第二章 固定化载体的筛选
各种酶固定方法
一、D380(功能基团为伯氨基)为载体戊二醒交联固定化α一淀粉酶1、固定化载体的预处理吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸馏水交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性备用；离子交换树脂先用蒸馆水漫泡胀润、去杂，然后用 HCl 、NaOH 交替处理，最后用蒸锢水冲洗至中性，置于 4 "C冰箱保存备用。
2、载体选择取处理后载体(湿态)约1.0g，分别加入 20mL 酶液摇匀，在摇床上室温 (25°C摄氏度),100r/min 振摇，过夜(12h)，弃去上清，并以磷酸缓冲液反复洗涤至洗涤液中无蛋白检出。
分别测定固定化酶和上清液的酶活，并计算固定化得率。
根据其酶活和得率进行筛选。
３、固定化条件的优化取处理后载体(湿态)1.0g左右，加入一定量戊二醒，在摇床上定温(25°C) , 100r/min 振摇一定时间，弃去上清，蒸馏水反复冲洗至无戊二醛残留。
处理后加入酶液进行固定化，条件同载体选择。
4、蛋白质含量测定采用 Bradford 的方法，以牛血清蛋白为标准曲线。
5、酶活收率指实际测定的总的固定化酶活与固定化时所用的全部游离酶活之比。
6、酶活测定以 20.0mL 的 2% 可溶性淀粉为底物，加入 5.0mL 的缓冲液。
在60 °C预热 5min 后加入适量固定化酶或稀释至适当浓度的酶液，准确反应 5min 后，立即取出1.0mL 反应液置于稀腆液5.0mL 中摇匀显色。
以稀腆液为空白，于 660nm 波长下测定其吸光度值。
二、D301 树脂固定化假丝酵母脂肪酶1、固定化载体及其预处理选择 7 种工业应用广泛的吸附和离子交换树脂： D301、D113、AB-8、D3520、D4020、D290、D280, 购自南开大学化工厂。
其中 D301 为大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂,D113 为大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂, AB-8、D3520 和 D4020 为大孔吸附树脂, D290和 D280 为大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。
固定化细胞技术
固定化细胞技术（简称IMC），也称固定化微生物技术，是指通过 化学或物理手段，将微生物细胞固定在载体上使之成为不悬浮于水但仍保 留其固有的生物催化活性，在适宜条件下能被重复连续使用的生物工程技 术。最初主要用于工业微生物发酵中。70年代后期，由于水污染问题日 益严重，迫切需要开发高效废水处理技术。于是人们开始考虑将固定化细 胞技术引入废水处理领域。该技术可将筛选出的优势菌种或微生物加以固 定，从而构成一个高效的废水处理系统。
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2、包埋法 包埋法的原理是将微生物细胞截留在水不溶性的凝胶聚合物孔隙的
网络空间中或埋于半透膜聚合物的超滤膜内，通过聚合作用、离子网络形 成、沉淀作用，以及通过改变溶剂、温度、pH 值来阻止细胞的泄漏，同 时能让底物渗入和产物扩散出来。
目前应用最为广泛的是凝胶包埋法固定大肠杆菌细胞。与液体发酵 相比，包埋的大肠杆菌生产周期短、产物分离方便、能耗低、设备投资少 且大大改善操作条件。包埋法仍存在一些不足，如包埋材料对细胞的毒性 作用、材料本身阻碍大分子底物和氧的扩散、使用过程中的杂菌污染等， 这些还需要进行更深入的研究。
（5）在反应器内长时间运转过程中，固定化系统具有良好的机械稳定性 和化学稳定性； （6）用于制备固定化细胞的载体对细胞来说是惰性的，不损伤细胞； （7）固定化系统使底物、产物和其他代谢产物能够自由扩散，因为产物 和其他代谢产物常常能抑制细胞的酶反应，更需要能够尽快扩散，以消 除抑制作用； （8）单位体积的固定化系统拥有尽可能多的细胞，以更后，氧和底物的传质速率也发生了变化，尤其是采用多 孔载体时，由于载体的作用，使得反应系统中主体的底物浓度及氧浓度与 微生物所处区域的底物及氧浓度发生差异，从而引起固定化后传质效果的 变化。通常，固定化后氧传质收到的阻碍更为明显，因此在好氧条件下， 由于氧传质的限制，固定化微生物处理的废水中的有机物浓度不能过高， 以免限制高密度的微生物活性的充分发挥；在厌氧条件下，由于不存在氧 传质供应的问题，废水中有机物的浓度可以大大高于好氧情况。所以，固 定化微生物的高处理能力可以得到充分体现，而且可以长时间地保持较高 的生物量和活性，充分显示出固定化微生物的优越性。
微生物固定化载体
微生物固定化载体固定化微生物技术是将特选的微生物固定在选证的载体上，限制或定位于一定的空间区域．使其高度密集并保持生物活性，在适宜条件下能够快速、大量增殖的现代生物技术。
固定化微生物具有生物浓度易控制、耐毒害能力强、菌种流失少、产物易分离、运行设备小型化等特点。
近年来固定化微生物技术的研究非常活跃，发展很快，已遍及环境保护、食品工业、化学分析、能源开发、医学和制药等多种领域，并得到了广泛的应用。
同时，对载体材料的性能也提出了更高的要求。
载体材料的性能对固定化微生物功能的发挥起着至关重要的作用，有关固定化载体材料的研究也就显得非常重要1. 微生物固定化对载体材料的要求载体材料的主要作用是为微生物提供栖息和繁殖的稳定环境。
根据所固定的微生物种类以及固定化方法与工艺的不同，需要制备不同的周定化载体材料。
制备合适的载体材料是固定化细胞技术的关键，在选择和制备载体材料时，必须考虑所固定微生物的生理习性及其应用的环境条件。
一般情况下。
理想载体应该具有以下特征：(1)载体对细胞呈惰性，对微生物无毒害；(2)具有高的载体活性，固定化细胞密度大；(3) 力学强度和化学稳定性好，耐微生物分解；(4)操作简便，易于成型；(5)底物和产物的扩散阻力小，具有良好的传质性能；(6)微生物的活性回收率要高，能较长时间使用和重复使用；(7) 原料易得，成本低。
2. 固定化载体材料的种类2.1 天然载体材料天然无机类载体材料主要有沙粒、沸石、硅藻土等。
天然有机载体材料的究和应用较多，它们主要是天然多糖类材料，如纤维素及其衍生物、琼脂、角叉莱胶、海藻酸盐、卡拉胶。
2.2 合成高分子载体该类材料应用较多的主要是聚乙烯醇、聚乙二醇、聚氨酯、羧甲基纤维素等。
2.3 人工无机载体材料多孔陶瓷、活性炭、微孔玻璃、泡沫金属等人造无机载体，大多具有多孔结构，在与微生物接触时，利用吸附作用和电荷效应把微生物固定。
表1为具体固定化载体固定微生物的吸附物质的效果表。
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术酶作为生物体内的催化剂，具有高效性和高特异性的特点。
但在工业生产中，酶稳定性差、易流失，造成成本过高，限制其广泛应用。
因此将酶采用固定化技术，使酶在发挥其高效、专一性同时，还能增强酶的贮存稳定性，提高了生产效率，节约了成本。
本文对酶和细胞的固定化技术进行综述。
【关键词】酶细胞固定化载体应用酶及细胞固定化技术是生物技术的重要组成部分。
20世纪60年代出现了固定化酶技术，60年代末固定化酶技术用于工业生产，70年代出现了固定化细胞技术，80年代又发展了固定化增殖细胞技术以及包括辅助因子在内的固定化多酶反应体系技术。
工程技术日益成熟，成为近代工业生产中不可缺少的组成部分。
所谓固定化技术，是指利用化学或物理手段将游离的酶或细胞（微生物），定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种基本技术，包括固定化酶技术和固定化细胞技术。
固定化细胞的制备方法是多种多样的，任何一种限制细胞自由流动的技术，都可以用于制备固定化细胞。
一般来说，固定化技术大致可以分成吸附法、共价结合法、交联法和包埋法等4大类，其中以包埋法使用最为普遍。
一、固定化技术分类1.吸附法很多细胞都有吸附到固体物质表面的能力，这种吸附能力可以是天生具有的，也可以是经过处理诱导产生的，依靠这种吸附能力，人们发展起许多廉价而又有效的固定化方法。
吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法，前者是使用具有高度吸附能力的硅胶、活性炭、多孔玻璃、石英砂和纤维素等吸附剂将细胞吸附到表面上使之固定化，是一种最古老的方法，操作简单、反应条件温和、载体可以反复利用，但结合不牢固，细胞易脱落。
后者根据细胞在解离状态下可因静电引力（即离子键合作用）而固着于带有相异电荷的离子交换剂上，如DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex、CM-纤维素等。
2.共價结合法共价结合法是细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。
转氨酶的固定化及酶学性质研究
转氨酶的固定化及酶学性质研究董正伟;朱芳莹;朱文渊;田宋奎;柳志强【摘要】利用环氧树脂载体进行固定化转氨酶的研究,通过单因素优化确定了较优的酶固定化条件:ES-103b树脂载体、转氨酶和辅酶磷酸吡哆醛最佳质量比为50:6:5,在pH为7.0的1mol/L磷酸钾缓冲液介质中吸附25 h.将得到的固定化颗粒重新置于pH为9.0的100 mmol/L磷酸钾缓冲液中,30℃保温30 h.取出后置于pH为8.5的3 mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液中,25 ℃保温12h,制得固定化转氨酶,其比活力为52.7 U/g(湿载体),酶活回收率达到49.3％.酶学性质研究表明:固定化转氨酶催化反应最适pH、温度分别为7.0、50℃;固定化酶热稳定性及pH稳定性明显提高,50℃条件下的半衰期为20.2 d;在pH 8.0的三乙醇胺缓冲液中(4℃),10 d后酶活仍保持初始酶活的82.3％.【期刊名称】《发酵科技通讯》【年(卷),期】2016(045)002【总页数】7页(P81-87)【关键词】转氨酶;固定化;磷酸吡哆醛;比酶活;酶学性质【作者】董正伟;朱芳莹;朱文渊;田宋奎;柳志强【作者单位】浙江工业大学生物工程学院浙江省生物有机合成技术研究重点实验室,浙江杭州310014;生物转化与生物净化教育部工程研究中心,浙江杭州310014;浙江工业大学生物工程学院浙江省生物有机合成技术研究重点实验室,浙江杭州310014;生物转化与生物净化教育部工程研究中心,浙江杭州310014;浙江工业大学生物工程学院浙江省生物有机合成技术研究重点实验室,浙江杭州310014;生物转化与生物净化教育部工程研究中心,浙江杭州310014;浙江工业大学生物工程学院浙江省生物有机合成技术研究重点实验室,浙江杭州310014;生物转化与生物净化教育部工程研究中心,浙江杭州310014;浙江工业大学生物工程学院浙江省生物有机合成技术研究重点实验室,浙江杭州310014;生物转化与生物净化教育部工程研究中心,浙江杭州310014【正文语种】中文【中图分类】Q814转氨酶（Aminotransferases，ATs）是一类磷酸吡哆醛依赖性酶，普遍存在于自然界中，在生物体内催化氨基由氨基供体向氨基受体的转移反应。
包埋法固定化微生物技术中的载体选择及在污水生物处理中的应用
文章编号：1004-3918（2009）05-0554-05包埋法固定化微生物技术中的载体选择及在污水生物处理中的应用刘帅，张培玉，曲洋，郭沙沙（青岛大学环境科学与工程系，山东青岛266071）摘要：较详细介绍了包埋法固定化微生物技术中不同种类包埋载体的特点，比较分析了不同载体的使用对污水生物处理效果的影响，指出了包埋法的应用范围.关键词：固定化微生物技术；污水处理；包埋法；载体中图分类号：Q 819文献标识码：A传统的污水生物处理工艺以微生物悬浮态生长的活性污泥处理法为主.此法虽然有很多优点，并且早已在污水处理领域发挥着重要的作用，但同时也存在着许多很难克服的缺陷，比如反应器中生物量的浓度偏低、泥水分离困难、不耐冲击负荷、会出现污泥上浮膨胀和流失等问题.固定化微生物技术是应用于污水处理的新技术之一.由于固定化微生物技术可固定经筛选出的能降解特定物质的优势菌属，能使污水处理系统专一性、耐受性增强，处理效果稳定，运行管理简单，降解效率明显优于传统方法.因此，近年来固定化微生物技术已成为各国学者研究的热点课题，并且已有部分研究成果由实验室走向实际应用阶段.包埋法是固定化微生物技术中应用最广泛的方法之一，国内对于包埋法固定化微生物技术处理污水的研究很多，但是关于介绍和比较包埋法所用载体的文章较为少见.本文就包埋法固定化微生物技术研究中的载体选择进行了介绍，分析比较了不同载体的使用对污水生物处理效果的影响，指出了包埋法的应用范围，以期为包埋法固定化微生物技术中的载体选择提供有益参考.1包埋法固定化微生物技术在固定化微生物技术处理污水的研究中，包埋法是最为常用、研究最为广泛的固定化方法.目前关于该方法处理污水的研究已有大量报道.包埋法是将微生物细胞截留在水不溶性的多聚体化合物孔隙的网络空间中，通过聚合作用，或通过沉淀作用，或通过离子网络作用，或通过改变溶剂、温度、pH 值使细胞截留.多聚体化合物的网络可以阻止细胞的泄漏，同时能让底物渗入和产物扩散出来.包埋法可分为高分子合成包埋、离子网络包埋和沉淀包埋.该法操作简单，对微生物活性影响小，可将微生物细胞锁定在特定的高分子网络中，因此制作的固定化微生物的强度高，与微生物细胞的结合力强，化学性能稳定.2包埋法固定化微生物技术的载体选择包埋法所使用的载体种类较多，但都要求可以形成具有孔隙网络空间的能力，以便将微生物细胞截留在内.对包埋法微生物载体的普遍要求是：固定化过程简单，易于成型，成本低；对微生物无毒性，固定化后细胞密度大；物理稳定性和化学稳定性好，不易被分解.现有的包埋固定化载体大致可分为天然高分子凝胶载体和有机合成高分子载体两类：1）天然高分子凝胶载体有琼脂、角叉菜胶、海藻酸钠、卡拉胶和海藻酸钙等.天然高分子凝胶载体一般具有生物无毒、传质性能良好、成形方便且固定化密度高等优点，但强度较低、抗微生物分解能力较差、在厌氧条件收稿日期:2009-02-18基金项目:国家自然科学基金（50678085，50878107）；山东省教育科技计划项目（J06I03）；山东省研究生教育创新计划资助项目（SDYY07091）作者简介:刘帅（1987-），男，山东潍坊人，从事环境生物学研究通信作者:张培玉（1963－），男，山东青岛人，博士，教授，主要研究方向为环境生物技术.第27卷第5期2009年5月河南科学HENAN SCIENCE Vol.27No.5May 20092009年5月下易被微生物分解.为了克服天然高分子凝胶载体的这些不足，可用交联剂对其进行稳定化处理，通过处理可使天然载体的物理和化学稳定性得到极大的提高，但是载体的传质性能和微生物细胞活力会相应的下降.2）有机合成高分子载体有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光硬化树脂、聚丙烯酸等.有机合成高分子载体的突出优点是抗微生物分解性能好、机械强度高、化学性能稳定、对细胞无毒且价格低廉，因而具有很高的利用价值，被认为是目前最有效的固定化载体.但有机合成高分子载体聚合物网络的形成条件比较剧烈，对微生物细胞的损害较大.3部分包埋剂在固定化微生物技术中的应用现今对于包埋法的研究非常广泛，从载体的构造到反应的机理和控制条件等各方面在国内外都有较深入的研究，不同载体的使用对污水生物处理会产生不同的效果.3．1海藻酸钙的使用海藻酸钙对微生物的毒性很小，固化成型方便，对微生物细胞的富集程度高，所以是目前天然高分子凝胶载体中研究最多、使用最广的载体之一.但是其稳定性差、机械强度不高等缺陷需要进一步改善.由于海藻酸钙固定化细胞的密度高，传质性能好，故对于重金属离子的吸附性能优良.国外的研究者对海藻酸钙包埋法在去除重金属离子的效率以及最佳去除条件等方面做了大量的试验和研究，证明了海藻酸钙作为载体包埋有关微生物，可以作为重金属的生物吸附剂使用，且处理效果较好.Bala Kiran 等[1]用海藻酸钙包埋蓝藻，在不同的金属初始浓度、不同的pH 值、不同的温度条件下研究了对Cr 6＋的吸附效果，结果表明：在金属离子初始质量浓度为50～60mg /L ，pH 为2～3，温度45℃时获得最大吸附率82％.Y .Kacar 等[2]用海藻酸钙固定真菌（Phanerochaetech rysosporium ）包括活的和加热灭活的2种形态菌体处理含Cd 2＋的废水，最大吸附能力分别为（104．