SRAP-PCR体系
花生SRAP—PCR技术体系的优化
提供 。C A 丙 烯 酰胺 、 T B、 甲叉双丙 烯 酰胺 、 硫 酸 过
铵 、 E D 均 为 A rso公 司 生 产 , a 购 自 T ME m ec T q酶
( R P 是 一 种 新 型 的遗 传 标 记 系统 , 有 多 态 SA ) 具 性高 、 复性 好 、 重 在基 因组 中分 布均 匀 、 物通 用 引 性 强 等优 点 , 在作 物 遗传 多 样性 研 究 、 品种鉴 定 、
TA G N公 司 ,R P引物 由北 京 华 大 基 因研 究 IN E SA
中心合 成 。
12 基 因组 D A提 取 . N
采用 C A T B一氯 仿 一异 戊 醇 法 J单 株 取 嫩 ,
叶 提 取 基 因 组 D A。 N
因子的浓度进行优化 , 从而保证标记分析体系的
稳定 性 和准确 性 。本研 究 对 花生 S A R P~P R反 C 应体 系 中的 M C d T 、a 和引物 等主要 因 g l、 N P Tq酶 子 进行 优化 分 析 , 立 适 合 花生 基 因组 S A 建 R P— P R的优 化反应 体 系 , C 为开 展 花生 重 要 性状 分 子
( 山东省花生研究所 , 山东 青岛 2 60 ) 6 10
摘
要: 对花生基因组 D A的 S A N R P—P R体 系中 Mg l、 N P T q和引物浓度进行 了优化 , C c: d T 、 a 结果表 明,
春兰SRAP-PCR反应体系的建立和优化
Es t a b l i s h me n t a n d Op t i mi z a t i o n o f S RAP - PCR Re a c t i o n S y s t e m o f C y mb i d i u m g o e r i n g i i
Ni u Ti a n , Zha ng Li n , Wa n g Ho u x i n , Li Ch e ng x i u , S u n Fa n g , Yu Yo n g c h a n g , Ya n Ti ng me i , Wa n g Ch a n g x i a n
计, 从 Mg 2 + . d NT P s 、 T a q 酶、 引物 、 模板 5 种 因素 4 个 水 平对春 兰 S R AP . P C R反 应 体 系进行 优 化 。所 建 立
的体 系为 : 2 5 反 应体 系中含有 2 . 5 mmo l / L的 Mg , 2 mmo l / L的 d NT P , 0 . 5 U的 T a q 酶, 1 . 2 ̄ t mo l / L的 引 物, 9 O n g 的模板 。本研 究 为春 兰指 纹 图谱 的 构建 奠定 了基础 。
s y s t e m i n c l u d e d Mg “2 . 5 mmo l / L , d NT P 2 mmo l / L ,T a q DNAp o l y me r a s e 0 . 5 U, p r i me r 1 . 2 mmo l / L a n d DNA t e e t o t a l 2 5 I x L r e a c t i o n s y s t e m. I t l a i d t h e f o u n d a t i o n f o r t h e c o n s t r u c t i o n o f i f n g e pr r i n t s Ke y wo r d s : C y mb i d i u m g o e r i n g i i ; S RAP ; O r t h o g o n a l D e s i g n ; Op t i mi z a t i o n
桑树SRAP-PCR反应体系的建立与优化
中图 分 类 号 :8 83 ¥8. 文献标识码 : A 文章 编 号 :0 2 8 6 (0 0 1- 1 10 10 — 1 1 2 1 ) 1 15 - 4
Op i ia i n o RAP- t rm l e r
LN Q a g,Q U C a g y Z a g rn Z AO We- u H N X a- ig, I in I h n — u, HU F n -o g, H ig o,C E io qn
T q p lmea e o a — w rme o i ai n r s d t o d c h R a oy r s .F u y t o p i r c mb n t s wee u e o c n u t t e S AP- C mp i c t n o i l er o P R a l i ai f s mub r f o x y
