主任医师，硕士生导师，E-mail: 13955259093@
1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 细胞人正常鼻黏膜上皮细胞系（HNEpC）和人鼻咽癌细胞 6-10B、CNE-2、HNE1 均购自上海细胞库。 1.1.2 药品与试剂 TRIM59 抑制物（si-TRIM59）、 TRIM59 模拟物（mimic-TRIM59）、PPM1B 模拟物（mimic-PPM1B）以及 Lipofectamin2000（上海吉玛基因）；RNA 提取试剂盒，逆转录试剂盒，荧光定量PCR试剂盒，引物 (赛默飞）；双荧光素酶报告基因系统及报告载体（Promega）；Mateigel 基质（上海前尘生物科技）； TRIM59，PPM1B，β-actin 及兔/鼠二抗（上海艾博抗）。 1.2 方法 1.2.1 标本来源蚌埠医学院第一附属医院收集癌旁组织及鼻咽癌组织 10 例，所有患者术前均未接受过靶向、放化疗或内分泌等辅助治疗，所有患者均签署知情同意书，实验方案由蚌埠医学院第一附属医院伦理委员会审核批准。 1.2.2 细胞培养人正常鼻黏膜上皮细胞系（HNEpC）和人鼻咽癌细胞6-10B、CNE-2、HNE1培养在含100 U/mL 青霉素、100 mg/L 链霉素、10 %胎牛血清的 DMEM 培养基中，37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞恒温培养箱中进行细胞培养。 1.2.3 细胞转染分组取 HNE1 细胞株接种于六孔板，待细胞融合度为整个六孔板的 60%严格按照说明书对 HNE1 细胞中 TRIM59 进行下调，实验按照如下分组： Control 组（Lip2000 处理 HNE1 细胞）、NC 组（Lip2000+ inhibitor NC 序列转染 HNE1 细胞）、si-TRIM59 组（Lip2000 + inhibitor TRIM59 转染 HNE1 细胞）；对

下调NDRG1表达对胰腺癌细胞增殖、转移及侵袭的影响

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮＤＲＧ１ｉｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓａｎｄｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓａｔ７２．９６。１２０ｈｏｆＢＸＰＣ一３ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｉｎｈｉｂｉｔｅｄａｆｔｅｒＮＤＲＧ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｄｏｗｎｒｅｕｌｇａｔｅｄ（Ｐ＜０．Ｏ５）．Ｔｒａｎｓｗｅｌｌａｓｓａｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｍｉｇｒａｔｉｏｎ（Ｐ＜０．０５）ａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎ（Ｐ＜０．０５）ｗｅｒｅｉｎｈｉｂｉｔｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：
现代肿瘤医学
２０１５年Ｏ８月第２３卷第ｌ５期
ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ａｕｇ．２０１５，ＶＯＬ．２３，ＮＯ．１５
・２０８７・
囹论
著囹
．．．基础研究 ◆ ◆ ．
下调ＮＤＲＧ１表达对胰腺癌细胞增殖、转移及侵袭的影响

EVI1基因对鼻咽癌细胞增殖及侵袭能力的影响

【关键词】鼻咽癌；ＥＶＩｌ；肿瘤侵袭；肿瘤生长
鼻咽癌（ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＮＰＣ）是起海中科院。取处于对数生长期细胞，每个１０ｃｍ的
源于鼻咽黏膜的一种恶性肿瘤。我国南方地区的培养皿接种１Ｘ１０个细胞。细胞使用ＰＲＭＩ一１６４０
ＮＰＣ发病率一直居高不下。由于ＮＰＣ侵袭性较强，患者在确诊时６０％以上已经发展为中晚期并伴有颈部淋巴结转移，１０％患者伴有远处器官转移 ¨Ｊ。ＥＢ病毒感染、化学致癌物及基因的遗传和表观遗传学变化等多个因素综合作用导致了ＮＰＣ的发生２－４１。ＮＰＣ发病隐蔽，早期缺乏特异性的临床表现。大部分患者确诊ＮＰＣ时，多为疾病的中晚期状态Ｊ。因此，发掘可早期诊断ＮＰＣ的分子标记物，并发现ＮＰＣ新的治疗靶标，为临床亟待解决的问题。ＥＶＩｌ基因在很多种肿瘤里面高表达，为一个促癌基因。越来越多的研究发现，ＥＶＩｌ可以促进一系列肿瘤的发生、进展以及远处转移Ｊ。但是，关于ＥＶＩｌ在ＮＰＣ中的表达情况，以及相关分子机制，尚未见相关报道。本研究拟探讨ＥＶＩｌ在ＮＰＣ中的作用以及分子机制，并探讨其成为ＮＰＣ的治疗新靶点的可能，为鼻咽癌的基因治疗打下初步的理论基础。
１．１细胞培养以及传代ＮＰＣ细胞ＣＮＥ２购自上Ｌ下游弓Ｉ物，０．５ＬｄＮＴＰ，２Ｌｌ０Ｘｂｕｆｆｅｒ，１Ｌ模板，１５ｄｄＨ２０ｐ￣Ｌ。反应条件如下：（１）９５℃ ５ｍｉｎ；

SiRNA干扰EIF4G1表达对鼻咽癌生长侵袭影响

ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．．Ｉｔｓｌｕｎｇ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ
ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｈａｓｂｅｅｎｒｅｐｏｒｔｅｄｉｎｌａｒｙｎｘ
结论
１、免疫组化ＳＰ法证实ＥＩＦ４Ｇ１的表达与鼻咽癌的发生发展有关系。
２、荧光定量ＰＣＲ法检测ＥＩＦ４Ｇ１在永生化鼻咽上皮细胞ＮＰ６９和鼻咽癌细胞５．８Ｆ、６．１０Ｂ、Ｃ６６６．１、ＣＮＥｌ、ＣＮＥ２、ＨＮＥｌ、ＨＯＮＥｌ、ＳＵＮＥｌ中的表达有差异，５—８Ｆ表达最高。
３、利用慢病毒载体和ＲＮＡｉ技术建立了ＥＩＦ４Ｇ１表达稳定下调的５．８Ｆ细胞株，干扰后细胞体内、外生物学功能明显改变。
／ｐｓｈＲＮＡ－ＥＩＦ４Ｇ１‘细胞克隆形成减少，５－８Ｆ和阴性对照组差异无统计学意义（Ｐ－－０．７３２）。综合表明ＥＩＦ４Ｇ１表达干扰后，５．８Ｆ细胞体外生长被显著抑制。
Ⅱｌ
中文摘要３）ＴｒａｎｓｗｅＵ小室检测结果显示，与５．８Ｆ和５－８Ｆ／ｐｓｈＲＮＡ细胞相比，５－８Ｆ
／ｐｓｈＲＮＡ．ＥＩＦ４Ｇ１。细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数减少，差异具有显著性
ａ
ｍｕｌｔｉ—ｓｔｅｐ，ｍｕｌｔｉ—ｓｔａｇｅ，ｍｕｌｔｉ—ｆａｃｔｏｒｉｎｖｏｌｖｉｎｇｉｎ
ｎｕｍｂｅｒ
ｏｆｋｅｙｏｎｃｏｇｃｎｅｓａｎｄ
ｔｏｄｅｔｅｃｔ
ｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｍ．Ｉｎｔｈｅｐｒｅｖｉｏｕｓｓｔｕｄｙ，ｗｅｕｓｅｄｅＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓａｍｏｎｇＮＰＣｔｉｓｓｕｅｓ，ｐｏｏｌｅｄＮＰＣｃｅｌｌｓ（５—８Ｆ、６—１０Ｂ
与临床病理分化没有统计学意义（，＝２．５０８，Ｐ＝０．２８５）。

HMGB1对鼻咽癌细胞增殖和转移影响的相关研究

China &Foreign Medical Treatment中外医疗鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma)的发病率位居头颈恶性肿瘤之首,早期临床症状不典型,同时具有高转移、高复发和低分化的特征,因此临床上极难较早发现[1-4]。