8±2．7）mg 和（123．5±4．3）mg ，0．5h 内镉的生物吸附很快就达到85％.海藻酸钙微生物系统用10mmol /L HCl 处理，回收吸附率可达到原来的97％.同样方法用海藻酸钙包埋另一种真菌（Lentinus sajorcaju ）处理含Cd （Ⅱ）废水，实验显示在0．5h 之内，镉的生物吸附很快就达到85％[3]，吸附能力与时间的关系符合假二级方程.Gulay Bayramoglu 等[4]用海藻酸钙包埋固定衣藻制得的固定化小球吸附Hg 2＋，Cd 2＋，Pb 2＋，吸附60min 后可达到吸附平衡，并可用Langmuir 和Freundlich 吸附等温线描述；用2mol /L NaCl 溶液可将吸附在衣藻上的Hg 2＋，Cd 2＋，Pb 2＋解吸下来，解吸率可高达95％.Arica M 等[5]将黄孢原毛平革菌（Phanerochaetech rysosporium ）固定在海藻酸钙中，先制成活菌小球，再将活菌加入5mmol /L CaCl 2溶液，在90℃高温下加热10min ，制成固定加热灭活菌.将这2种菌用于吸附人工静态模拟废水中30～600mg /L 的Pb 2＋和Zn 2＋，对其吸附容量做了细致的研究，结果表明，在pH 5．0～6．0、吸附60min 后，加热灭活菌对Pb 2＋和Zn 2＋的吸附容量为355mg /g 和48mg /g （干质量），大于活菌球的282mg /g 和37mg /g （干质量）.以海藻酸钙为载体的包埋技术还用于处理难降解有机物.国内有研究证明，用海藻酸钙包埋固定优势降解菌（Alcaligenes sp ）降解2，6－二叔丁基（2，6－2DTBP ），在100．0mg /L 的初始质量浓度下，其降解率在12d 可达到86％.与未固定菌株相比，菌株经固定化包埋后其降解的能力大大提高，且固定化菌株对pH 值和温度的适应范围更宽，对底物具有更高的降解能力[6].除固定化微生物外，也有人研究用海藻酸钙固定化酶，但国内外在这方面的研究也较少，这可能是由于海藻酸钙相比较于其他包埋载体来说，凝胶网络的孔隙尺寸过大，酶容易从包埋网络中泄露，造成海藻酸钙对于酶的固定化的效率不高.3．2聚乙烯醇的使用聚乙烯醇（PVA ）在有机合成高分子载体中也是目前研究最多、应用最广的载体之一.聚乙烯醇具有对生物毒性小、物理化学稳定性较高、抗生物分解能力强、价格低廉等优势，但是其传质性能不如海藻酸钙等天然高分子凝胶载体.国内外对于聚乙烯醇固定以硝化菌和反硝化菌的研究较为常见.使用聚乙烯醇包埋微生物的各种制作固定化微生物颗粒的方法中，在低温冷冻条件下包埋高效菌种被证明是一种可以保持高微生物活性的有效方法.国外有研究[7]表明，用PVA 冷冻法把硝化污泥固定在3～5mm 聚乙烯醇小球里用来处理养猪废水，采用批量试验和连续试验进行好氧处理.结果当HRT 为4h 时，NH 3－N 的硝化率为567mg /d ，硝化污泥小球不受养猪废水高BOD 浓度的影响，适用于快速和有效地去除厌氧养猪废水塘中的NH 4＋.还有研究者[8]以PVA 刘帅等：包埋法固定化微生物技术中的载体选择及在污水生物处理中的应用555--第27卷第5期河南科学为载体，采用冷冻法混合固定硝化菌和反硝化菌，研究了好氧条件下同时硝化和反硝化的可行性及其脱氮特性.结果表明，硝化菌和反硝化菌混合固定时，由于载体内部形成了适合硝化和反硝化的环境，可以在好氧条件下同时进行硝化和反硝化，实现单级生物脱氮.混合固定时的氨氧化速度约为硝化菌单独固定时的14倍，约为PBS 脱氮速度的2．6倍.硝化菌和反硝化菌混合固定后对温度的敏感性减小，并且在较宽的溶解氧范围（2～6mg /L）保持稳定的脱氮速度.国内关于聚乙烯醇固定硝化菌反硝化菌处理氨氮废水的研究也有一定进展，许多实验都有很高的氨氮去除率.谭佑铭[9]等研究固定化PVA 反硝化菌对富营养化水体中硝酸盐氮的还原能力，以及对水体中有机物的降解情况.结果，经过40d 的处理后，原水中的亚硝化菌和硝化菌能将水样中的氨氮转化成硝酸盐氮，转化率约为57．5％，但原水中的反硝化细菌作用较微弱，对照水样中总无机氮的去除率约为6．7％.耿振香等[10]采用聚乙烯醇包埋固定从活性污泥中筛选的硝化菌和反硝化菌，对生活污水进行硝化反硝化工艺处理，废水中氨氮为45mg /L ，pH 值为7．5，DO 为2．0mg /L ，水力停留时间为18h ，氨氮去除率可达96％.张爽等[11]采用聚乙烯醇－硼酸包埋法固定经常温富集培养的含耐冷菌的硝化污泥，用于处理常温和低温生活污水，进行了比较研究.结果表明，该固定化硝化菌群在常温下经过1个月的活性恢复和增殖后，转入低温环境，在短期内表现出一定的适应性，作用6h 后对NH 4－N 的去除率为80％左右.在常温下，该固定化菌更表现出高效的氨氮去除能力，作用3h 后，去除率达90％以上.赵兴利[12]等利用PVA 包埋粉末活性炭驯化硝化菌，以流化床为生物反应器，采用SBR 运行方式，固定化硝化菌寿命长达7个月以上，NH 4－N 去除率维持在90％以上.以上大量的研究表明，聚乙烯醇是固定硝化菌和反硝化菌处理氨氮废水的优良包埋载体，其包埋效果较好，对氨氮的去除效率较高.这主要是由两个方面的因素造成：一方面，聚乙烯醇可以利用自身内部空间对氧扩散情况的影响，自然形成由里而外的好氧区、缺氧区和厌氧区，从而使硝化菌和反硝化菌各自在适合于自身相对独立的环境下生长代谢，实现好氧条件下同时硝化反硝化；另一方面，聚乙烯醇的物理化学稳定性较强，机械性能好，所以对于硝化菌这种需要较长生长代谢时间的菌种的固定化效果好.因此，聚乙烯醇作为包埋材料处理氨氮废水具有很好的应用前景.聚乙烯醇作为包埋材料也可以用于重金属离子的废水处理，如用PVA 固定氧化亚铁硫杆菌（A cidithiobacillus ferrooxidans ），在稀释率0．4时，Fe 2＋的最大氧化速率达到3．1g /（L ·h ），并且固定颗粒稳定性好，可连续运行2个月以上[13].采用液－液相分离的方法制备聚乙烯醇共包埋活性炭和纳米TiO 2的微球，对废水中的Cr 6＋也有较好的处理效果.当微球加入量为140g /L ，微球中活性炭、纳米TiO 2包埋量分别为6％和4％，pH 值为3，作用时间为3h 时，Cr 6＋的去除率可达90％以上，且微球使用方便，不会造成二次污染[14].聚乙烯醇与活性炭或其他吸附载体复合包埋微生物在处理难降解有机毒物方面也有不错的效果.采用PVA 和活性炭的复合载体制作固定化污泥颗粒处理含酚废水，结果表明，在污泥与载体体积比为1∶1、平均粒径2～4mm 的条件下，PVA 和活性炭的固定化污泥颗粒可以在水里停留6h ，泥水体积比为1∶4、进水酚达250mg /L 时，取得99．8％的酚去除率[15]，废水可达到国家排放标准.国内还有研究者[16]采用PVA 与聚丙烯无纺布（多孔结构）的复合载体来降解含有喹啉、异喹啉、吡啶的高浓度氨氮焦化废水，3种难降解有机物经处理8h 后降解率均在90％以上.现对聚乙烯醇作为包埋载体在污水除磷方面也有一定的研究.使用PVA 作为包埋材料固定假单胞菌为优势微生物的活性污泥，采用硼酸进行交联，制成的固定化微生物系统可以保持较高的微生物细胞活性，该系统具有明显的除磷能力和较好的抗酸、碱冲击能力；在起始质量浓度为87．5mg /L 时，6h 可去除49．5％的磷；在酸性条件下，24h 除磷率为88．2％；在好氧条件下，固定化污泥还具有明显的脱氮能力[17].这为采用固定化细胞法同时进行污水的脱氮、除磷处理提供了可能.聚乙烯醇在包埋法处理废水中具有自身的特点与优势：①生物相容性强，对微生物细胞无毒，成本较低；②有极好的流变学性能（不易碎），可作为大多数反应器的固定化载体；③有超常的热稳定性（相比于热可逆性凝胶）；④对生物降解耐受性很高，对培养介质成分无不良反应；⑤聚乙烯醇有很高的大小孔隙率，可提供最佳的菌体代谢物转运途径[18].正是由于聚乙烯醇作为有机合成高分子包埋载体所具有的巨大优势，所以它将会在固定化技术中得到更广泛的应用.3．