s e i swh n a l e i rme 6 E .T e PC to e e o e n ti e e r h s o e o d r p aa i t n p ce e mp i d w t p i rMe / m2 h R me h d d v l p d i h s rs a c h w d g o e e tb l y a d i f h i h g tb l y wh n a p id t t d h e e c d v ri n mu b ry a d c u d b s d i h u u e r s a c . ih s i t e p l o s y t e g n t ie st i l er , n o l e u e n t ef t r e e r h a i e u i y Ke r s y wo d :mu b ry S AP r a t n s se o t z t n l e r ; R e c i y tm; p i a i o mi o
班克松SRAP-PCR反应体系的优化
8 冰箱保存 , 0 提取其 D NA作为 P R扩增 的模板 。 C
用 于 S APP R反 应 的 T q 、NT s Mg R .C a 酶 d P 、 C1
溶 液 均 购 白天 根 生 化 科 技 ( 京 ) 限 公 司 。 引物 北 有 购 于上 海生 工生 物 工程技 术 服务有 限公 司。
文 献标 识码 : A
文章编 号 :0 11 1(0 10 .0 10 10 .742 1 )50 1—4
Op mi ain o RAP— CR a to se i n sb n s n i t z t fS o P r cin s tm Pi u a k i a e y n a
班 克松 S APP R最佳 反 应体 系为 : . mmo/ 、 . mmo/ NT s 02g l R —C 1 5 l Mg 01 L l d P 、 . mo/ L L引物 、 . u 1 5
口 酶和 3 g 板 D 0n 模 NA。运 用优 化 的反 应 体 系对 班 克松进 行 验 证 , 电泳 结果 显示 扩增 条 带 清晰 ,
班 克 松 ( iu a kin ) 产 北 美 洲 中 部 以 Pn s n s a 原 b a
宁省 抚顺 市温 道林 场 。液态氮 冷冻保 存运输 后置 于
一
北, 为松 科 乔木 , 时候 呈灌 木 状 , 叶 2 1 , 有 针 针 束 广 泛 分 布 于北 美 。班 克松 耐 寒 性 强 , 贫 瘠 , 耐 为早 期 速 生 的 强 阳性 树 种 。2 世 纪 2 年 代 辽 宁省 从 加 ] 0 0 拿 大 引种 栽 培 , 过 几 代 人 的共 同努 力 , 别 是 近 经 特
大白菜SRAP—PCR反应体系的优化
定基础。 以大白菜基 因组 D A为模 板 ,对 P R反 应体 系的各影响 因子进行梯度 试验 ,筛选可扩增 多态性 高、重 N C 复性好 、带型清晰 的最佳 体 系。该体 系( 5 L 为 :M 30mm lL 、d T s03m lL 、Tq酶 1 、 引物 2 ) . o・ ~ N P . mo・ ~ a .U 5 02 p o・ ~ .  ̄ lL 、模板 D A 6 g m N 0n 。该体 系能很 好地 满足大 白菜基 因组 S A R P扩 增的要 求 ,S A R P标 记应 用于大 白菜
m rh m) 由 L 等在 20 年提 出的一种新 的分 o i 是 ps i 01 子标 记技 术【 ” 。其基 本原理是 通过设 计 的引物 对
O F( pnR aig rme) 行 扩增 ,上 游 引物 对 R sO e edn a s进 F
腐欧文氏菌抗病 ;A 9 2 1— 作为父本 ,对软腐欧文 氏
引物选择参考 L、F ro 和 Ra 等的方法【 i ei rl i z 一 , , 由上海生工生物技术公司合成。所选引物序列见表
1 。扩 增 程序 :9 4℃预变 性 3 n 4o变性 3 。 ,9 mi C 0s
3 5℃复 眭 3 2o延伸 1 i,5 0 ,7 s C .mn 个循环;9 5 4o C
菌感 病 。杂 交 后获 得 到 F 代 和 F 代 种 子 。20 : 0 7年 3月 在 校 内温 室 内播 种 ,长 到 2 3片 真 叶 时 ,间 ~
外显子进行特异扩增 ,下游引物对内含子区域 、启
动子 区域 进行 特异 扩增 。因个体 不 同以及 物种 的内
苗 ,每钵 留一株。
究方 向为蔬菜遗传育种 。E m i x y g 2 1@13 cm — a : ui 5 1 9 6 . l n 0
正交设计优化辣椒SRAP-PCR反应体系及引物筛选
,
0. 2 mm o/L dNTPs l ,0. x o/L p i e ,5 g tm p ae DNA n a ttlo 0 L r a t n s l to . 8 Im l rm r 0 n e lt i oa f1 e ci ou i n o
2 T e Ke a o ao y o i C o . h y L b r t r f O l r p,Ja g i Ac d my o rc h r l S i n e , a c a g 3 0 0 C i a 3 in x a e f Ag iu u a ce c s N n h n 3 2 0, h n ; .