HMGB1(high mobility group box-1protein)异常表达与口腔癌、胃癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、大肠癌、胰腺癌等多种肿瘤的发生发展和转移密切相关[5-7]。

但目前对于HMGB1与鼻咽癌的关系还缺乏了解[8-11]。

该研究方便选取2019年10月—2020年9月福州市第一医院耳鼻咽喉科诊断治疗的鼻咽炎和鼻咽癌患者临床标本各25例,探索HMGB1高表达与鼻咽癌发生的相关性,并初步验证HMGB1对体外培养的鼻咽癌细胞生长、侵袭和迁移的影响,为能否通过检测HMGB1对鼻DOI:10.16662/ki.1674-0742.2021.24.037HMGB1对鼻咽癌细胞增殖和转移影响的相关研究蔡友铮,孙丽清,卢燕,黄玉钿,郑友珍,翁雅彬福建医科大学附属福州市第一医院耳鼻咽喉科,福建福州350005[摘要]目的研究鼻咽癌患者组织中的HMGB1表达变化以及HMGB1对鼻咽癌细胞增殖和转移的影响。

方法该研究方便选取2019年10月—2020年9月福州市第一医院诊断治疗的鼻咽炎和鼻咽癌患者临床标本各25例,比较HMGB1蛋白免疫组织化学染色阳性细胞比例;同时利用慢病毒转染shRNA 敲低人鼻咽癌细胞株CNE2中的HMGB1表达水平,通过CCK-8实验检测其对细胞增殖的影响,通过划痕试验及Transwell 检测其对细胞迁移及侵袭能力的影响。

结果鼻咽癌患者组织的HMGB1阳性细胞百分比(17.79±12.71)%显著高于鼻咽炎患者(7.80±5.57)%,差异有统计学意义(t=3.597,P<0.05);敲低HMGB1的表达水平后,细胞增殖明显减慢,差异有统计学意义(P<0.05),细胞迁移能力下降,差异有统计学意义(P<0.05),细胞侵袭能力下降,差异有统计学意义(P<0.05)。

敲低Ⅰ型胶原α1链基因抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的研究

敲低Ⅰ型胶原α1链基因抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的研究马永红，同娟作者单位：宝鸡市中心医院耳鼻喉科，陕西宝鸡721000摘要：目的研究Ⅰ型胶原α1链（COL1A1）基因对鼻咽癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响。

方法该研究于2017年9月至2018年12月完成，实时定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹法（Western blotting）检测COL1A1在鼻咽癌（C666-1、CNE1、CNE2）细胞系中的表达量；CNE1细胞分m为对照组、阴性对照（si-NC组）、敲低COL1A1（si-COL1A1）组，通过Lipofectamine2000将siRNA COL1A1质粒转染至鼻咽癌CNE1细胞中，对照组细胞正常培养，si-NC组细胞转染阴性对照；qPCR和Western blotting检测转染效果，噻唑蓝（MTT）、Transwell实验分别检测细胞增殖、侵袭、迁移；Western blotting检测钙黏蛋白E（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、钙黏蛋白N（N-cadherin）水平。

结果COL1A1mRNA［（3.565±0.341）（4.253±0.410）（3.968±0.378）］和蛋白表达量［（2.214±0.216）（3.152±0.305）（2.519±0.221）］在鼻咽癌（C666-1、CNE1、CNE2）细胞系中表达量增加（P<0.05）；CNE1细胞转染siRNA COL1A1质粒能显著下调COL1A1mRNA（0.352±0.045）和蛋白表达量（0.245±0.232）（P<0.05）；敲低COL1A1的表达量抑制CNE1细胞增殖（0.536±0.059）（0.665±0.067）（0.893±0.081）（P<0.05），降低其侵袭（52.895±5.635）、迁移（113.254±13.279）能力（P<0.05），上调E-cadherin蛋白水平（2.152±0.223）（P<0.05），下调Vimentin（0.362±0.045）、N-cadherin（0.423±0.043）蛋白水平（P<0.05）。