3海藻酸钠的使用海藻酸钠作为固定化包埋载体材料，具有制备容易，价格低廉，传质性能良好的优点，应用范围也比较广泛.556--2009年5月在处理重金属方面，海藻酸钠作为固定化包埋载体材料对金属离子的吸附率较高，与国外学者采用海藻酸钙固定菌种处理重金属离子相对照，国内学者[19]采用海藻酸钠包埋小球藻和叉鞭金藻，制得含藻细胞的固定化胶球，用其对Ni 2＋进行生物吸附，研究了固定化小球藻和固定化叉鞭金藻对污水中Ni 2＋的吸附率.结果表明，对于同一种固定化微藻，处于对数生长中期时对Ni 2＋吸附效果较好，且吸附过程主要在前4h 完成，Ni 2＋浓度越大，吸附率越高.固定化微藻比悬浮态微藻吸附率高，固定化小球藻比固定化叉鞭金藻吸附率高.海藻酸钠作为固定化包埋载体材料对于高浓度有机废水和难降解污染物质的处理效果也非常显著.将海藻酸钠固定化活性污泥制成颗粒小球，以流化床反应器对甲醇废水进行处理，在溶解氧为6．6～6．9mg /L 的条件下，固定化小球与废水的体积比为30∶1000，最佳的工况条件是温度为30～40℃，pH 值为5．0～9．0；当进水COD＜722．2mg /L ，进水甲醇＜307．4mg /L 时，对COD 的去除率＞85％，对甲醇的去除率可达到90％左右[20].以海藻酸钠为载体、戊二醛为交联剂净化有机废水，处理效率稳定在75％，而且耐水质水量变化的冲击力强，有机负荷承受能力增强，进水的COD CR 可高达2500mg /L [21].以海藻酸钠为固定化载体材料，以氯化钙作为交联剂将高效降解油脂菌—解脂耶氏酵母（Y arrowia lipolytica ）包埋制备成固定化微生物小球处理油脂废水，结果表明与悬浮状态相比，固定化微生物温度适应范围增大、热适应性增强、pH 值往酸性方向偏移[22].用普通系统和高效菌种的悬浮投加型强化系统作比较，用海藻酸钠包埋某高效微生物菌种用于强化聚酯废水的生物处理，悬浮投加高效菌种可使出水COD 降低100mg /L ，处理率提高8％，而用海藻酸钠－氯化钙法包埋固定化之后投加则可使出水COD 降低了200mg /L ，处理率提高14％，使最终出水COD 达到100mg /L 以下[23]，达到出水的排放要求，且减少了废水中对人类和环境有较大危害的1，4－二氧杂环己烷的含量.以上实验说明，海藻酸钠作为包埋材料不仅对金属离子的吸附率较高，而且对于高浓度有机废水和难降解有机污染物质的处理效果也较理想.3．4琼脂的使用琼脂作为固定化载体的特点是包埋微生物活性高、制作容易，主要用于重金属元素的去除.如Viktoriya V．Konovalova 等[25]的实验证明，在用游离假单胞菌做吸附试验时，当Cr 6＋质量浓度达到30mg /mL ，吸附率明显下降；而将假单胞菌包埋在琼脂中再吸附Cr 6＋，则Cr 6＋质量浓度达到20mg /L 时仍然保持稳定的吸附效率.因此要保持较高的Cr 6＋的吸附效率，就要避免菌体铬中毒现象的发生，而包埋后的菌体由于琼脂凝胶网格结构的保护减轻了菌体铬中毒性状.但是琼脂在去除重金属元素时也有一定的缺陷，比如氧和底物及产物的扩散受到限制，琼脂凝胶的机械强度不高，且成球受温度影响较大.4包埋法的应用范围随着对包埋法研究的不断深入和扩展，其在污水处理领域的应用也越来越广，但仍有一定局限性，例如由于微生物细胞处于包埋载体的内部，所以使其难以与大分子的污染物接触而发挥降解功能，如厌氧工艺处理含纤维素、蛋白质及脂类的废水.所以包埋法不适于处理大分子有机污染物.根据包埋法处理废水的特点以及实际研究中的应用情况，将其应用范围总结如下：①因为包埋法处理污水的运行管理简单，几乎不需污泥回流，所以适用于占地受限制、要求产泥量少、污泥处理可以简化或省略及运行管理方便的家庭、小区污水处理系统，比如中水道系统.②包埋法可以将微生物细胞稳定的固定在载体之上，使得微生物细胞在系统中的存留生存时间大大延长，所以适合高效菌种竞争力较弱、世代存活时间较长、自然条件下菌种优势难以维持的环境，比如硝化细菌或甲烷菌的培养与生长.③由于包埋法对于优势菌种有较强的选择能力，对于目标污染物的降解优势较为明显，所以适用于处理单一的或对其处理方式限制性很强的污染物.④由于载体阻隔的作用使得微生物经固定化后氧与底物的传质速率受到阻碍，所以在好氧系统中，受此因素的影响，限制了高密度微生物活性的发挥.但是在厌氧情况下，由于整个微生物系统不受氧传质速率的影响，废水中的有机物浓度可以大大高于好氧的条件，固定化微生物的处理能力得到充分的体现，同时由于微生物细胞的高度密集，所以包埋法适用于厌氧条件下的高浓度有机废水处理.⑤当包埋法处理的生物系统与有毒有害物质进行接触时，由于微生物细胞高度密集的强抵抗能力或载体的阻挡作用，削弱了有毒有害物对微生物的冲击作用.所以包埋法较适合于有毒有害物质的生物降解.刘帅等：包埋法固定化微生物技术中的载体选择及在污水生物处理中的应用557--第27卷第5期河南科学参考文献:［1］Kiran B ，Kaushik A ，Kaushik C P．Response surface methodological approach for optimizing removal of Cr （VI ）from aqueoussolution using immobilized cyanobacterium ［J ］．Chemical Engineering Journal ，2006，23（6）：1－7．［2］Kacar Y ，Arpa C ，Tan S ，et al．Biosorption of Hg （Ⅱ）and Cd （Ⅱ）fromaqueous solutions ：comparison of biosorption capacity ofalginate andimmobilized live and heat inactivated Phanerochaetechrysosporium［J ］．Process Biochemistry ，2002，37（6）：201－210．［3］Bayramoglu G ，Dehizh A ，Bektass ，et al．Entrapment of lentinus sajor caju into Ca－alginate gelbeads for removaI of Cd （Ⅱ）ionsfrom aqueous solution ：preparation and biosorption kinetics andysi ［J ］．Microchemical Journal ，2002，72（1）：63－76．［4］Bayramoglu G ，Tuzun I ，Celik G ，et al．Biosorption ofmercury （Ⅱ），cadmium （Ⅱ）and lead （Ⅱ）from aqueous system by microalgaeChlamydomonas immobilized in alginate beads ［J ］．Int J Miner Process ，2006，81（6）：35－43．［5］Arica M Y ，Arpa C ，Ergene A ，et al．Ca－alginate as asupport for Pb （II ）and Zn （II ）biosorption with immobilized Phanerochaetechrysosporium ［J ］．Carbohyd Poly ，2003，52：167-174．［6］张志刚，徐德强，李光明，等．固定化优势菌种降解2，6－二叔丁基酚［J 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，2003，33（6）：899－907．The Choice of Carriers Used in Entrapping Method of ImmobilizedMicroorganisms Technology and Its Application in Sewage DisposalLiu Shuai ，Z hang Peiyu ，Q u Yang ，G uo Shasha（Department of Environmental Science and Engineering ，Qingdao University ，Qingdao 266071，Shandong China ）Abstract:In this paper ，the characters of different carriers used in entrapping method are introduced in detail ，the different effects of such carriers applied in sewage disposal are compared and analyzed ，finally the spectrum of application of entrapping method is summarized．Key words:immobilized microorganisms technology ；sewage disposal ；entrapping method ；carriers 558--。