Th p i z d S e o tmie RAP — PCR y tm s t se n t r e p p e e m pa m s a d wa ta y a d ei be. 3 — s se wa e t d o h e e p r g r ls n s se d n rla l 5
昌 300 320;3 江 西 省 农业 科 学 院 , . 江西 南 昌 3 00 ) 3 2 0
摘要 : 以辣椒基 因组 D A为模板 , N 采用 L 4 ) ( 正交试验设计 , S A 对 R P反应体 系 中的 5种 关键 因素 ( a N T qD A 聚合 酶 、 、N P 、 Mg d T s 引物 、 模板 D A) N 进行优化 , 结果表 明, 辣椒 S A R P—P R最 佳反应 体系为 :a N C T qD A聚合 酶 0 7 Mg 0 6m lL d T s . o L 引物 0 8I o I 模板 D A 5 g 总体积 为 1 L .5 U、 “ . mo 、N P 2mm l 、 / 0 / . m l x /、 N 0n , O 。运用该 体系对辣 椒 3份种质材料进行验证 , 明该 体系稳 定可 靠 , 证 并从 18个 S A 9 R P引 物组合 中筛 选 出扩增 条带清 晰、 多态性丰 富的 3 个 引物组合 。该体系的建立与多态性引物组合 的筛选 为 S A 5 R P标记 技术在辣椒 分子遗传
菰SRAP—PCR反应体系的优化与建立
4 3 0 0 7 4
2 中国科 学院武 汉植 物 园水 生植物 与 流域 生 态重点 实验 室 ,湖北 武 汉
摘 要 利 用 单 因 素 分 析 法 对 影 响菰 S R A P ~ P C R扩 增 效 果 的 Mg 2 + 、d N T P s 、
R E N Xu r u i 2 - , UU Ya n l i n g ,Y A N G Me i ,C H E N Y u a n y u a n , WA NG D o n g l i a n g , C HE N Y o u g e n
1 C o l l e g e o fHo r i i c u h u r e ,An h u i Ag r i c u h u r a l U n i v e r s i t y ,H e f e i , An h u i 2 3 0 0 3 6 ,C h i n a
热 带 作 物学 报 2 0 1 4 ,3 5 ( 2 ) :2 9 9 — 3 0 6
C h i n e s e J o u r n a l o f T r o p i c a 1 C r o p s
菰S R AP — P C R反应体 系的优化 与建立
任 绪瑞 1 , 2 ,刘 艳 玲 z ,杨 美 2 ,陈媛 媛 ,王 冬 良 , 陈友 根
等 研 究 提 供 技 术 支 持 关键词 菰 :S R A P :P C R 反 应 体 系 :优 化
S 5 1 1 . 9 文献标识码 A
中图 分 类 号
Op t i mi z a t i o n a n d E s t a b l i s h me n t o f S R A P — P C R i n Z i z a n i a l a t t f o l i a
太行菊SRAP-PCR反应体系的建立与优化
f m ti ss m eid iu f ps o a p s ahn e s Ln )S i,n i t u d t n r s yt i t i d a o ih p p u ia gni ig hh a dl d h f n ai o h e n h n v l O t T s( a eo o
S v r lsg i c n a a t r fS AP- CR r a t n s se a e su i d a d o t z d b p s o a — e e a in f a tp r me es o R i P e c i y tm r t d e n p i e y O i h p p o mi t
G AO Ya h i HU Gu n - o g, IZ i fn , WANG Yi l g - u ,Z a g ln J h - e g —i n