EBV_下调miR-34c_促进鼻咽癌细胞增殖、迁移的作用及机制研究

[收稿日期]2022-04-20　[修回日期]2023-02-10[基金项目]贵州省自然科学基金项目(2019⁃G⁃054)[作者简介]张　萃(1978-),女,副主任医师.[通信作者]蒋正举,主任医师.E⁃mail:hechujun199204@[文章编号]1000⁃2200(2024)01⁃0013⁃05㊃基础医学㊃EBV 下调miR⁃34c 促进鼻咽癌细胞增殖㊁迁移的作用及机制研究张　萃1,吴应玲1,丁景菊1,王　胜1,谷　雨1,何　磊1,蒋正举2(1.贵州省六盘水市人民医院耳鼻喉科,553001;2.遵义医科大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科,贵州遵义563001)[摘要]目的:探究爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)下调miR⁃34c 促进鼻咽癌细胞增殖㊁迁移㊁侵袭的作用及机制㊂方法:采用qPCR 检测EBV 阴性鼻咽癌SUNE1㊁CNE2㊁HK1细胞和EBV 阳性C666⁃1细胞中miR⁃34c 表达水平㊂构建miR⁃34c 模拟物以分析miR⁃34c 对鼻咽癌细胞生物学功能的影响㊂使用CCK⁃8㊁划痕愈合试验以及Transwell 细胞侵袭试验检测鼻咽癌细胞的增殖㊁迁移和侵袭能力㊂Western blotting 测定细胞中迁移㊁侵袭相关蛋白以及Erk1/2信号通路蛋白的表达水平㊂结果:miR⁃34c 在EBV 阳性C666⁃1细胞表达下调(P <0.05)㊂CCK⁃8结果显示,miR⁃34c 组C666⁃1细胞在16㊁24㊁48h 的活力明显低于EBV 组(P <0.01)㊂划痕试验和Transwell 试验结果显示,与miR⁃34c 组比较,EBV 组C666⁃1细胞迁移和侵袭能力均明显增强(P <0.01)㊂Western blotting 结果显示,与miR⁃34c 组比较,EBV 组C666⁃1细胞迁移和侵袭相关蛋白Vimentin㊁Snail㊁MMP⁃2㊁MMP⁃3及Erk1㊁Erk2蛋白表达均明显升高(P <0.01)㊂结论:miR⁃34c 在EBV 阳性鼻咽癌细中表达下调,EBV 下调miR⁃34c 可增强鼻咽癌细胞增殖㊁侵袭和迁移能力及激活Erk1/2信号通路㊂[关键词]鼻咽肿瘤;爱泼斯坦-巴尔病毒;miR⁃34c;迁移;侵袭;Erk1/2信号通路[中图法分类号]R 541.6 [文献标志码]A DOI :10.13898/ki.issn.1000⁃2200.2024.01.003Role of miR⁃34c downregulated by EBV in promoting proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma cells and its mechanismZHANG Cui 1,WU Yingling 1,DING Jingju 1,WANG Sheng 1,GU Yu 1,HE Lei 1,JIANG Zhengju 2(1.Department of Otolaryngology ,Liupanshui People′s Hospital ,Liupanshui Guizhou 553001;2.Departmentof Otolaryngology ,Head and Neck Surgery ,The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University ,Zunyi Guizhou 563001,China )[Abstract ]Objective :To investigate the role of miR⁃34c downregulated by Epstein⁃Barr virus (EBV)in promoting the proliferation,migration,and invasion of nasopharyngeal carcinoma cells and its mechanism.Methods :The expression level of miR⁃34c in EBV⁃negative nasopharyngeal carcinoma SUNE1,CNE2,HK1cells,and EBV⁃positive C666⁃1cells was detected by qPCR.MiR⁃34c mimics were constructed to analyze the influence of miR⁃34c on the biological function of nasopharyngeal carcinoma K⁃8,scratch healing assay,and Transwell cell invasion assay were applied to detect the proliferation,migration,and invasion ability of nasopharyngeal carcinoma cells.Western blotting was employed to determine the expression levels of migration and invasion⁃related proteins,and Erk1/2signaling pathway proteins in cells.Results :MiR⁃34c was downregulated in EBV⁃positive C666⁃1cells (P <0.05).CCK⁃8results showed that the viability of C666⁃1cells in the miR⁃34c group was significantly lower than that in the EBV group at 16,24,and 48hours (P <0.01).The scratch assay and Transwell assay results indicated that compared with the miR⁃34c group,the migration and invasion ability of C666⁃1cells in the EBV group were significantly enhanced (P <0.01).Western blotting results showed that compared with the miR⁃34c group,the expression of migration and invasion⁃related proteins Vimentin,Snail,MMP⁃2,MMP⁃3,and Erk1and Erk2proteins of C666⁃1cells in the EBV group were significantly increased (P <0.01).Conclusions :MiR⁃34c is downregulated in EBV⁃positive nasopharyngeal carcinoma cells,and miR⁃34c downregulated by EBV can enhance the proliferation,invasion,and migration capacities of nasopharyngeal carcinoma cells and activate the Erk1/2signaling pathway.[Key words ]nasopharyngeal neoplasms;Epstein⁃Barr virus;miR⁃34c;migration;invasion;Erk1/2signaling pathway 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种源自鼻咽隐窝上皮的人类恶性肿瘤,在东南亚的发病率高,并且与遗传及爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein⁃Barr virus,EBV)感染有关[1]㊂EBV 被认为是NPC的病因,是第一个鉴定的编码miRNA的人类致癌病毒[2]㊂研究[3-5]显示EBV⁃miRNA有助于癌症存活率和肿瘤细胞迁移㊂目前,放疗是NPC的首选治疗方法,已被证明可以提高病人生存率㊂尽管NPC的5年局部控制率已达到80%~90%,但仍有15%~30%的病人发生远处转移[6]㊂因此,阐明NPC转移的机制对于改善预后和治疗结果具有重要意义㊂miR⁃34c是位于人类11号染色体上的77bp非编码RNA,属于miR⁃34家族,可通过与靶基因序列片段结合调控细胞进程[7]㊂miR⁃34c通过与Bcl2基因的3′非翻译区配对抑制Bcl2,从而下调喉癌细胞的活力并诱导其凋亡[7]㊂miR⁃34c可调节非小细胞肺癌的发展和维持内质网稳态[8]㊂研究[9]显示,低水平的miR⁃34c是NPC病人的危险因素,miR⁃34c在NPC组织中下调,其下调显示可抑制细胞凋亡㊂相关研究[2]表明,EBV感染和EBV编码的miRNA也与鼻咽癌的发展有关㊂到目前为止,EBV 下调miR⁃34c在NPC进展中的作用仍然未知㊂本研究旨在探讨EBV下调miR⁃34c对促进NPC细胞增殖和迁移的作用及机制㊂1　材料与方法1.1　细胞培养　人EBV阴性NPC细胞系(SUNE1㊁CNE2和HK1)和EBV阳性C666⁃1细胞系购自中国典型培养物保藏中心㊂所有NPC细胞均在含有10%胎牛血清RPMI⁃1640培养基中于5%CO2㊁37℃孵箱培养㊂1.2　试剂和耗材　胎牛血清(Gibco),RPMI⁃1640培养基(HyClone),Lipofectamine2000转染试剂盒㊁PrimeScript RT Master Mix试剂盒(Invitrogen),引物[生工生物工程(上海)股份有限公司],磷酸酶抑制剂混合物(Sigma Chemical),RIPA裂解缓冲液( Beyotime Biotech),GAPDH㊁Vimentin㊁Snail㊁MMP2㊁MMP3和Erk1㊁Erk12抗体(Abcam),CCK⁃8 (Solarbio)㊂1.3　细胞转染　细胞转染前,将培养基更换为不含胎牛血清的培养基,转染当天将细胞以1×105个/孔接种于6孔板中㊂miR⁃34c模拟物和NC