固定化脂肪酶载体的筛选研究
ｉ ｍｍｏ ｉ ｚ ｄｔ ， Ｈ ｖ ｕ ， ｏ ｉ ｚ ｄｔｍｐ ｒｔ ｒ ｒ ０ｍｇ ８０ｈ， ． ４ ｂｌ ｅ ｍｅ ｐ ａ ｅ ｉ ｉ ｉ ｌ ｍｍ ｂｌ ｅ ｉ ｅ ｅ ａｕ ｅ ｗｅｅ３ ， ． ７０， ０℃ ， ｓ ｅ ｔ ｅｙ ｒ ｐ ｃｉ ｌ． ｅ ｖ
Ｋｅ ｒ ｓ ｌ ｓ ｉ ｙｗｏ ｄ ｉ ｅ；ｍｍｏ ｉｉａｉｎ；ａ ｒｅ ；ｃｅ ｎｎ ｅ ｚ ｍｅａ ｔｖｔ ｅｆｃ ｐａ ｂ ｌ ｔｏ ｃ ｒｉｒ ｓｒ ｅ ｉｇ； ｎ ｙ ｃｉｉ ｚ ｙ； ｆ ｔ ｅ
和 催 化 生 成 不 同 产 物 时都 存 在 缺 点 。 ： 附 法 中酶 与 载 如 吸
２ ％的 乙酸 溶液 ． 制得 ２５ ． ％的壳 聚 糖酸 性 溶 胶 。 搅 拌边 将 边
上述 溶胶 缓慢 加入 到 ８ ０ｍＬ液体 石蜡 和 ５ｍＬＳ ａ ～ ０的 混 ｐ ｎ ８
合 液 中 ， 拌 ２ ｉ ， 溶胶 液 均 匀 分散 。 入 ２ ％戊 二 醛 搅 ０ｍ ｎ 使 加 ５
１ ． 试 验 方 法 ２
１ ． 脂肪酶 的海 藻酸 钠 固定 。 ．１ ２ 准确 称 取 １ 藻 酸钠 加 ． ｇ海 ０
化 合物 的拆分 、 油脂改 性 等方 面 的研究 ｌ］ 由于 脂肪 酶 的 ｌ。 －但 ３ 造价 昂贵 ， 对环 境 耐 受力 低 ， 定 性 较差 ， 游 离酶 不 易 于 稳 且
Ａ
文 章编号 １０ — ７ ９ ２ １ ）５ ０ ２ — ３ ０７ ５３ （０２０ —０４ ０
Ｓ ｒ ｅ ｉ ｇ Ｒｅ ｅ ｒ ｈ ｏ ｚ ｍ ｅ Ｉ ｍｏ ｉ ｚ ｔ ｎ Ｃａ ｒｅ ｃ ｅ ｎ ｎ ｓ ａ ｃ ｆ Ｅｎ ｙ ｍ ｂ ｌ ａ ｉ ｒ ｉｒ ｉ ｏ
ＬＩＭ ｉ ｇ ｋ ｏ ＣＨＥＮ ａ ｇ ｎ— ｕ Ｇｕ ｎ Ｗ ＡＮＧ ｎ Ｇａ ｇ
α-葡萄糖苷酶在凝胶珠和纸基上的固定化及其酶抑制剂筛选
α-葡萄糖苷酶在凝胶珠和纸基上的固定化及其酶抑制剂筛选α-葡萄糖苷酶是一种重要的酶类，参与了糖代谢和消化系统中的一系列生化反应。
酶的固定化（enzymes immobilization）是一种将酶固定在某种载体上的方法，以提高酶的稳定性和重复使用性。
本文将介绍α-葡萄糖苷酶在凝胶珠和纸基上的固定化方法，并探究了其在酶抑制剂筛选中的应用。
α-葡萄糖苷酶的固定化是一种常用的生物技术手段，通过限制酶的运动，提高其在特定条件下的稳定性和催化活性。
凝胶珠是一种常用的酶固定化载体，其具有较大的表面积和很强的化学稳定性。
凝胶珠表面的活性基团可以与酶分子上的氨基酸残基或羧基发生共价键结合，从而实现酶的固定化。
同时，凝胶珠还可以在酶固定化后充当保护层，避免酶在极端环境条件下发生变性。
另外，凝胶珠在反应体系中起到了“支架”的作用，增加了底物与酶结合的机会，进一步提高了酶催化的效率。
与凝胶珠不同，纸基是一种较为简单和廉价的酶固定化载体。
纸基表面往往带有一定的孔隙结构，这为酶的固定化提供了空间。
一种常见的纸基酶固定化方法是将酶溶液滴在纸基上，然后通过干燥将酶固定在纸基的孔隙中。
与凝胶珠不同，纸基的固定化方式更为简单，但纸基的载体能力较弱，因此固定化后的酶活性可能会受到限制。
在酶抑制剂筛选方面，固定化的α-葡萄糖苷酶在底物中添加潜在的酶抑制剂，观察酶催化反应的变化，从而筛选出具有酶抑制活性的化合物。
通过固定化的酶，我们可以有效地筛选出具有高抑制活性和选择性的化合物。
这种方法在药物开发和生物医学领域具有重要应用，可以发现新的疾病治疗药物或药物作用机制。
综上所述，α-葡萄糖苷酶在凝胶珠和纸基上的固定化可以提高酶的稳定性和活性，为酶的重复使用和底物转化提供了新的途径。
同时，在酶抑制剂筛选中，固定化的酶可以有效地筛选出具有潜在药物活性的化合物。
这些方法在生物医学研究和药物开发中具有重要的意义，对于探索新的治疗方法和药物作用机制具有重要的帮助综合来看，通过凝胶珠和纸基的固定化，α-葡萄糖苷酶的稳定性和活性得到了提高，为酶的重复使用和底物转化提供了新的途径。
低温下固定化微生物降解水体中阿特拉津的效果
选及降解特性方面。然而，悬浮态微生物用于阿特 水，快速混合，使菌种成混悬体，立即使用。，
拉津对地表水、地下水的生物修复尚存一定缺陷， ２
如：单位体积内优势菌浓度低、启动慢、菌体易流失、
实验方法
抗毒性侵害能力差、对激烈的水力条件变化敏感 ２．１ 高效降解阿特拉津菌株的筛选
等∞＿］。因而，对于阿特拉津浓度较低、水力条件变 化不显著的（缓流或静止）受污染地表水、地下水，微 生物固定化修复技术具有特殊的技术优势和应用前 景。
第３８卷 第６期 ２００８年１ １月
吉林大学学报（地球科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊ ｉｔｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｅａｒｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）
Ｖ０１．３８ Ｎｏ．６ Ｎｏｖ．２００８
低温下固定化微生物降解水体中阿特拉津的效果
刘 虹１’２，张兰英１，刘 娜１，刘 鹏
１．吉林大学环境与资源学院，长春１３００２６ ２．吉林化工学院环境与生物工程学院·吉林省吉林市１３２０２２
将粒径分别为０．１＂－－０．５ ｍｍ、０．５～１ ｍｍ和１ ～２ ｍｍ的活性炭５ ｇ加入到１００ ｍＬ菌量为２．０６ ×１０９个／Ｌ（４种菌Ｗ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｎ８按１；１：１：１ 混合）的液体培养基。于１０℃、１１０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养， 每隔１ ｄ察荫数。对比固定化效果。 ２．４ 最佳固定化ｐＨ值的确定
试剂 阿特拉津（吉林市农药厂，纯度＞９２％）， 乙腈（色谱纯），甲醇（分析纯），蔗糖（分析纯），牛肉 膏（分析纯），蛋白胨（分析纯），琼脂（分析纯），浓硫 酸（分析纯），葡萄糖（分析纯）。
材料活性炭、炉渣、沸石。 活性炭预处理 实验固定化所用活性炭为粒 状，活性炭用蒸馏水冲洗４ ｈ以防止碳黑及其他杂 质的干扰．烘干、密封。 １．３ 阿特拉津溶液的制备 （１）阿特拉津模拟溶液：１００ ｍＬ地下水，阿特拉 津根据实验设计添加０．５ ｍＬ。 （２）阿特拉津固体培养基及微最元素制备见参 考文献［５。８］。 （３）菌体悬浊液的制备。
固定化实验报告
实验名称：固定化酶实验实验目的：1. 了解固定化酶技术的原理和应用。
2. 学习固定化酶的制备方法。
3. 探究固定化酶的稳定性及其催化活性。
实验时间：2023年3月15日实验地点：生物实验室实验器材：1. 酶制剂2. 底物3. 固定化载体（海藻酸钠）4. 离心机5. 烧杯6. 移液器7. pH计8. 烧瓶9. 恒温水浴锅10. 紫外分光光度计实验步骤：1. 准备固定化酶载体：将海藻酸钠溶解于适量的蒸馏水中，配制成一定浓度的溶液，加入少量CaCl2，搅拌均匀，使其凝固。
2. 制备固定化酶：将酶制剂与底物按照一定比例混合，加入固定化载体溶液，搅拌均匀，使酶与载体充分结合。
3. 固定化酶的制备：将混合液倒入烧杯中，放入恒温水浴锅中，恒温加热，使酶与载体进一步结合，形成固定化酶。
4. 固定化酶的离心分离：将固定化酶溶液放入离心机中，离心分离，收集固定化酶。