( o eeo i c n e h n i om l nvri , i e 4 0 4 hn ) C l g f f S i c ,S a x N r a U i sy Ln n0 1 0 ,C ia l Le e e t f A s a tS q e c —e t m l e o mop i ( R P s e l dv l e o clr akr b t c :e u ne rl e a pi dp l rhs S A )i an wy ee p dm l ua re. r ad i f y m o e m
f esbe u n sac n l i o gn t i r t i ps oa p s a a gni Ln )S i. o t u sq e t ee rhaay s f eei dv sy nO ih p p u i ne s rh r s c e i t T h s( ig hh
狗牙根SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选
缺点 , 已经在 许 多植 物研究 中得 到应 用 , 在 构 建 图谱 引、 传 多 样性 并 如 遗
以及 其他 方 面_ 1 阳的研 究 。
、 QTL定 位 、 种 优 势 的 预测 杂 ]
狗牙 根属 ( y o o p . 属禾 本科 ( a n a ) C n d ns p ) Grmiee 画眉 草亚科 ( rg o tie ) E a a sod e 虎尾 草 族 ( ho ioe e 多 年生 C lr i ) d a
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
的分子 标记 E ̄2 方面 已有 研究 报 道 。但有 关 S AP分 子标 记 在 草 坪 草 中 的应 用 , 在 野 牛 草 ( u h o a — e 3等 8 ] R 除 B c l ̄d c t li e ) y od s 中有 报 道外 圳 , 他类 型 的草 坪草 尚未 见报 道 。本研 究 首次 以坪 用 型狗牙 根 优 良品种 ( 源) 材料 , 其 种 为 利 用正交 设计 对 S AP反 应 体系进 行 优化 , 获得 最佳 扩增 效果 的基 础上 进 行 引 物 的筛选 并 对 狗牙 根 进行 了扩 R 在 增 , 为今后 S 将 RAP标记 在狗 牙 根遗 传多 样性 评价 、 同种 源 鉴定 、 传 图谱 构建 、 L定 位 、 不 遗 QT 比较基 因组 学 、 诱 变后代 的鉴 定及 亲缘关 系 分析 等方 面 的研究 提 供较 为可 靠 的技术 支持 。
王 志 勇 , 学 军 , 袁 刘建 秀 , 海林 郭
( . 京 农 业 大 学 园 艺 学 院 , 苏 南 京 20 9 ;. 1南 江 10 5 2 江苏 省 中 国科 学 院植 物研 究 所 , 苏 南 京 2 0 1 ) 江 1 0 4
红松SRAP-PCR反应体系的优化
Ampie oy rhs S A ) l d l i f P mop i m,R P 又叫基 于序 列扩增
多 态 性 ( eu n eB sdAmpie oy rhs S q ec ae l dP lmop i i f m,
用 S A 技术开展红松遗传多样性 、 RP 遗传图谱构建 、 重要性 状 QT L等理 论研 究和对 于红 松遗 传改 良、 种 质资源保 护 与利用 等应用研 究打下 良好基 础 。
关 键 词 : 松 ; R P P R; 应 体 系 红 S A —C 反
中图分 类号 :7 1 4 ¥ 9. 7 2
文献标识 码 : A
文章编 号 :0 11 1 (0 0 0 .0 60 10 .7 4 2 1 )60 0 .3
Op mi t n o t eS i t z i f h RAP P a o - CR a t n s se f n s o ae ss r c i tmso Piu r in i e o y k
F NG J n, NG Qi —h n , h-e, A L u l g, U S uc e g E i WA a cu YU S i Y NG He, I —n W h —h n a n h Xi i
(. i n g cdm o F r t S i c , h y n 0 3 , 1La i A a e y f o s y c ne S e ag 10 2 on er e s n 1 3F su C u t Wed o o s a , uhn13 1 . h a .u n on h y n a F r t r F su 1 1 C i ) eF m 3 n 2 F su C u t Q ad n o sF r ,uh nl 13 C i ; .uh n o n i i F r t a F su 3 0 , h a y na e m 1 n
