16第十六章遗传工程390-404

第十六章遗传工程教学目的本章要求理解遗传工程的概念，了解遗传工程的内容，理解细胞工程的主要步骤和染色体工程的一般方法，掌握基因工程的主要步骤、工具酶的种类及其作用特点、常用载体的特点、目的基因的分离提取方法、体外重组的机理、基因表达的控制。

学习指导遗传工程是七十年代初期才发展起来的一门新技术。

它是以分子遗传学为理论基础，以现代生物化学和微生物学为技术手段，通过对遗传物质DNA进行人工操作，实现对生物遗传性状的定向改造。

遗传工程包括细胞工程和基因工程。

细胞工程是细胞水平上的遗传操作，基因工程是在分子水平上对遗传物质进行体外操作。

学习本章时，应在了解分子生物学的基础之上，广泛参阅有关文献，增加对各种基因工程步骤的了解，了解遗传工程的成就和前景。

基本概念遗传工程(genetic engineering)：广义的遗传工程是指人为地把一种生物的遗传物质转移到另一种生物的细胞中去，并使这种遗传物质所携带的遗传信息在受体细胞中表达的遗传操作。

包括细胞水平、染色体水平和分子水平等几个方面的遗传操作。

狭义的遗传工程专指基因工程。

细胞工程（cell engineering）是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法。

染色体工程(chromosome engineering)：将一种生物的特定染色体按照人们的意图予以消除、添加或代换同种或异种整条或部分染色体的方法和技术，是染色体水平上的遗传工程，也称染色体操作。

基因工程(gene engineering)：狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因；广义的基因工程则指按人们意愿设计，通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。

细胞核移植(nuclear transplantation)：用细胞融合或显微操作技术，将一个细胞的细胞核移人另一去核的细胞内，借以改变其某些遗传特性的方法。

细胞器移植(organelle transplantation)：将一个细胞中的细胞器移人另一个细胞中去，借以改变细胞的某些遗传特性的方法。

细胞融合(cell fusion)：用人工方法把两个或两个以上的细胞融合成一个细胞，也称作细胞杂交。

载体(vector，vehicle)：是一种转移因子，DNA载体是能够自我复制的DNA分子，它能将DNA片段从一类寄主转运到另一类寄主中。

基因工程常用的载体有质核、入噬菌体、SV40，柯斯体等。

科斯质粒(cosmid)：又称柯斯体、粘性质粒，是含有COS(cohesveend sit的缩写)位390第十六章遗传工程391点的，由λDNA和细菌质粒DNA重组构成的杂种质粒，主要由入DNA的COS段片断，质粒的复制起始区和抗药性标记区，一种或几种限制酶的单一切点组成。

克隆(clone)：或称无性繁殖系，是一批遗传上相同的分子、细胞或来自一个共同祖先的生物无性后代群体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传结构。

限制性内切酶(restiction endonuclease)：能识别DNA分子中的一定序列，从一个特定的位点将DNA链切开的核酸内切酶。

平末端(bluntend)：碱基完全配对的双链DNA的末端。

粘性末端(cohesiveend)：双链DNA分子被限制性内切酶切割之后产生单链互补节段的末端。

两个具有相对末端的单链可以通过碱基配对连接起来。

基因文库(genelibrary)：用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA 的所有片段随机地连接到基因载体上，然后转移到适当的宿主细胞内，通过细胞增殖而构成各个片段的克隆，当制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就称为该生物的基因文库。

分子杂交(molecular hybridization)：两条具有互补核苷酸顺序的单链核酸分子片断，通过实验手段形成DNA—DNA，DNA—RNA，RNA--RNA双链分子的过程。

转染(transfection)：用去蛋白质外壳的病毒核酸感染细胞或原生质体的过程。

探针(probe)：带有放射性同位素或其他活性物质标记的某种特定的DNA或RNA片段，用于核酸分子杂交技术，以检出标本中的待测核酸分子中与探针互补的顺序。

本章主要内容遗传工程就是人们根据自己的需要，有目的、有计划地改造现有的生物类型，甚至按照某种预先设计的蓝图，对生物的遗传物质进行分离提取、剪裁增删、修补替换等操作，从而有效地干预活体的遗传结构体制，进而改变生物的遗传特性的技术。

广义的遗传工程是指把一种生物的遗传物质(细胞核、染色体、脱氧核糖核酸等)转移到另一种生物的细胞中去，并使这种物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。

故广义的遗传工程包括细胞工程、染色体工程和基因工程。

狭义的遗传工程专指基因工程。

基因工程也有广义与狭义之分，狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因；广义的基因工程则指按人们意愿设计，通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。

第一节细胞工程一、细胞融合细胞融合是细胞工程的重要基本技术，是指两个或多个细胞，通过生物学、化学或物理学的办法，使它们彼此融合在一起，产生出兼有两个亲本遗传性状的细胞，从而打破了远缘生物不能杂交的屏障，提供了创造新物种的可能。