5. 固定化酶的稳定性实验：将固定化酶分别在不同温度、pH值、底物浓度等条件下进行反应，观察固定化酶的稳定性。
6. 固定化酶的催化活性实验：将固定化酶与底物按照一定比例混合，放入烧瓶中，进行反应，通过紫外分光光度计检测反应液中的产物浓度，计算固定化酶的催化活性。
实验结果：1. 固定化酶的制备：成功制备了固定化酶，酶与载体结合良好，固定化酶具有良好的稳定性。
2. 固定化酶的稳定性实验：- 在不同温度下，固定化酶的稳定性较好，40℃时催化活性最高。
- 在不同pH值下，固定化酶的稳定性较好，pH值为7时催化活性最高。
- 在不同底物浓度下，固定化酶的稳定性较好，底物浓度为0.1mol/L时催化活性最高。
3. 固定化酶的催化活性实验：- 通过紫外分光光度计检测反应液中的产物浓度，计算固定化酶的催化活性，结果表明固定化酶具有较好的催化活性。
实验结论：1. 固定化酶技术是一种有效提高酶稳定性和催化活性的方法。
2. 通过固定化酶技术，可以降低酶的失活率，延长酶的使用寿命。
腈水合酶产生菌株的固定化载体选择
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ห้องสมุดไป่ตู้Ｃａ ｒｅ ｅｅ ｔｏ ｆ ｒｔ ｍ ｍ ｏ ｉｉａ ｉｎ ｏ ｔ ｅ Ｈｙ ａ ａ ｅ Ｐｒ ｄ ｉ ｒ ｉ ｒ ｉｒ Ｓ ｌｃｉｎ ｏ ｈｅ Ｉ ｂ ｌ ｔｏ ｆＮｉｄｌ ｄｒ ｔ ｓ ｏ ｕｃｎｇ Ｓｔａｎ ｚ
安徽农业科学 ，ｏｒａ ｆ ｎ ｕ ．Ｓｉ２０ ３ （ ）４ ６ Ｊｕ ｌｏ Ａ ｈ ｉ ｎ Ａ ｃ．０９，７ １ ：８ ６—４６ １ ８８
责任 编辑
张彩丽
责任校对
卢瑶
腈水 合 酶产 生菌株 的 固定化 载体 选 择
张蕾， 智 ，、 刘士 赵金爽 哈 滨 工 学 学 环 工 学 ， 江 尔 ５４ 秦 剥晓君， 好， （尔 理 大 化 与 境 程 院黑 哈 滨１０） 龙 ００
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固定化乳酸菌发酵生产乳酸及提取工艺研究
固定化乳酸菌发酵生产乳酸及提取工艺研究下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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固定化脂肪酶载体的筛选
农业基础科学现代农业科技2012年第5期脂肪酶（lipase）是一类特殊的酰基水解酶和重要的工业酶制剂品种，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，且在异相体系中具有催化活性，广泛应用于生物柴油的制备、手性化合物的拆分、油脂改性等方面的研究[1-3]。
但由于脂肪酶的造价昂贵，对环境耐受力低，稳定性较差，且游离酶不易于回收、难以重复回收利用，使脂肪酶在工业化生产中深受其限[4]。
为此，通过固定化技术和蛋白质工程来大幅提高脂肪酶的综合催化性能已成为当今研究热点。
高阳等[5]以不同大孔树脂吸附法固定化假死酵母99-125脂肪酶，在微水有机相中的应用表明，非极性树脂NKA 是最佳的固定载体。
王冰等[6]以沙蒿—壳聚糖复合磁性微球为载体，采用物理吸附法固定脂肪酶，对影响酶活力的各种因素进行了分析研究。
杨本宏等[7]研究了海藻酸钠法制备固定化德氏根霉脂肪酶的条件。
但许多固定方法在单独使用和催化生成不同产物时都存在缺点。
如：吸附法中酶与载体之间的作用力弱，对外界环境要求严格，且吸附存在非特意性易引入杂质；包埋固定化酶易流失，不利于保存，且对短链醇的有机耐受性差；共价交联过程较复杂，化学试剂的使用使酶在处理过程中容易失活等[8]。
本研究通过对不同固定化材料进行比对分析，选择针对生产生物柴油所需的固定化脂肪酶进行研究，为今后的研究提供参考。
1材料与方法1.1供试材料1.1.1供试药剂。
海藻酸钠：国药集团化学试剂有限公司；壳聚糖：脱乙酰远远大于90.0%，国药集团化学试剂有限公司；大孔树脂：P3520，天津南开大学化工厂；硅藻土：国药集团化学试剂有限公司；脂肪酶：阿拉丁试剂公司，10万U/g；三丁酸甘油脂：阿拉丁试剂公司。
1.1.2主要仪器。
电子天平：德国赛多利斯股份公司；恒温磁力搅拌器：金坛市富华仪器有限公司；PB-10数字酸度计；多用途台式恒温振荡器：DDHZ-300。
1.2试验方法1.2.1脂肪酶的海藻酸钠固定。
基于生物素标记技术的载体筛选与构建
基于生物素标记技术的载体筛选与构建生物素标记技术在现代生物学研究中扮演着重要的角色，在许多实验操作中起到了关键作用。
其中，基于生物素标记技术的载体筛选与构建方法是常见的一个研究方向。
本文将介绍生物素标记技术的基本原理，以及如何应用生物素标记技术进行载体筛选与构建。
一、生物素标记技术的基本原理生物素是一种有机分子，是许多生物体内的必需物质之一。
生物素和其受体的结合是一种高度特异性和亲和性相当强的生物分子作用。
因此，利用生物素和其受体之间的高度特异性，可以选育出许多具有高度亲和力和特异性的生物素受体分子。
生物素标记技术是指将生物素与目标蛋白或核酸结合，形成生物素标记分子。
生物素标记分子相对于其他标记分子具有较高的灵敏度和特异性。
通过与亲生素受体结合，可以实现对靶分子的检测和纯化。
因此，生物素标记技术被广泛应用于生物医学研究和分子诊断等领域。
二、基于生物素标记技术的载体筛选与构建流程载体构建是基因工程领域中常见的实验操作之一，其目的是将目标基因插入到载体中，使基因得以表达。
在这个过程中，常常需要进行载体筛选，以选育出能够表达目标蛋白的高效载体。
下面将详细介绍基于生物素标记技术的载体筛选与构建流程。
1. 载体构建载体构建的基本步骤是将目标基因克隆到载体中。
一般来说，可以选择合适的酶切位点，利用限制性内切酶对目标DNA进行切割，并同时切割载体DNA。
然后，将目标基因插入到载体的酶切位点上，并利用DNA连接酶将两者连接起来。
最后，通过电转化或化学转化等方法将重组后的DNA导入到宿主细胞中。
2. 生物素标记分子的合成生物素标记分子通常采用亲生素（或其他生物素衍生物）与标记物质连接而成。
生物素与生物素结合蛋白（SA）的特异性非常高，因此亲生素与SA结合后，可实现标记物与载体之间的高效连接。
一般来说，可以采用商业化的生物素标记试剂盒或自行合成亲生素及标记物进行合成。
3. 载体筛选利用生物素标记技术进行载体筛选的主要步骤有三个：首先利用生物素标记分子将具有生物素受体的磁珠与目标载体结合；然后利用磁珠轻松地将载体从混合物中分离出来；最后，通过转化到细胞中，通过观察表达的蛋白质来验证哪个载体是所需要的。
固定化细胞技术步骤
固定化细胞技术步骤
固定化细胞技术是一种将细胞固定在特定的载体上，以便更好地进行细胞生物学研究的方法。
下面是固定化细胞技术的具体步骤： 1. 准备培养基和装置：选择适合细胞生长的培养基，并准备好装置，如培养皿、载玻片、载体等。
2. 筛选合适的细胞：根据实验需要，选择合适的细胞进行固定化。
不同类型的细胞对固定化的要求不同，需要根据具体情况进行选择。
3. 固定化细胞：将细胞加入到载体中，如聚合物材料或凝胶中，并使用化学方法或物理方法使细胞固定在载体上。
4. 培养固定化细胞：固定化细胞可以在培养基中进行培养，以维持其生长和代谢。
在不同的实验条件下，可以调整培养基的成分和培养时间。
5. 细胞观察和分析：使用适当的技术，如显微镜、荧光显微镜、流式细胞术等，对固定化细胞进行观察和分析，以了解其生物学特性和功能。
固定化细胞技术在细胞生物学和医学研究中具有广泛的应用，可以帮助研究人员更好地理解细胞的生命活动和疾病发生机制。
- 1 -。
固定化载体的筛选
第二章固定化载体的筛选固定化酶的载体材料是影响固定化酶性能的重要因素之一。
酶的固定化载体通常需要具备的性质有以下几点：①带有能与酶发生反应的官能团；②具有大的比表面积和多孔结构；③不溶于水；④机械刚性和稳定性都非常好；⑤能防止微生物的降解作用。
此外，还希望载体材料无毒、无污染、成本低廉、来源丰富。
目前使用和研究中的固定化酶载体材料种类繁多，按其化学组成可以分为无机载体、天然高分子载体、合成高分子载体等。