siRNA均购自上海生工生物科技有限公司,分为miR⁃34c转染EBV阳性NPC细胞组(miR⁃34c组)和EBV阳性NPC细胞组(EBV组)㊂细胞转染严格按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行,转染8h后,将培养基更换新鲜培养基㊂1.4　实时定量荧光PCR(qPCR)　使用RNAiso Plus试剂提取细胞中的总RNA,通过PrimeScript RT Master Mix试剂盒反转录为cDNA,GAPDH作为内参,每个样本3个复孔㊂miR⁃34c引物,F:5′⁃AAG AAC CTG CTA GAC CCC TGG AG⁃3′;R:5′⁃TGC TTC CTC AGT CTT CTC ACT CAG⁃3′,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成㊂根据制造商的说明,使用ABI PRISM7000仪器对样品进行分析,采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量㊂1.5　Western blotting　使用蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液中裂解细胞㊂将细胞以1.6×104g离心15min取上清,SDS/PAGE电泳分离蛋白,转移至硝酸纤维素(NC)膜㊂将膜在室温下以5%脱脂牛奶⁃PBS溶液封闭1h㊂随后,待测蛋白与一抗4℃静置过夜,NC膜用PBS溶液洗涤3次,加入山羊抗兔IgG(HRP偶联物),室温孵育1h㊂最后,用PBS溶液洗涤NC膜,并通过电化学发光试剂显色㊂并通过ImageJ软件(Image J1.8.0,National Institute of Health)可视化目标条带,以GAPDH为内参蛋白㊂1.6　细胞活力测定　通过CCK⁃8测量细胞活力㊂NPC细胞(1×103个/孔)在96孔板中培养8㊁12㊁24和48h,加入10μL CCK⁃8溶液,继续培养4h㊂最后,通过酶标仪(SpectraMax iD5,Molecular Devices,USA)在450nm处测定吸光度(OD)㊂1.7　划痕愈合试验　将细胞接种到6孔板中,并在血清饥饿24h后使用无菌200μL枪头创建人工伤口㊂然后用无血清培养基洗涤细胞以去除碎片和漂浮细胞㊂24h 后在倒置显微镜下拍照㊂使用Image J软件打开图片后,随机划取6至8条水平线,计算细胞划痕面积均值㊂伤口愈合率=(0h划痕面积-24h划痕面积)/0h划痕面积㊂1.8　Transwell细胞侵袭试验　对转染细胞经胰蛋白酶酶解制备成细胞悬液,将2×104个细胞接种在200μL含有1%胎牛血清DMEM溶液的铺有8%基质凝胶的Transwell小室上室,下室加入500μL含有10%胎牛血清的DMEM㊂细胞培养2h后,除去上室中的液体,擦去上室壁上的细胞㊂Transwell小室另一侧的细胞固定20min,Transwell 小室用结晶紫染色15min,然后用PBS 溶液冲洗㊂在200倍显微镜下拍照㊂对随机选取的3个视野中的细胞进行计数,取平均值作为穿透膜的细胞数㊂实验重复3次㊂1.9　统计学方法　采用t 检验㊁方差分析和q 检验㊂2　结果2.1　EBV 下调miR⁃34c 在NPC 细胞中的表达　EBV 阴性NPC 细胞系(SUNE1㊁CNE2和HK1)和EBV 阳性NPC 细胞系(C666⁃1)中miR⁃34c 水平检测显示,miR⁃34c 在C666⁃1细胞中低表达(P <0.05)(见表1)㊂miR⁃34c 模拟物表达载体转染C666⁃1细胞后,采用qPCR 测定转染细胞中miR⁃34c 的水平,结果显示,miR⁃34c 明显上调(P <0.01)(见表2)㊂2.2　EBV 下调miR⁃34c 促进C666⁃1细胞增殖㊁迁移和侵袭　CCK⁃8结果显示,miR⁃34c 组C666⁃1细胞在16㊁24㊁48h 的活力均明显低于EBV 组(P <0.01)(见表3)㊂划痕试验和Transwell 试验结果显示,与miR⁃34c 组比较,EBV 组C666⁃1细胞迁移和侵袭能力均明显增强(P <0.01)(见图1㊁表3)㊂　表1　EBV 阴性NPC 细胞系和阳性NPC 细胞系中miR⁃34c 水平比较(x ±s )细胞n miR⁃34c mRNA　FPMS 组内SUNE16 1.51±0.04　CNE2HK166 1.43±0.05*1.29±0.03*#282.19<0.010.001C666⁃160.94±0.02*#▲ q 检验:与SUNE1比较*P <0.05;与CNE2比较#P <0.05;与HK1比较▲P <0.05表2　C666⁃1细胞中miR⁃34c 的水平比较(x ±s )分组n miR⁃34c mRNA miR⁃34c 组6 1.51±0.09EBV 组60.98±0.03t 13.68P<0.012.3　EBV 下调miR⁃34c 对C666⁃1细胞迁移相关蛋白水平的影响　Western blotting 结果显示,与miR⁃34c 组比较,EBV 组C666⁃1细胞迁移和侵袭相关蛋白Vimentin㊁Snail㊁MMP⁃2和MMP⁃3表达均明显升高(P <0.01)(见图2㊁表4)㊂表3　EBV 下调miR⁃34c 促进C666⁃1细胞增殖㊁迁移和侵袭能力(x ±s )分组n OD(8h)OD(16h)OD(24h)OD(48h)迁移能力/%侵袭细胞数/个miR⁃34c 组60.72±0.110.75±0.050.84±0.09 1.11±0.0714.78±0.4220.02±4.69EBV 组60.80±0.040.84±0.041.01±0.081.31±0.0824.65±0.9454.05±5.47t 1.67 3.44 3.46 4.6123.4811.82P>0.05<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01　表4　EBV 下调miR⁃34c 促进C666⁃1细胞迁移和侵袭相关蛋白的表达(x ±s )分组n MMP⁃3MMP⁃2Snail Vimentin miR⁃34c 组6 1.34±0.02 1.24±0.02 1.13±0.05 1.12±0.08EBV 组61.65±0.03 1.66±0.03 1.45±0.12 1.29±0.09t 21.0628.53 6.03 3.46P<0.01<0.01<0.01<0.012.4　EBV 下调miR⁃34c 通过激活Erk1/2通路对C666⁃1细胞迁移作用　与miR⁃34c 组比较,EBV 组C666⁃1细胞Erk1㊁Erk2蛋白表达均明显升高(P <0.01)(见图3㊁表5)㊂表5　Western blotting 检测Erk1㊁Erk2蛋白表达(x ±s )分组n Erk1Erk2miR⁃34c 组6 1.00±0.090.79±0.03EBV 组61.30±0.091.39±0.03t 5.7734.64P<0.01<0.013　讨论 NPC 是一种具有高度侵袭性和转移性的恶性肿瘤[10]㊂增殖㊁转移是恶性肿瘤的主要标志,是大多数癌症相关死亡的原因,放疗是NPC 治疗的主要手段[11],NPC 局部控制的多模式治疗取得长足进步和改善[12]㊂因此,更好地了解NPC 增殖㊁转移的分子模式对于开发NPC 新治疗策略至关重要[13]㊂在NPC 病例中,观察到miRNA 表达失调,发现特定miRNA 的异常表达与NPC 细胞的增殖㊁转移和侵袭有关[14]㊂EBV 感染已被证明与多种淋巴和上皮恶性肿瘤密切相关,尤其是NPC [15]㊂研究[9]显示,NPC 组织标本检测发现标本中miR⁃34c 下调,miR⁃34c 可能与NPC 的发展有关[9]㊂本研究结果显示,EBV 下调miR⁃34c 促进NPC 增殖㊁迁移及侵袭,miR⁃34c 可能是治疗转移性NPC 的潜在治疗靶点㊂为了确认EBV 下调miR⁃34c 对促进NPC 增殖转移的作用及机制研究,研究了其对C666⁃1细胞的细胞活力㊁迁移和侵袭的影响㊂结果显示,EBV 下调miR⁃34c 与NPC 转移的关系,表明EBV 下调miR⁃34c 通过促进NPC 细胞的转移促进了NPC 的发展㊂异常增殖在癌变中起重要作用,NPC 的主要生物学特征是局部侵袭和远处转移[16]㊂迁移通常是指体内任何定向的细胞运动,癌的侵袭意味着细胞穿透组织屏障[17]㊂癌细胞的迁移和侵袭允许从原发肿瘤部位脱离和癌症在组织内扩散[18]㊂在本研究中,发现在C666⁃1细胞中miR⁃34c 的过表达抑制了其活力㊁迁移和侵袭,也降低了细胞迁移和侵袭相关蛋白的表达水平㊂而EBV 下调miR⁃34c 促进了细胞的活力和迁移和侵袭,但也促进了细胞迁移和侵袭相关蛋白的表达水平㊂Vimentin 是肿瘤细胞迁移和侵袭过程中的一种细胞黏附分子,促进NPC 细胞迁移和侵袭[19]㊂研究[20-21]显示,Snail 的高表达表明NPC 具有高转移潜力,MMP2的抑制与NPC 细胞转移的抑制有关㊂NPC 肿瘤细胞中MMP3的分泌可刺激肿瘤细胞迁移[22]㊂本研究显示,EBV 下调miR⁃34c 促进了Vimentin㊁Snail㊁MMP2和MMP3的表达,促进细胞迁移和侵袭,表明EBV 下调miR⁃34c 对NPC 细胞迁移和侵袭的影响可能与迁移相关因子(Vimentin 和Snail)和侵袭相关因子(MMP2和MMP3)有关,EBV 下调miR⁃34c 在调节NPC 细胞的迁移和侵袭中起关键作用㊂有证据[23]表明,Erk1/2信号通路对细胞转移以及MMP 的上调至关重要㊂研究[24]显示,Erk1/2信号通路参与了EBV⁃miR⁃BART8⁃3p 诱导的NPC 转移过程,EBV⁃miR⁃BART8⁃3p 的上调通过激活Erk1/2信号通路诱导NPC转移,而EBV⁃miR⁃BART8⁃3p 的下调具有相反的效果㊂此外,也有研究[25]表明EBV⁃miR⁃BART1激活MAPK⁃ERK1/2通路,激活β⁃catenin/Snail信号,促进NPC转移㊂本研究结果显示,Erk1/2信号通路与NPC细胞的迁移密切相关, Erk1/2信号通路传导有助于EBV下调miR⁃34c诱导的NPC迁移㊂综上所述,miR⁃34c在EBV阳性NPC细胞标本中下调,EBV下调miR⁃34c可增强NPC细胞增殖㊁侵袭和迁移能力及激活Erk1/2信号通路㊂[参考文献][1]　YEW PY,MUSHIRODA T,KIYOTANI K,et al.Identification ofa 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HIF-1α介导GGT对脑胶质瘤细胞迁移和侵袭作用的研究的开题报告