油茶SRAP-PCR反应体系的建立和优化
Ab t a t F re tb ih t e S P P sr c o s l RA — CR e c in s s m o a l a oe 尼r , n t i e p r e t a p i z t n a s h r a t y t f rC me l l o e i a i s x e i n , n o t h m mi ai o
e pe i n t i g e fc o sg wh c n o v d i v a t r a x rme twih sn l a t rde i n, i h i v l e n f e fc o sofT q DNA olm e a e M g prme , NTP, i p y r s, , i r d a d DNA e n tmplt t e o c n r to e ese c , sc n uce o s r e h i e sbl o c n r to a e aewi t n c n e tai nsl v l a h wa o d t d t c e n t e rf a i ec n e tai n r ng . h
1 olg f oo iaS i cs n itcn lg , e igF rsyUnvri , e ig 10 8 ; olg f oet , o t hn gi l rl i l e Bilgcl c n e dBoeh oo y B in oet iesy B in , 0 0 3 2C l e F rs y S uhC iaA r ut aUn— C e o e a j r t j e o r cu
蓝莓SRAP-PCR反应体系的建立和优化及其遗传多样性分析
第 一作 者简 介 : 傅 冰( 1 9 8 2 一 ) , 男, 浙 江松 阳人 , 硕士 , 讲师 , 现 主 要
TGAGTCC AAAODG GAAG TGAGTCC AAA【 X : ( T AA TGAGTCC AAA( ) C I GGTCC TGAGT【 AAAOC GGTGC TGAGr r CC AAAC o[ TC A
收 稿 日期 : 2 0 1 3 一O 4 一o 9
9 5
・生物 技术ຫໍສະໝຸດ ・ 续表 1 北方 园 艺 2 0 1 3 ( 1 7 ) : 9 5 ~ 9 9
关键词 : 蓝莓 ; S RA P - P ( 、 R; 优化 ; 遗传多样性
中图分 类号 : S 6 6 3 . 9 文献标识码 : A 文章编号 : 1 0 0 1 -0 0 0 9 ( 2 0 1 3 ) 1 7 一O 0 9 5 一O 5 蓝莓( V a c c i n i u m s p p . ) 属杜鹃花科越桔属 ( V a c c i n i u m)
引物 O . 2/  ̄ mo l / L 、 DN A 4 0 n g 、 1 ×R e a c t i o n B u f f e r ; 9个 品 种 蓝 莓 的遗 传 相 似 性 系数 分 布 于
0 . 1 8 1 8  ̄1 . 0 0 0 0之 间, 平均遗传 相似 性 系数为 0 . 6 3 5 9 , 存 在较 高 的遗 传 多样 性 。基 于 UP G MA 的聚类分析 将供试材料 分成 4个类群 , 主坐标分析 同样将供试材料 分成 4个类群 , 二者结果一致 。
从 事 生物 化 学 与 分 子 生 物 学 等 研 究 工 作 。E - ma i 【 : 4 1 8 9 1 5 1 4 @
利用正交设计优化亚麻SRAP-PCR反应体系
经济作物研究所 实验室完成 。
试 验 试 剂 有 H S HC 、 D A 、 C 、 T B、 — 1E T Na 1C A
R ae A aoe苯 酚 、 N s、 g rs 、 氯仿 、 戊 醇 、 丙 醇 、 水 异 异 无 乙醇 、 脂 糖 、 酚 蓝 、 甲苯 青 、 乙 酸 、 C - 琼 溴 二 冰 P R b f r d T 、 a D A 聚 合 酶 、 NA Mak rE uf 、 N P T q N e D re、 B
1 材 料 与方 法
1 1 材 料 .