它实质上是无性杂交，故又称其为体细胞杂交。

基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体。

同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。

391第十六章遗传工程392392 1．细胞融合的细胞质膜结构基础细胞膜主要由20％～70％的蛋白质和30～80％的脂类和约10％的碳水化合物组成。

质膜具有流动性，膜结构牛的蛋白质和脂类分子具有相对侧向流动性，亦略可横向倒翻、旋转或移位。

质膜具有镶嵌性，类脂双分子层镶嵌膜蛋白质。

两层脂分子以疏水性尾部相对，极性头部朝向水相。

膜蛋白分为分布在膜的内外表面的外在蛋白和不同程度地嵌入膜的类脂双分子层的内在蛋白两种类型。

外在蛋白处于水介质中，呈水溶性。

内在蛋白具有极性，多肽链的极性区突向膜表面，可与糖类结合成糖蛋白；非极性部分埋在双脂层内部，除去内在蛋白会引起膜结构的破坏。

质膜中的糖类主要是中性糖、氨基糖和氨基糖酸，这些糖类主要是以脂类和蛋白质相结合的形式存在，分布于质膜的外表面。

2．诱导融合因子诱导融合因子一般分为三类：病毒、化学试剂和物理作用。

（1）病毒：仙台病毒又称副流感病毒I，易被灭活，对人类危害小，其融合细胞的能力取决于其蛋白质的被膜。

鸡新城疫病毒介导融合细胞效果很好。

DNA病毒、RNA致癌病毒都可作为融合因子。

（2）化学试剂：Ca2+能诱导细胞融合，可能与影响质膜的稳定性有关；聚乙二醇(PEG)具有使植物细胞之间、动物细胞之间以及动植物细胞之间融合的通用性，其作用可能与细胞表面结构间形成离子键有关；NaN02，高Ca2+和高pH，聚乙酸乙烯脂，溶血卵磷脂等都可作为融合剂。

（3）物理作用：包括离心、振荡和显流吸管操作及电脉冲融合技术。

电融合技术是在低压交流电场(100～200v/cm)中将悬浮细胞聚集成串状细胞群，由于膜组分间界面的相互作用、电位差或电场切线力的影响，膜表面颗粒移聚一处，在移开颗粒的区域暴露出脂质，加高压电脉冲(1～1.8KV/cm)将膜击穿，产生脂双层膜孔，引发细胞融合。

3．动物细胞融合的基本步骤（1）亲本细胞的选择和制备细胞悬液根据需要选定用于杂交的亲本细胞。

用于融合的细胞可直接取自于机体，也可以是体外单层或悬浮的细胞。

细胞悬液的制备可用酶法、机械法或二者兼用。

（2）诱导细胞融合将亲本细胞悬液调到适合的细胞密度，按比例混合，进行诱导融合。

诱导融合因子常用仙台病毒(或鸡新城疫病毒)，用前用紫外线或β-丙炔内酯破坏其遗传物质，使其失去感染性。

将需要融合的细胞和仙台病毒一同加入培养基中，混合培养，在仙台病毒的作用下，两种细胞便融合在一起，形成异核体。

异核体经过细胞分裂而产生2个杂种细胞(合核体)。

（3）筛选杂种细胞仿照微生物学的选种原理，使亲本细胞具有可以互补的缺陷(突变)，利用选择性培养基对突变体的选择作用，借此获得具有双亲遗传特性的杂种细胞。

如营养缺陷互补的两个突变体融合后可以在基本培养基上存活生长，而两个亲本细胞则不能存活。

（4）杂种细胞的增殖筛选出杂交细胞后，根据实验目的进行杂种细胞的纯系培养扩增，以便于应用或遗传学研究。

第十六章遗传工程3934．植物细胞融合的基本步骤（1）原生质体的制备通常用酶解法处理植物组织，得到原生质体。

可以将果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶按一定比例配成混合液，一次性处理材料，制备原生质体；也可以先用果胶酶处理材料，得到分散的细胞，然后用纤维素酶处理，去掉细胞壁。

制得的原生质体要净化处理，去掉杂质。

（2）原生质体融合将有活力的两亲本细胞原生质体悬浮液调到一定细胞密度，按比例混合培养；逐渐滴入高浓度的诱导剂，或用物理等方法进行诱导，促进异源原生质体融合。

诱导因子有NaNO3、聚乙二醇(PEG)、高Ca2+浓度高pH法和电脉冲融合技术。

原生质体融合产生的异核体通过同步有丝分裂形成杂合核原生质体。

（3）杂种细胞的筛选将经过融合的细胞混合液移到特定的筛选培养基上生长，对杂种细胞进行筛选。

杂种细胞可依据遗传互补的原理，使亲本细胞具有可互补的缺陷，通过杂种细胞的基因互补而选择出来；也可用药物敏感差异进行选择；还可用低密度培养法，据杂种能形成细胞团的特性选择。

筛选出来的杂种细胞还需通过细胞学鉴定、生化分析和染色体分析确证。

（4）杂种细胞的分化杂种细胞经培养可以形成愈伤组织，通过分化培养基的培养，诱导出根、茎、叶，最后可能分化形成体细胞杂种植株。

二、细胞拆合(核移植与细胞器移植)所谓细胞拆合，就是把核与质分离开来，然后把不同来源的细胞质和细胞核相互配合，形成核质杂交细胞。

利用细胞拆合技术，可研究核酸的合成方式和基因表达受细胞质物质的影响及其机制。

细胞拆合一般指核移植与细胞器移植。

1．核移植核移植就是将某一特定细胞的核转移和嵌入到另一细胞中的过程。

核移植方法有物理法和化学法两种。

（1）物理法(显微操作法)：在显微镜下用微玻璃针或微吸管将细胞核去掉，也可用短光波，如紫外线或激光把细胞核去掉，然后用微吸管移入其他细胞核。

（2）化学法(细胞松弛素B法)：细胞松弛素B有破坏微丝的作用。

用细胞松弛素B 处理哺乳动物细胞，并结合离心技术，可将细胞拆分为外表包一层细胞膜和少量胞浆的核体(也称小细胞)和胞质体。

不同的小细胞和胞质体在仙台病毒或PEG的诱导下融合，形成重组细胞。