HIF-1α介导GGT对脑胶质瘤细胞迁移和侵袭作用
的研究的开题报告
一、研究背景
脑胶质瘤是一种恶性肿瘤，其高侵袭性和易扩散性是其生存率低和难以有效治疗的主要原因。

而且，胶质细胞中广泛表达的γ谷氨酰转移酶（GGT）已被证明与肿瘤的侵袭性和转移性密切相关。

因此，研究GGT 对脑胶质瘤细胞转移和侵袭作用的分子机制，对于探讨胶质瘤的发生和发展机制、制定治疗方案等具有重要意义。

二、研究目的
本研究旨在探究低氧调节因子-1α（HIF-1α）是否介导GGT对脑胶质瘤细胞迁移和侵袭作用的影响，以期为脑胶质瘤的治疗提供新的治疗策略。

三、研究内容和方法
采用多种分子生物学技术，通过下调或过表达HIF-1α基因和或GGT 蛋白，检测脑胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力。

具体实验内容包括：
1.建立HIF-1α和GGT表达水平调控的细胞系
选用转染技术，将shRNA或过表达质粒转染到胶质瘤细胞中，筛选出不同水平的HIF-1α和GGT表达细胞系。

通过Western blot检测其蛋白表达情况。

2.检测HIF-1α和GGT表达水平对细胞迁移和侵袭的影响
利用Transwell实验和划痕实验检测细胞迁移和侵袭能力。

3.检测HIF-1α和GGT的相互作用
通过免疫共沉淀和Co-IP实验检测HIF-1α和GGT的相互作用，进一步鉴定其调控脑胶质瘤细胞迁移和侵袭的关系。

四、研究意义和预期结果
本研究有望探究HIF-1α和GGT在调控胶质瘤细胞迁移和侵袭中的作用，为脑胶质瘤的治疗提供新的治疗策略，预计可以为研究人员提供脑胶质瘤治疗的新思路。

转录因子TDF1对拟南芥雄性不育突变体atms1的温敏调控机制研究

转录因子TDF1对拟南芥雄性不育突变体atms1的温敏调控机制研究作者：郑亚洁等来源：《上海师范大学学报·自然科学版》2014年第03期摘要：TDF1作为MYB家族的转录因子，参与了胼胝质的降解过程，并控制绒毡层的分化从而影响着花粉粒的正常发育.以一株通过甲基磺酸乙酯（EMS）诱变Col-0野生型拟南芥获得的温敏雄性不育突变体atms1（ambient temperature-sensory male sterility1）对温度敏感机制进行了研究.通过构建TDF1反义RNA表达载体，在atms1突变体背景下抑制TDF1的表达来观察突变体花粉育性的变化，发现在27℃时的atms1突变体花粉的育性得以恢复.这一结果表明在花粉发育的过程中TDF1对ATMS1m具有一定的调控作用.关键词：atms1；温敏雄性不育； TDF1；花药育性； Real-time PCR中图分类号： Q 94 文献标识码： A 文章编号： 10005137（2014）03025907在拟南芥的花药发育过程中，已知有一些转录因子在调控中起到决定性的作用[1]：如bHLH家族的转录因子，MYB家族的转录因子等[2].其中MYB家族的转录因子如：TDF1[3-5]（TAPETAL DEVELOPMENTAND FUNCTION1）编码的是MYB-R2R3家族的转录因子.它主要在绒毡层以及小孢子母细胞中表达，突变体中因绒毡层发育异常，导致胼胝质无法降解，使得小孢子聚集在花粉囊中，不能形成正常的花粉粒，最终引起雄性不育表型.本实验室在前期的研究中得到了1株在非胁迫温度范围内花粉育性受温度显著影响的拟南芥温敏雄性不育突变体atms1[6].在16 ℃时，该突变体育性与野生型相似，花粉全部可育；但随温度的升高，育性逐渐下降，到23 ℃时，突变体花粉有一半表现为不育；而到27℃时，突变体花粉则全部不育.经过对突变基因的图位克隆，发现该突变体在AT1G62940基因上的第四外显子202 bp处发生点突变，由“G”变为“A”（图1～2），ATMS1编码的蛋白第398个氨基酸由野生型的甘氨酸变为天冬氨酸.图1 AT1G62940基因上的第四外显子上发生点突变本实验就是通过在拟南芥atms1突变体中过量表达TDF1反义RNA，结合对atms1温敏雄性不育表型的分析，拟从遗传分子水平初步探究其中的作用机制.1 材料与方法1.1 材料Col-0生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana）及atms1温敏雄性不育突变体种子由本实验室提供.图2 ATMS1 CDS序列上的突变位点菌株DH5ɑ（E.Coli）和GV3101（Agrobacterium tumefaciens）为本实验室自制感受态细胞并保存；载体pCAMBIA-1300为本实验室所有并改造后使用；载体pMD18-T、DNA Marker、各种限制性内切酶、T4连接酶均购自TaKaRa公司.1.2 方法1.2.1 植物cDNA的提取Col野生型拟南芥23 ℃条件下培养，待其抽薹后，取花序，迅速置于液氮中，Trizol法提取RNA，反转录得cDNA，Trizol等试剂及cDNA反转录试剂盒均购自TaKaRa公司.1.2.2 引物设计及TDF1基因片段的克隆自网站上下载TDF1的CDS序列，大小为954 bp.根据CDS序列设计引物，上下游引物两端分别添加Sal I和Xba I酶切位点.引物由上海生工生物工程公司进行合成.引物序列为：上游F（Sal I）5′-GCGTCGACATGGGAAGACCTCCTTGTT-3′，下游R（Xba I）5′-CGTCTAGACTAATAATCGAAATCATTCAAGAG-3′.采用PCR方法对目的序列进行扩增，扩增采用TaKaRa公司生产的KOD PCR扩增试剂盒.扩增条件参数为：由高保真聚合酶扩增得到的PCR产物割胶回收后，加PolyA并纯化，与pMD18-T载体连接，得到pMD18-T-TDF1.采用热激法将重构的T质粒转化到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中进行扩增，重组T质粒经酶切鉴定正确后送往上海美吉公司进行测序.1.2.3 表达载体构建图3为本实验室改造后的pCAMBIA-1300质粒图谱.首先，将p1300质粒用Sal I、Xba I进行酶切并回收质粒片段.然后从pMD18-T载体上切取测序正确的带有Sal I、Xba I酶切位点的TDF1 CDS片段，回收后连入p1300质粒中，并将重组质粒转化大肠杆菌进行筛选和鉴定.1.2.4 农杆菌的转化与鉴定采用热激法将重组质粒p35S：TDF1（-）转化到根癌农杆菌GV3101中.在含有Rifa，Kana和Gen三重抗性的YEP固体培养基上进行筛选，挑取单菌落进行PCR检测.将鉴定正确的菌落接种到YEP液体培养基中进行扩增培养，利用浸染法[7-9]转化拟南芥atms1杂合子植株，收取T0代种子.1.2.5 阳性苗筛选及鉴定用50 μg/mL潮霉素B（Hygromycin B）对转化的T0代种子进行筛选，待抗性板上长出阳性苗后，将其移入土中生长.直至抽薹后，取2～3片叶子，用Edwards一步抽提法提取植株基因组DNA，进行遗传背景鉴定.1.2.6 花药育性观察将阳性植株置于23 ℃的培养间生长，待其抽薹后，分两组分别放到16、27 ℃的人工气候培养箱中培养，2 d后重新置于23 ℃培养间中生长，取温度处理时处于花药发育第八期的花，用亚历山大染色法处理后，观察花粉育性.1.2.7 过量表达植株Real-time PCR检测常温培养拟南芥atms1突变体和p35S：TDF1（-）转基因植物，抽薹后平均分成两组，分别移至16和27 ℃处理24 h后，取花序，抽提RNA反转录成cDNA，以此为模板进行荧光定量PCR的检测，选用的仪器是BIORAD IQ5，管家基因UBQ10作为内参，反应体系为20μL，如下：2 结果与分析2.1 目的片段过量表达载体构建根据合成引物的退火温度，设计温度梯度测试，得到最佳退火温度为58 ℃，然后进行PCR扩增，得到970 bp左右的目的条带（图4）.目的片段连入pMD18-T质粒，经扩增、筛选和鉴定后进行测序，在NCBI网站上对测序结果进行比对分析，显示匹配率100%；将目的片段连入pCAMBIA-1300质粒，构建成p35S：TDF1（-）过量表达载体，用Xba I、Sal I酶对重组质粒进行酶切，得到约970 bp的条带及剩余载体条带（图5），以上结果说明正确的目的基因被成功连入了pCAMBIA-1300质粒，构建成了反义RNA载体.2.2 转基因植株的鉴定转基因鉴定采用扩增TDF1 CDS全长的引物，阳性苗中会扩增出2个条带，分别约为1230、970 bp，前者为TDF1的Genomic序列，后者为TDF1的CDS序列，为目的条带.atms1背景鉴定采用实验室已有SNP引物（图2），目的片段大小为523 bp，即：若使用F（M）/R、F（WT）/R引物同时PCR转基因植株的基因组DNA，只有F（M）/R扩增出目的条带，则该植株为atms1突变体纯合子；若只有F（WT）/R引物能够扩增出目的条带，则该植株为野生型；若两对引物都能扩增出条带，则该转基因植株背景为atms1杂合子.对12株阳性苗基因组进行PCR鉴定，显示其中9株为转基因植株，分别为1、2、3、4、5、6、8、9、10号（图6），然后再将这9株植物进行atms1背景的鉴定，结果显示转基因植株1、2、3、4、5、8、9、10号为atms1杂合子，6号为野生型（图7）.2.3 花药育性观察将鉴定后1、2、3号阳性苗进行传代，在T3代植株中筛选获得既是转基因纯合子又是atms1纯合子背景的植株.通过温度处理后，对花粉育性进行观察.结果显示：atms1突变体在16 ℃时花粉粒饱满呈红色，育性良好（图8A）；27℃时花药中的花粉粒呈绿色，且降解呈碎片状，表现为完全不育（图8B）；而转基因atms1植株的花药花粉在16、27 ℃时育性都得到恢复（图8C、D）.2.4 Real-time PCR温度处理后的atms1突变体和转基因植物经Real-time PCR检测结果显示（图9）：atms1突变体中TDF1的表达量16 ℃处理组远高于27 ℃处理组；而在p35S：TDF1（-）转基因atms1中，16、27 ℃组TDF1的表达量与16 ℃atms1相比明显下降，说明转基因植株中TDF1的转录水平受到明显下调，但是与atms1突变体27℃的表达量比较，总体水平还是略有增加.另外，ATMS1m表达量在atms1中呈现16 ℃处理组高于27 ℃处理组，约为27 ℃处理组的5倍，而在p35S：TDF1（-）转基因atms1中ATMS1m的表达量在16 ℃和27 ℃时都较atms1突变体27 ℃时有所增加，这说明ATMS1m的表达量的上升对于突变体atms1育性的恢复有积极的作用.3 讨论ATMS1是目前已知的第一个在非胁迫温度变化范围内直接影响拟南芥雄性不育性状的基因.在atms1突变体中，16 ℃时ATMS1m mRNA的积累量明显高于27 ℃的积累量，表明转录水平上的变化可能导致了该突变体育性随温度不同而发生变化，即：27 ℃时花药完全不育，23 ℃时呈现部分不育，16 ℃时育性与野生型相同.TDF1是MYB-R2R3家族的转录因子.它的突变体中胼胝质无法降解使得小孢子聚集在花粉囊中，表现为完全不育[10].通过在atms1突变体中导入用于降低TDF1转录水平的反义RNA 表达载体，发现在p35S：TDF1（-）转基因植株中TDF1的表达量明显下降，约为atms1突变体16 ℃时的四分之一，表明p35S：TDF1（-）这个反义RNA表达载体在拟南芥体内有效地抑制了TDF1的表达.但这种抑制作用还不足以使转基因植物表现出tdf1突变体的表型[10]；Real-time PCR的结果显示p35S：TDF1（-）反义RNA虽然抑制了TDF1的表达，但与atms1突变体在27 ℃的情况比较，TDF1的表达量还是有所提高的，反应到ATMS1m的表达水平上就更加明显，p35S：TDF1（-）转基因atms1中不论16 ℃还是27 ℃，ATMS1m的表达水平都高于atms1突变体在27 ℃的水平.这提示在拟南芥体内ATMS1m的表达量可能存在一个阈值，低于此阈值时，植株表现为完全不育，高于此阈值时，对植株育性的影响较小.而TDF1又正调控于ATMS1m的表达；当TDF1表达受抑制时，ATMS1m的表达量也会减少，但只有当ATMS1m 表达量低于一定阈值时，花粉的育性才会受到显著影响.而这个阈值可能就是ATMS1m在27 ℃的表达水平.因此，本研究认为TDF1对ATMS1m具有一定的正向调控作用，通过ATMS1m表达水平的变化最终影响花粉育性的变化，而对于其中更深入的调控机制则有待于进一步的研究.参考文献：[1] 陈丽.植物转录因子的结构与功能[J].植物生理学通讯，1997，33（6）：401-409.[2] JIN H L，CATHIE M.Multifunctionality and diversity within the Plant MYB-gene family [J].Plant Mol Biol，1999（41）：577-585.[3] ZHU J，CHEN H，YANG Z N.Defective in Tapetal development and function 1 is essential for anther development and tapetal function for microspore maturation in Arabidopsis [J].Plant J，2008，55（2）：266-277.[4] ZHANG W，SUN Y，TIMOFEJEVA L，et al.Regulation of Arabidopsis tapetum development and function by DYSFUNCTIONAL TAPETUM1 （DYT1） encoding a putative bHLH transcription factor [J].Development，2006，133（16）：3085-3095.[5] YANHUI C，XIAOYUAN Y，KUN H，et al.The MYB transcription factor superfamily of Arabidopsis： expression analysis and phylogenetic comparison with the rice MYB family [J].Plant Mol Biol，2006，60（1）：107-124.[6] 戴文懿，孙亚梅，高贝，等.拟南芥温敏雄性不育突变体atms1 的获得及表型分析[J].上海大学学报，2011，17（5）：681-686.[7] 樊荣，万小荣，张文涛，等.LE-ACS6 启动子在LE-ACS6：： GUS 转基因拟南芥中的特异性[J].植物生理与分子生物学学报，2004，30（3）：351-358.[8] 张秀春，李文彬，夏亦荠，等.AtNUDT8过量表达的拟南芥转基因植株[J].热带生物学报，2010，1（1）： 9-10.[9] 张好富，张宪银.一种不依赖于无菌培养的拟南芥活体转基因种子筛选方法[J].浙江大学学报：农业与生命科学版，2009，35（4）：372-376.[10] 陈辉.拟南芥雄性不育突变体tdf1的基因克隆和功能分析[D].上海：上海师范大学，2007.。