供 试 材 料 为 法 国 纤 维 亚 麻 品种 戴 安 娜 ( i D— ae , 系验 证 同时用 到油 用亚 麻 品种 宁亚 1 , n )体 7 材 料均 由黑龙江 省农 业科 学 院经济 作 物研究 所 亚麻 育种室提供 。选 取健壮幼苗 , 用保鲜 袋封存 后贮存 在 -8 ℃冰箱 备用 。试 验 在黑 龙 江省 农业 科 学 院 0
黑龙 江农 业科 学 2 1 ( ) 3  ̄ 3 0 2 3 :0 2 Heln j n r ut rl ce cs i gi g Agi lua S ine o a c
利用正交设 计优化 亚麻 S APP R反应体 系 R -C
吴 建 忠
( 黑龙江省农业科 学院 经济作 物研 究所 , 黑龙 江 哈 尔滨 10 8 ) 50 6
标记l 。但 目前 有 关亚 麻 S AP标 记 的建立 和应 6 ] R 用, 以及标准 化 的 、 高效 的 亚麻 S A R P反 应体 系及 其优化方法 的研 究较 少 。该 研究 采 用正 交试 验 设
计 根 据统计学原理 , 用正交设计 I 3 ) 采 ( 进行试
兰属SRAP-PCR反应体系的建立与优化
中图分 类号 :Q 4 —3 9 63
文献标识码 :A
文章编号 :1 0 -7 1 0 20 —0 1 4 0 97 9 ( 1)30 2 - 2 0
Wi l e rtc n mii a o , h n h n 0 8 G a g o gC n ) l i oe t g d fP i Ad ns f n S e z e 1 4 , u n d n h a vi 5 8 i
A s r c : T ba la e u n erl e mpie o mop i (RA ) f g rr t o btat o o t n c r S q e c — a d a l d p l rhs S P i e i s f i e et i f y m n pn
c ce ea n ai g tmp r tr s n r a e 5 ℃ . t n l n a o t po i t 2 ℃ . y ls h e l t n n e e au ewa c e s dt 5 i o wi af a eo g f nse f r n a h il i 5a 7
mi u e c n it d o 2 mmo /t o g xtr o sse f 2. l ̄L f M ,0 8 mm o / ofd . lL NTPs 5 g ofg n mi ,1 0 n e o c DNA,15 .
p l f r ra d 2 nto a oy rs. a lsweesbetd t tema po l o mo L o i . u i fT qp lmeae S mpe r ujc o h r l rfefr / p me n 0 e i
小干松SRAP—PCR反应体系的建立
摘
要: 以 小干 松 针 叶 基 因组 D NA 为模 板 , 采用 L 。 ( 4 ) 正 交 实验 设 计 , 对S R A P — P C R反 应
体 系中的 T a q酶 、 Me 、 d NT P s 、 模板 D N A和 引物 5个 因素在 4个水平上进行优化 。结果表 明 :
以及其 它科学研究奠定基础 。
1 材 料与 方法
1 . 1 试验材 料 2 0 1 1 年在 辽宁省灯 塔市铧 子林场采集 小干松 当年
2 结 果与分 析
2 . 1 S R AP - P C R扩增效果及评分 小干松 s R A P — P C R反 应体 系扩增 结果 见 图 1 。依 处理次序得 到的 2 次分数分别 记为 : 4 、 4 、 6 、 5 、 6 、 8 、 4 、 1 6 、
要 求。
关键 词 : 小干松 ; S R A P ; 反应体 系
中图分 类号 : S 7 9 1 . 2 5 6 文献标识码 : A 文章编号 : 1 0 0 1 -0 0 0 9 ( 2 0 1 3 ) O 2 一O 0 8 3 一O 4
小干松 ( P i n u s c o n t o r t a ) 属松科松属植物 , 为二针松 , 又名扭松 、 北 美 黑松 。原 产地 为北 美 , 水平 分 布在 北纬
性好 的特点 , 已被广 泛应 用在遗 传 多样性 分 析 、 遗传 图 谱构建 和 基 因定 位 、 基 因分 离 、 品种 鉴定 等 研 究工 作 。
多种植 物的 S R A P - P C R反应体 系已经 建立 , 但 在小于松 中鲜见 报道 。该研究 旨在建立 小 干松的 S R A P — P C R反
石榴 SRAP-PCR反应体系的正交设计优化及验证
Op t i mi z a t i o n o f S PAR- PCR S y s t e m i n Po me g r a n a t e Us i n g
I S S N 1 0 0 4—3 9 0 X;C OD EN YNDXA X
E— ma i l :x b @y n a u . e d u . c n
D O I :1 0 . 3 9 6 9 / j . i s s n . 1 0 0 4— 3 9 0 X ( n ). 2 0 1 3 . 0 3 . 0 1 6