2.1实验材料表2-1实验试剂试剂名称级别生产厂家D-葡萄糖AR 国药集团化学试剂有限公司酵母膏AR 南京宁试化学试剂有限公司蛋白胨BR OXOID琼脂AR 上海化学试剂厂磷酸二氢钾AR 广东·汕头市西陇化学厂磷酸氢二钠AR 广东·汕头市西陇化学厂考马斯亮蓝G-250 上海生工生物工程上海有限公司氯化钠AR 上海四赫维化学公司异丙醇AR 天津市福晨化学试剂厂离子交换树脂安徽三星树脂科技有限公司戊二醛AR Siama 公司蔗糖AR 西陇化工股份有限公司乳糖AR 中国惠兴生化试剂有限公司乙醇AR 无锡市亚盛化工有限公司氢氧化钠AR 西陇化工有限公司浓盐酸AR 上海中试生化表2-2 实验仪器仪器名称规格与型号生产厂家酶标仪Power Wave XS 美国BIO-TECH公司恒温培养箱PYX-DHS-40*50-BS 上海跃进医疗器械厂超净工作台SW-CJ-1B 苏州净化设备厂电子天平BP110S Sartorias精密PH计Cole Parmer Cole Parmer Instrument Co.隔水式电热恒温培养箱PYX-DHS 上海市跃进医疗器械一厂手提式压力蒸汽灭菌锅YXQSG41280 上海医用核子仪器厂电热恒温干燥箱HG202-1 南京实验仪器厂752紫外光栅分光光度计752 上海精密科学仪器有限公司快速混匀器SK-1 常州国华电器有限公司高速离心机TGL-16G 上海安亭科学仪器厂2.2实验方法2.2.1 β-呋喃果糖苷酶Fru6粗酶液的制备菌株：节杆菌Aspergillusoryzae arilatensis NJEM01 ，本实验室筛选获得。
肽库筛选结合方法
肽库筛选是一种在药物研发、生物标志物发现、疫苗设计等领域广泛应用的技术，目的是寻找能够与目标分子（如受体、酶、抗体等）特异性结合的小分子肽。
以下是一些肽库筛选结合方法的简介：
1.固相筛选法：
o直接包被法：将靶蛋白固定在固相支持物（如酶标板、磁珠等）上，然后将肽库溶液过柱或与固相载体孵育，未结合的肽被洗脱掉，而与
靶蛋白紧密结合的肽则保留下来，随后通过检测手段（如ELISA、荧
光检测、生物素-链霉亲和素系统等）确定结合的肽序列。
o融合蛋白筛选：将目标蛋白与一个固定在固相载体上的标签蛋白（如GST、MBP等）融合，然后通过肽库筛选，寻找与融合蛋白结合的
肽段。
2.噬菌体展示技术：
o噬菌体展示肽库是由随机氨基酸序列展示在噬菌体衣壳蛋白上的多肽库，将这些噬菌体暴露于目标蛋白，结合的噬菌体通过洗涤步骤被保
留下来，然后通过扩增和测序技术确定结合的噬菌体所携带的肽段序
列。
3.细胞筛选：
o在细胞水平上，将肽库与活细胞相互作用，通过观察细胞内信号传导的变化、细胞活力变化或者其他生物效应来筛选出能够与细胞表面受
体或通道蛋白等结合的肽段。
4.亲和层析筛选：
o利用目标蛋白与亲和介质（如特定配体结合的树脂）结合，将肽库过柱，结合的肽段通过洗脱和检测步骤来鉴定。
5.生物芯片技术：
o将大量不同的肽段固化在生物芯片上，然后通过与标记的目标蛋白孵育，通过检测芯片上哪些点位有信号增强来确定哪些肽段具有结合活
性。
在这些方法中，筛选过程可能还包括多轮迭代优化，以提高结合肽的选择性和亲和力。
载体连接和蓝白筛选详细步骤
载体连接和蓝白筛选详细步骤
载体连接及蓝白筛选
1、在微量离心管中配置下列DNA溶液，全量5ul。
pMD 19-T Vector 1 0.5ul
Insert DNA 3 2ul
Solution 1 2.5ul
2、16℃反应过夜。
3、（提前打开水浴锅，打开超净工作台，同时灭上1ml的枪和枪头）全量5ul，加入50ul感受态细胞。
（加感受态细胞要慢慢吸取慢慢打出，同时不要离开冰太长时间）
4、冰中放置30min。
5、42℃加热45s后，在冰中放置2-3min。
6、加入890ul SOC（LB+Amp）培养基，37℃振荡(180)培养60min。
7、取出，先用酒精擦拭手，操作台和管子，点燃酒精灯，打开培养皿，将边沿在酒精灯上烤一下，将混合液倒入培养皿中，摇动培养皿铺匀，然后拿起推子，在酒精中灭菌，放在酒精灯上烤一下，冷却后在培养皿中来回推上几次，以混匀，之后凉10min左右，再次推匀，凉一会。
8、封口，放在37℃下培养过夜，不摇。
大约需要培养24小时。
9、提前准备好（LB+Amp）培养基，和灭菌的锥形瓶，蓝白菌落长出来后，先用酒精灯擦拭手，桌面，及锥形瓶表明，LB+Amp倒入锥形瓶中适量，打开板子，酒精稍瓶口和镊子，用镊子夹起牙签，挑单独的，长得较圆的菌落斑，放入锥形瓶中，封口，标记。
10、摇菌，37℃振荡(180)，过夜，然后做菌液PCR。
常用酶制剂的生产方法
常用酶制剂的生产方法引言：酶是生物体内一类高效催化剂，具有高效催化、高度特异性和温和条件下反应等特点。
其广泛应用于医药、食品工业、环境保护等领域。
本文将讨论常用酶制剂的生产方法。
一、酶的筛选酶的筛选是酶制剂生产过程中的关键步骤。
常用的筛选方法包括传统筛选、分子筛选和基因工程筛选。
1.传统筛选：传统筛选基于酶催化反应产物的定量或定性分析。
通过观察反应产物的形成情况，筛选出具有高催化活性的酶。
传统筛选方法常用于挑选一些常见酶制剂，如蛋白酶、淀粉酶等。
2.分子筛选：分子筛选基于酶底物和产物的结合力。
通过制备一系列结构类似的化合物，分析它们与酶的结合力，从中选择出对目标底物具有高结合力的分子。
分子筛选常用于筛选特定底物的酶制剂，如酯酶、脱氢酶等。
3.基因工程筛选：基因工程筛选基于对酶基因进行改造，通过体外酶活性的分析来筛选出符合要求的酶制剂。
常见的基因工程筛选方法包括突变筛选、重组融合和高通量筛选。
二、酶的提取和纯化酶的提取和纯化是酶制剂生产的重要步骤，常用的方法包括固液分离、沉淀、超滤等。
1.固液分离：固液分离是将酶从固态生物质或液态培养基中分离出来的过程。
常见的固液分离方法包括离心、过滤和压滤等。
该方法适用于酶制剂生产中的初步提取。
2.沉淀：通过添加盐类或有机溶剂，使酶沉淀成块，然后通过离心或过滤将其分离出来。
此方法可用于酶的粗提和初步分离。
3.超滤：超滤是一种利用超过膜孔大小的压力将溶液中的大分子物质与溶剂分离的方法。
通过选择合适的膜孔大小，可将酶和低分子物质分离开来，达到酶的纯化目的。
三、酶的固定化酶的固定化是将酶以固定形式嵌入在载体上，提高其稳定性和循环使用性能。
常用的固定化方法包括吸附、交联和包埋等。
1.吸附：酶通过静电作用、吸附剂（如硅胶、活性炭等）的架桥作用，被吸附在载体表面。
吸附方法简单易行，适用于大分子酶制剂。
2.交联：酶通过与载体交联剂的共价结合，被固定在载体上。
交联固定化技术可以提高酶制剂的稳定性和催化效率。
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第二章固定化载体的筛选
固定化酶的载体材料是影响固定化酶性能的重要因素之一。
酶的固定化载体
通常需要具备的性质有以下几点：①带有能与酶发生反应的官能团；②具有大的
比表面积和多孔结构；③不溶于水；④机械刚性和稳定性都非常好；⑤能防止微
生物的降解作用。
此外，还希望载体材料无毒、无污染、成本低廉、来源丰富。
目前使用和研究中的固定化酶载体材料种类繁多，按其化学组成可以分为无机载
体、天然高分子载体、合成高分子载体等。
2.1实验材料
2.1.1试剂
表2-1实验试剂
试剂名称级别生产厂家
D-葡萄糖AR 国药集团化学试剂有限公司
酵母膏AR 南京宁试化学试剂有限公司
蛋白胨BR OXOID
琼脂AR 上海化学试剂厂
磷酸二氢钾AR 广东·汕头市西陇化学厂
磷酸氢二钠AR 广东·汕头市西陇化学厂
考马斯亮蓝G-250 上海生工生物工程上海有限公司
氯化钠AR 上海四赫维化学公司
异丙醇AR 天津市福晨化学试剂厂离子交换树脂安徽三星树脂科技有限公司戊二醛AR Siama 公司
蔗糖AR 西陇化工股份有限公司
乳糖AR 中国惠兴生化试剂有限公司
乙醇AR 无锡市亚盛化工有限公司
氢氧化钠AR 西陇化工有限公司
浓盐酸AR 上海中试生化
2.1.2仪器
表2-2 实验仪器
仪器名称规格与型号生产厂家
酶标仪Power Wave XS 美国BIO-TECH公司恒温培养箱PYX-DHS-40*50-BS 上海跃进医疗器械厂
超净工作台SW-CJ-1B 苏州净化设备厂
电子天平BP110S Sartorias
精密PH计Cole Parmer Cole Parmer Instrument Co.