RNA 干扰 Cofilin-1基因沉默对人肝癌细胞株 Huh-7侵袭和转移能力的影响

RNA 干扰 Cofilin-1基因沉默对人肝癌细胞株 Huh-7侵袭和转移能力的影响曹建平;龙晓兰;龚勇;李晓杰;谢海龙【摘要】目的： Cofilin-1参与多种肿瘤的发病过程，但该基因在肝细胞肝癌中表达和作用不明确。

文中拟观察Cofilin-1基因在人肝癌组织中的表达情况，探讨下调Cofilin-1表达对肝癌细胞株Huh-7侵袭和转移能力的影响。

方法采用实时荧光定量PCR检测Cofilin-1基因在肝癌组织和癌旁组织中的表达情况；体外合成Cofilin-1序列特异性小干扰RNA，应用脂质体转染Huh-7肝癌细胞株，实验分Cofilin-1-siRNA组（ Cofilin-1-siRNA转染Huh-7细胞）、非特异性-RNA组（ Ctrl-siRNA组，非特异性siRNA转染Huh-7细胞）、未转染组（未转染Huh-7细胞），每组设2个平行孔。

Western blot 鉴定Cofilin-1蛋白水平变化。

细胞迁移及体外侵袭实验观察转染后细胞的侵袭能力的影响。

结果与癌旁组织相比，肝癌组织中Cofilin-1基因表达明显增强[（0．698±0．156） vs（3．523±0．412）， P＜0．05]；Cofilin-1-siRNA组Cofilin-1的蛋白量为0．558±0．033，明显低于Ctrl-siRNA组（0．933±0．015）和未转染组（0．961±0．020），差异有统计学意义（P＜0．05）；体外细胞迁移和侵袭实验结果均显示：与Ctrl-siRNA组迁移及侵袭细胞数量[（79．00±1．33）个]和未转染组[（74．50±1．35）个]比较，Cofilin-1-siRNA组[（58．50±1．78）个]明显降低（P＜0．05）；Cofilin-1-siRNA组穿膜Huh-7细胞数[（36．50±0．83）个]明显低于Ctrl-siRNA组[（60．20±1．60）个]与未转染组[（51．50±1．14）个]，差异有统计学意义（P＜0．05）。