2 .Wo r k S t a t i o n o f E c o n i m i c C r o p s ,A g r i c u l t u r a l B u r e a u o f T o n g h a i C o u n t y , T o n g h a i 6 5 2 7 0 0, C h i n a )
me ns i o n s o r t h o g o n a l d e s i g n t o o p t i mi z e t h e T a q DNA Po l y me r a s e, Mg “ ,d NTPs ,p ime r r s,t e mp l a t e DNA.De t e r mi n i n g t h e b e s t s y s t e m wa s: d NTP 0. 1 2 mmo l /L,Mg “ 2 . 0 mmo l /L,p r i me r 0. 48 p  ̄ mo l / L,T a q e n z y me 1 . 0 u,t e mp l a t e DNA 4 0 n g a n d t h e t o t a l r e a c t i o n v o l ume wa s 2 5 L T h e o p t i mi z e d
亚麻SRAP-PCR反应体系的优化建立及多态性标记筛选
d NTP s , p r i me r a n d Ta q p o l y me r a s e )a t 3 l e v e l s p l u s t h e c o n c e n t r a t i o n o f t e mp l a t e DNA. Th e o p t i mi z e d
HAO Ro n g — k a i , Z HANG J i a n - p i n g , D ANG Z h a n — h a i 。 , Z HAO L i 。 , L I We n - j u a n 。
( 1 . C o l l e g e o f Ag r o n o my, Ga n s u Ag r i c u l t u r a l Un i v e r s i t y , L a n z h o u 7 3 0 0 7 0 , C h i n a ; 2 I n s t i t u t e o f Cr o p S c i e n c e , Ga n s u Ac a d e my o f Ag r i c u l t u r a l ci S e n c e s , La n z h o u 7 3 0 0 7 0。 Ch i n a )
l u t i o n . Ea c h f a c t o r h a d d i f f e r e n t e f f e c t s o n t h e r e s u l t s o f P CR. Mg +c o n c e n t r a t i o n h a d t h e g r e a t e s t e f f e c t s a n d Ta q DNA p o l y me r a s e h a d t h e l e a s t e f f e c t s . Th e o p t i mi z e d S RAP - P CR s y s t e m wa s t e s t e d o n f i f t e e n f l a x g e r mp l a s ms a n d s h o wn t o b e s t e a d y a n d r e l i a b l e . 2 1 p r i me r c o mb i n a t i o n s we r e s e l e c t e d wi t h a b u n d a n t p o l y — mo r p h i s m f r o m 1 6 9 p r i me r c o mb i n a t i o n s .
SRAP-PCR体系
组分Component用量(µL)volume(µL)10×PCR buffer 2.5MgCl2 (25mM) 3.0dNTP(10mM each) 0.5rTaq DNA Polymerase (5U/µL) 0.2Upstream primer(10µM) 0.5Downstream primer(10µM) 0.5DNA Template(20ng/µL) 2.0dd-H2O 15.8Final volume 25.0反应扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,35℃退火1min,72℃延伸1min,5个循环;94℃变性1min,50℃退火1min,72℃延伸1min,35个循环,最后72℃延伸10min。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分析SRAP扩增产物在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离,显影步骤参照陈明亮等(2007)[207]的方法略有改动。
具体如下:电泳分析采用20cm×20cm的竖直板电泳槽进行。
电泳液为1×TBE。
电泳参数:恒压280V,约2.5h。
SRAP扩增产物上样量4.0µL,分子量marker上样量:1.0µL。