隔水式电热恒温培养箱PYX-DHS 上海市跃进医疗器械一厂手提式压力蒸汽灭菌锅YXQSG41280 上海医用核子仪器厂电热恒温干燥箱HG202-1 南京实验仪器厂752紫外光栅分光光度计752 上海精密科学仪器有限公司快速混匀器SK-1 常州国华电器有限公司
高速离心机TGL-16G 上海安亭科学仪器厂2.2实验方法
2.2.1 β-呋喃果糖苷酶Fru6粗酶液的制备
菌株：节杆菌Aspergillusoryzae arilatensis NJEM01 ，本实验室筛选获得。
工程菌E.coli BL21(DE3)/pET22b-fru6,本实验室构建。
培养基：LB氨苄固体培养基（g/l）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，琼脂粉18，灭菌
冷却后加入无菌的氨苄青霉素（Amp），使其终浓度为100ug/ml。
LB氨苄液体培养基（g/l）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10,琼脂粉18，灭菌使用时加
入无菌的氨苄青霉素（Amp），使其终浓度为100ug/ml。
从冻存管中转接重组菌E.coli BL21(DE3)/pET22b-fru6于LB氨苄固体培养基上，37℃
培养12h后，挑取一环菌于LB氨苄液体培养基中37℃，200r/mim,培养12h。
以2%（v/v）
的接种量接入50ml新LB氨苄液体培养基中于37℃，200r/mim培养2h后，加入IPTG致终
浓度为1mmol/l，30℃诱导培养8h。
培养结束后将培养液以5000/mim，离心15min，收集
上清即为β-呋喃果糖苷酶Fru6粗酶液，4℃保存。
2.2.2β-呋喃果糖苷酶Fru6酶活定义及反应体系
反应体系：取离心后上清酶液50μl加入950μl蔗糖底物（1mol/l ，PH6.47PBS缓冲）
中，置于35℃反应30min ，反应后煮沸10min。
酶活力单位的定义为：35℃，PH6.47条件下，每分钟水解蔗糖底物（1mol/L）产生1μmol
葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活单位（U即umol/(ml.min)）。
2.2.3 固定化载体材料的筛选
2.2.
3.1 大孔树脂的预处理（见图2-1）
称取大孔树脂1g
95%乙醇在30℃，200rpm摇床中浸泡2h
加入5ml PH7的磷酸缓冲混合，在30℃，200r/mim摇床中放置12小时
取出烘干，预处理完成
图2-1
2.2.
3.2 大孔树脂初步筛选
大孔树脂树脂类型功能基团结构
D301 弱碱性阴离子交换树脂-N+(CH3)2苯乙烯-二乙烯苯D201 强碱性阴离子交换树脂–N+(CH3)3苯乙烯-二乙烯苯D101 大孔吸附树脂非极性交联聚苯乙烯AB-8 大孔吸附树脂弱极性交联聚苯乙烯BS-65 大孔吸附树脂非极性交联聚苯乙烯DM301 大孔吸附树脂中极性交联聚苯乙烯
表2-3 大孔树脂
称取D301、D201、D101、AB-8、BS-65、DM301六种树脂（见表2-3）各1g，经过预处理后与酶、戊二醛混合,放在200rpm 、35 ℃摇床固定4h，测量酶活，选择合适的树脂类型。
2.2.
3.3 弱碱性大孔树脂的筛选
大孔树脂树脂类型功能基团结构
D301 弱碱性阴离子交换树脂-N+(CH3)2苯乙烯-二乙烯苯D311 弱碱性阴离子交换树脂–NH2丙烯酸甲脂、D318 弱碱性阴离子交换树脂–NH2丙烯酸甲脂
D330 弱碱性阴离子交换树脂-NH2、=NH、=N、=N-环氧系
D345 弱碱性阴离子交换树脂-NH2、=NH、≡N酚醛系
表2-4 弱碱性离子交换树脂
称取D301、D311、D318、D330和D345五种弱碱性大孔树脂（见表2-4）各1g经过预处理后与酶、戊二醛混合,放在200rpm 、35 ℃摇床里反应4h,固定完成，测量酶活选择合适的树脂基团类型。
将301、D311、D318三种树脂的固定化酶循环反应5次，观察重复利用性。
选出其中最好的载体。
2.3结果和讨论
2.3.1 大孔树脂初步筛选
图2-2：D301、D201、D101、AB-8、BS-65、DM301固定化效果
从图2-2中可以看出，D301大孔弱碱性离子交换树脂固定化效果最好。
D101等非极性树脂与酶进行吸附交联时，戊二醛不能与树脂交联，因此酶与载体的固定化方式仅仅是吸附，而我们的固定化体系是水相，酶的表面是亲水性氨基酸，吸附的酶在水相中容易从载体中脱离，固定化效果不理想。
D201是属于强碱性阴离子交换树脂，而酶在强酸强碱中容易失活，所以固定化效果不及D301弱碱性树脂。
所以弱碱性离子交换树脂可能适合于酶的固定化，我们选择其他4种弱碱性阴离子交换树脂，从中选择出最好的树脂。
2.3.2 弱碱性大孔树脂的筛选
图2-3 ：D301、D311、D318、D330和D345固定化效果
从图2-3可以看出，D301、D311和D318三种大孔树脂固定化效果要比D330和D345好。
D301、D311和D318三种载体的表面都是伯胺基，而D330和D345两种载体上表面基团有伯胺、仲胺和叔胺，可能仲胺与叔胺不能与戊二醛发生交联，这两种载体的伯胺基少于其他三
种，所以固定化效率不及带有伯胺基的树脂。
因此我们实验选择带有伯胺基的大孔树脂作为固定化材料。
接下来对第三种带有氨基的树脂进行重复批次实验，选择重复利用性好的树脂。
图2-4 D301 大孔树脂重复利用性实验
图2-5 D311大孔树脂重复利用性实验
图2-6 D318 大孔树脂重复利用性实验
图2-7 三种大孔树脂重复利用性（5批）
从图2-4到图2-7四幅图中可以看出，在前五批批次上，三种树脂都具有很好的重复利用性，三种大孔树脂在第五批酶活开始下降，D311大孔树脂和D318固定化后，从第二批开始酶活都逐渐增加，可能固定化对酶有个激活的影响，D311
大孔树脂在第三批开始酶活开始赶上D301大孔树脂，并且在后两批酶活都高于其他两种树脂，因此我们选择D311大孔树脂作为我们的固定化材料。