T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1与胃癌细胞侵袭移行能力的关系

T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1与胃癌细胞侵袭移行能力的关系毕业论文作者：朱金明余佩武李翠芳吴淼【摘要】目的检测胃癌细胞中T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1，Tiam1)的表达及其与肿瘤侵袭、移行能力的关系，同时观察胃癌细胞在形态学方面的变化。

方法采用层黏连蛋白黏附法，由胃癌MKN45细胞株(M0)中筛选获得高(MH)、低(ML)黏附亚株。

应用流式细胞仪检测Tiam1在胃癌细胞中的表达，以Boyden小室法测定M0、ML、MH细胞的体外侵袭、移行能力，并分析其与Tiam1表达间的关系，同时采用苏木精伊红及细胞骨架蛋白染色、扫描电镜技术观察胃癌细胞形态。

结果MH细胞的体外侵袭、移行能力及Tiam1表达均强于M0、ML细胞(P5)，且Tiam1表达与胃癌细胞体外侵袭、移行能力呈正相关(r=0.997和1.000)；同时与M0、ML相比，MH胞体伸展，表面突起增多，片状伪足宽厚，丝状伪足细长而密集，异型性明显，且细胞骨架结构较紊乱，斑点状肌动蛋白小体增多。

但M0、ML细胞间差异无统计学意义(P>0.05)。

结论Tiam1表达水平升高可能促进胃癌细胞侵袭、移行。

这或许是通过调整胃癌细胞骨架结构重组，增强其变形、游走能力而实现的。

【关键词】胃癌；T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1；侵袭；移行；形态学Correlation between invasion and migration ability of gastric cancer cells and Tiam 1【Abstract】Objective To investigate the expression of T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1 (Tiam1) in gastric cancer cells and its relationship with the invasion and migration ability of gastric cancer cells, and observe the morphological changes of gastric cancer cells. Methods High adhesive subgroups (MH) and low adhesive subgroups (ML) were separated from MKN45 cell strain (M0) by laminin adhesion method in vitro. The expressions of Tiam1 in M0, ML and MH cells were detected by flow cytometry, the invasion and migration ability of M0, ML and MH cells in vitro by Boyden chamber. The correlation between invasion and migration ability of M0, ML, MH cells and expression of Tiam1 in M0, ML, MH cells was analyzed. The morphological differences among M0, ML and MH cells were observed by hematoxylin eosin stain, cytoskeletal protein stain and scanning electronic microscope. Results The invasion and migration ability and the expression of Tiam1 in MH cells were higher than those in M0 and ML cells (P5). The expression of Tiam1 was positively correlated with the invasion and migration ability of gastric cancer cells (r=0.997, 1.000). Compared with the M0 and ML cells, the MH cell bodies elongated with wide and thick lamellate pseudopodia, slender and intensive filamentous pseudopodia, more projections on the surface, derangement of cell skeleton and more dot like actin bodies. There was no significant difference between M0 and ML cells (P>0.05). Conclusions The high expression level of Tiam1 may promote the invasion and migration of gastric cancer cells through adjusting the cytoskeletal reconstruction and enhancing the deforming and migration ability of gastric cancer cells.【Key words】Gastric cancer; T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1; Invasion; Migration; Morphology肿瘤细胞的侵袭转移与其运动能力密不可分，而有效迁移行为的达成又来源于细胞内、外调节因子对细胞骨架动力装置所赋予的驱动力以及细胞骨架成分介导黏附所提供锚定力间的协调运作。

下调叉头框转录因子3a促进鼻咽癌侵袭转移

下调叉头框转录因子3a促进鼻咽癌侵袭转移罗敏;胡国清【期刊名称】《中国癌症防治杂志》【年(卷),期】2017(9)4【摘要】目的探讨下调叉头框转录因子3a(FOXO3a)对促进鼻咽癌侵袭转移的影响.方法慢病毒shRNA和空载病毒液Mock shRNA按复感染指数(multiplicity of infection,MOI)为50转染鼻咽癌CNE2和HNE1细胞,构建低表达FOXO3a的稳定转染细胞.采用Western blot、Real-time PCR检测其转染效率.划痕实验和Transwell实验检测下调FOXO3a对诱导鼻咽癌细胞侵袭转移的影响.Western blot检测上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Twist和Snail的表达,免疫荧光检测EMT 相关蛋白定位.Western blot和Real-time PCR检测基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达.结果成功构建低表达FOXO3a稳定转染鼻咽癌CNE2和HNE1细胞.划痕实验和Transwell实验结果显示,与空载体转染鼻咽癌细胞比较,低表达FOXO3a稳定转染鼻咽癌细胞的侵袭和转移能力增强,EMT相关蛋白E-cadherin 表达下调,而Vimentin、N-cadherin、Twist和Snail表达显著升高,MMP2和MMP9表达亦升高.结论下调FOXO3a可促进鼻咽癌的侵袭转移.【总页数】6页(P277-282)【作者】罗敏;胡国清【作者单位】430030武汉华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤科;430030武汉华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤科【正文语种】中文【中图分类】R739.63【相关文献】1.子宫内膜癌组织叉头框转录因子O亚型3a与基质金属蛋白酶-14表达水平及相关性 [J], 王莉;蔡旺2.下调叉头框转录因子C1对鼻咽癌5-8F细胞株生物学行为的影响 [J], 陈柏林;易世江;刘鹏;欧阳磊;雷迅3.叉头框转录因子3a和β-连环蛋白在胚胎停育绒毛组织中的表达及意义 [J], 冯静;赵莉萍4.叉头框蛋白O亚型3a和p27激酶蛋白抑制剂1在电针促进面神经再生中的作用研究 [J], 郑红弟;费静;余莉亚;李雷激5.叉头框转录因子O亚族3a对结肠癌SW620细胞的影响及机制研究 [J], 冯婷;刘霞;高立勇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

下调整合素连接激酶表达抑制鼻咽癌细胞系CNE1和5-8f的增殖

下调整合素连接激酶表达抑制鼻咽癌细胞系CNE1和5-8f的增殖梁秀妮;赵丹芸;吴平安;曾敬贤【摘要】目的探讨整合素连接激酶(ILK)在鼻咽癌细胞系CNE1和5-8f中的表达水平.用下调ILK表达水平和使用ILK特异性小分子抑制剂方法,研究ILK表达对鼻咽癌细胞增殖的影响及意义.方法用免疫组化法检测鼻咽癌组织和普通鼻咽组织中ILK的表达情况,用qRT-PCR和Western blot检测ILK在鼻咽癌细胞系CNE1和5-8f中RNA和蛋白表达水平,用MTT法检测对鼻咽癌细胞增殖的影响.结果 ILK的表达水平在NPC组织中呈阳性或弱阳性,普通鼻咽组织中呈阴性.在鼻咽癌细胞系CNE1和5-8f细胞中siILK能显著降低ILK的表达水平(P<0.05),siRNA下调ILK 表达能抑制鼻咽癌细胞增殖能力(P<0.05),ILK特异性小分子抑制剂(Cdp22)能够显著抑制鼻咽癌细胞系增殖能力(P<0.05).结论下调ILK表达可抑制鼻咽癌细胞的增殖,为鼻咽癌患者提供新的治疗靶点.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2019(039)008【总页数】5页(P1136-1140)【关键词】鼻咽癌;细胞增殖;整合素连接激酶【作者】梁秀妮;赵丹芸;吴平安;曾敬贤【作者单位】香港大学深圳医院耳鼻咽喉头颈外科,广东深圳518053;香港大学深圳医院中心实验室,广东深圳518053;香港大学深圳医院耳鼻咽喉头颈外科,广东深圳518053;香港大学深圳医院耳鼻咽喉头颈外科,广东深圳518053【正文语种】中文【中图分类】R45鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，在东南亚和中国华南地区发病率较高[1]，其发病机制与EB病毒密切相关[2]。