电泳完毕,剥胶,进行银染分析,具体操作如下:(1). 将凝胶于250mL固定液(10%乙醇,0.5%冰乙酸)中固定15min;(固定液可重复利用数次,每次固定之前再加20mL左右5×固定液)(2). 在0.2 % 的硝酸银渗透液中渗透30s;(银染液可重复利用,新配的可染时间短些,用过几次后染色时间根据情况相应延长)(3). 蒸馏水漂洗30s;(4). 在显色液(1.5%NaOH,0.4%甲醛)中显色至条带清晰;(5). 自来水冲洗照相,以做分析。
(用保鲜膜封起来,4℃可保存数月)2.2.2.7 差异片段的聚丙烯酰胺凝胶回收与再扩增(1)特异片段的分离和二次扩增用干净的刀片将特异片段从聚丙烯酰胺凝胶上切下置于离心管中,灭菌双蒸水洗3遍后,加100µL 10×PCR buffer于50℃下温浴30min,-20℃过夜。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
组分Component
用量(µL)volume(µL)
10×PCR buffer 2.5
MgCl2 (25mM) 3.0
dNTP(10mM each) 0.5
rTaq DNA Polymerase (5U/µL) 0.2
Upstream primer(10µM) 0.5
Downstream primer(10µM) 0.5
DNA Template(20ng/µL) 2.0
dd-H2O 15.8
Final volume 25.0
反应扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,35℃退火1min,72℃延伸1min,5个循环;94℃变性1min,50℃退火1min,72℃延伸1min,35个循环,最后72℃延伸10min。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
SRAP扩增产物在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离,显影步骤参照陈明亮等(2007)[207]的方法略有改动。
具体如下:
电泳分析采用20cm×20cm的竖直板电泳槽进行。
电泳液为1×TBE。
电泳参数:恒压280V,约2.5h。
SRAP扩增产物上样量4.0µL,分子量marker上样量:1.0µL。
电泳完毕,剥胶,进行银染分析,具体操作如下:
(1). 将凝胶于250mL固定液(10%乙醇,0.5%冰乙酸)中固定15min;(固定液可重复利用数次,每次固定之前再加20mL左右5×固定液)
(2). 在0.2 % 的硝酸银渗透液中渗透30s;(银染液可重复利用,新配的可染时间短些,用过几次后染色时间根据情况相应延长)
(3). 蒸馏水漂洗30s;
(4). 在显色液(1.5%NaOH,0.4%甲醛)中显色至条带清晰;
(5). 自来水冲洗照相,以做分析。
(用保鲜膜封起来,4℃可保存数月)2.2.2.7 差异片段的聚丙烯酰胺凝胶回收与再扩增
(1)特异片段的分离和二次扩增
用干净的刀片将特异片段从聚丙烯酰胺凝胶上切下置于离心管中,灭菌双蒸水洗3遍后,加100µL 10×PCR buffer于50℃下温浴30min,-20℃过夜。
沸水
浴20min,然后稍离心,上清转入新离心管,加入等体积预冷的异丙醇,-20℃沉淀30min。
4℃,12000 r/min离心20min,用75%乙醇洗沉淀,将沉淀风干5~10min,最后溶于20µL灭菌双蒸水,用作模板,用与上述PCR相同的引物及体系再次进行扩增。
为了增加回收产物的量,可将原反应体系依比例扩大二倍。
扩增程序为94℃2min;94℃30s,50℃30s,72℃60s,共35个循环;72℃10min。
(2)目的片段的回收和纯化
将二次扩增的产物用1.0%琼脂糖凝胶分离,在紫外灯下切下目的片段,用纯化试剂盒(上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒)纯化。
回收和纯化的程序具体如下:
A. 切取含目的DNA片段的凝胶薄片,按400µL/100mg琼脂糖凝胶的比例加
入Binding Buffer II,置于55ºC水浴约15min直至凝胶完全熔化,期间每两分钟混匀一次;
B. 将融化的胶溶液转移到套置在2mL收集管内的UNIQ-10柱中,室温放置2
分钟,6000r/min室温离心1min;(对于小于500bp的DNA片段,强烈建议将离心下来的液体重新加入原UNIQ-10柱中,6000r/min离心1min)C. 取下UNIQ-10柱,倒掉收集管中的废液,将UNIQ-10柱放入同一个收集管
中,加入500µL Wash Solution,8000r/min室温离心1min;
D. 重复步骤C一次;
E. 取下UNIQ-10柱,倒掉收集管中的废液,将UNIQ-10柱放入同一个收集管
中,12000r/min室温离心2min;
F. UNIQ-10柱放入一根新的1.5mL离心管中,在柱子膜中央加40uL Elution
Buffer或水(PH>7.0),室温或37ºC放置2min;(提高洗脱温度到55~80ºC 有利于提高DNA的洗脱效率)
G. 12000r/min室温离心1min,离心管中的液体即为回收的DNA片段。
可立即
使用或保存于-20ºC备用。