早期鼻咽癌对放射治疗有良好疗效，但晚期的有效率很低[3]。

75%以上伴有颈部淋巴结转移的鼻咽癌患者，预后不良[4]。

HIF-1α对人乳腺癌细胞侵袭和转移能力的影响的开题报告

HIF-1α对人乳腺癌细胞侵袭和转移能力的影响的开题报告一、研究背景与意义癌症是当今世界上威胁人类健康的重大疾病之一，尤其对女性的危害更大。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈现逐年上升的趋势。

因此，深入了解乳腺癌的发生机制和治疗策略显得非常重要。

细胞侵袭和转移是肿瘤细胞生长和转移的关键步骤，针对这些过程的干预可以有效地抑制肿瘤的发展和转移。

然而，肿瘤细胞的侵袭和转移机理尚不十分清楚，因此需要进一步研究肿瘤细胞的相关分子机制。

HIF-1α是一种重要的转录因子，参与了调节多种生物学过程，如细胞增殖、转化、侵袭和转移等。

研究发现HIF-1α在多种癌症中表达升高，并且与乳腺癌的恶性程度密切相关，提示HIF-1α可能参与了乳腺癌的侵袭和转移过程。

因此，本研究旨在探究HIF-1α对人乳腺癌细胞侵袭和转移能力的影响，为探究乳腺癌侵袭和转移的分子机制提供基础和理论依据，为乳腺癌治疗提供新的治疗策略。

二、研究内容和方法本研究将通过以下几个方面来探究HIF-1α对人乳腺癌细胞侵袭和转移能力的影响：1. 肿瘤细胞培养选用人乳腺癌MCF-7细胞作为研究对象，将其分别培养在不同浓度（0、50、100、150、200μM）的cobalt chloride（CoCl2）含量的DMEM培养液中，以模拟肿瘤组织缺氧环境。

2. HIF-1α基因沉默采用RNA干扰技术，对MCF-7细胞中的HIF-1α基因进行沉默，并通过Western blot检测HIF-1α蛋白表达水平。

3. 细胞增殖和侵袭能力的测定通过MTT法检测细胞增殖能力，并通过Transwell实验检测MCF-7细胞的侵袭能力。

4. Wnt/β-catenin通路的检测通过Western blot检测β-catenin蛋白表达水平，以了解Wnt/β-catenin通路在HIF-1α调控下的变化。

三、预期结果和意义本研究预期通过对HIF-1α对人乳腺癌细胞侵袭和转移能力的影响的研究，探究乳腺癌侵袭和转移的分子机制，为乳腺癌治疗提供新的治疗策略。

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２０・９
中国肿瘤外科杂志２１年１第３卷第５期０１０月
ＣｉＳｒ．ｔ２１Ｖｏ．Ｎｏ５
论
著
ＴＧ一基因下调对人鼻咽癌细胞生长迁移侵袭ＤＦ１的影响
ｍａｏｎｓｆａａ，ａｄｔｅａｉｔｆｍｉｒｔｎａｄｉｖｓｏｓｅａｕｔｄｂｏｎ — ｅｌｇａｓｙａｄｂｙｅｉｒｎｉｏｇｒｎｈｂｌｙｏｇａｉｎｎａｉｎｗａｖｌａｅｙｗｕｄｈａｉｓａｎｏｄｎｔｉｏｎ
文章编号：６４— １６２１）５— ２０— ４１７４３（０１００９０
ＩｐａｔｆＴＤＧＦ－ｄｏｎ－ｅａｉｎｍａｌｉｅｅｉｏｉｍｃｓｏ１ｗｒｇｕｌｔｏｂｙｓｌｎｔｒｒｎｇｎｎｖａｉｎｎｄｉｒｔｏｏｆｓｏａｍｇａｉｎｆｈｕｍａｎｎａｓｈａ— ｏｐ
【摘要】目的探讨ＴＧ一基因小干扰ＲＡ（ｍｌｉｔｆｉｇＲＡ，ＲＡ）ＤＦ１ＮｓａｌｎｒｒＮｓＮ对人鼻咽癌细胞迁移ｅｅｎｉ
侵袭的影响。方法根据ＴＧ — 基因序列特点设计了ｓＮ转染人鼻咽癌ＣＥ２细胞，ＤＦｌｉＡ，ＲＮ一分别采用实时定量ＰＲ和蛋白质印迹法检测ＴＧ一ＣＤＦ１基因的ｍＲＡ和蛋白水平，Ｎ以软琼脂集落形成试验观察癌细胞锚着不依赖性增殖能力，以划痕试验方法评测癌细胞的迁移能力；Ｂｙｅ用ｏｄｎ模型观察癌细胞侵袭能力。结果ＴＧ一基因ｓＮＤＦ１ｉＡ转染组ＴＧ一ｍＲＡ和蛋白水平明显下调，ＲＤＦ１Ｎ且呈浓度和时间依赖性（均ＴＧ一ＤＦ１在鼻咽癌细胞生长、移、迁侵袭中起着重要的作用；采用Ｐ＜．０）００１。体外试验发现，ＤＦ１ｓＮＴＧ一ｉＡ转染可有效抑制鼻咽癌细胞集落生长、Ｒ侵袭和迁移能力，且与浓度相关（Ｐ＜００５。结论均．０）ＴＧ一ｓＮＤＦ１ｉＡ转染可抑制鼻咽癌细胞侵袭。Ｒ
沈荣，龚丹丹＋范钰
基金项目：江苏省自然科学基金资助项目（Ｓ０９０）Ｂ２０２５作者单位：１０２江苏镇江，２２０江苏大学附属人民医院耳鼻喉科（荣）江苏大学附属人民医院肿瘤研究所（钰，沈；范龚丹丹）第一作者：沈荣，，男江苏镇江人，副主任医师，主要从事耳鼻喉科肿瘤基础与临床研究，－ｉ：ｕ３＠ｓａｃｒＥｍａｙｆ６ｉ．ｏｌｎｎ
ｔ，ｈｎａｇ２２０，ｈｎ）ｙＺｅｎ１０２ＣｉｉｆａＣｒｓｏｄｎｕｈｒＳＥｏｇ， — ａｌｙｆ６ｓａｃｒｏｒｐｎｉｇａｔｏ：ＨＮＲｎＥｍｉｕ３＠ｉ．ｏｅ：ｎｎ
ＡｂｔａｔＯｊｃｉｅＴｔｄｅｅｅｔｏＤＦ１ｓａｌｎｒｒｇＲＡ（ｉＮｓｒｃ：ｂｅｔｏｓｙｈｆｃｆＧ一ｍｌｉｔｅｉＮｖｕｔｆｓＴｅｎｆｓＡ）ｏｖｓｎａｄｍ — Ｒｎｉａｉｎｉｎｏ
ｒｎｅｌａｃｒｃｌＳＥＲｎＧＮａ —ａＦＮｕ．（．ＤｐｒｎｔａｙｇｌｉｌＡｌｙｇａｃｎｅｅｓＨＮｏｇ，ＯＧＤｎｄｎ，ＡＹ１ｅａｔｔｆＯｏｒｏｇｃ，ｊｉｌｍｅｏｌｎｏａｆ — ｉａｅｅｐｅｏｉｌＪｎｓｎｖｒｔ；．ＣｎｅＩｓｔｔ．ｆｌｔｅｌ’ ＨｓｉｌＪａｇｕＵｉｒ — ｔＰｏｌＨｓｔｉｇｕＵｉｓｙ２ａｃｒｎｔｕｅＡｆｉｅＰｏｅＳｏｔｉｎｓｎｅｉｄｓ＂ｐａｏａｆｅｉｉｉａｄｐｐａｏｆｖｓ
【关键词】鼻咽癌；畸胎瘤衍生生长因子一因；癌细胞迁移；癌细胞侵袭；癌细胞生长；１基
小干扰ＲＡＮ
ｄｉ１．９９ｊｉｎ１７４３．００．１ｏ：０３６／．ｓ．６４— １６２１．５００ｓ１
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