农药生物测定实验指导

农药生物测定实验指导（研究生）

实验一培养基的制作、灭菌和病原菌的接种、培养

一、实验目的：

1、熟悉并掌握微生物用培养基的制作及灭菌的原理及使用；

2、熟悉并掌握微生物的接种、培养及保存方法。

二、实验原理：

培养基是供微生物生长的基物，分液体和固体两种。按成分又可分为天然培养基、半组合培养基和组合培养基。培养真菌所用的培养基一般用马铃薯培养基，它是半组合培养基，制作比较简单，且能够完全满足微生物的营养要求。

灭菌是杀死所有微生物，保证培养基不被杂菌污染的重要手段之一。灭菌的方法有四种：热力灭菌、过滤灭菌、化学灭菌和物理灭菌。热力灭菌在微生物灭菌中占主要地位，分干热灭菌和湿热灭菌。干热灭菌是利用热空气来灭菌，将玻璃器皿等放入烘箱中加热，一般用160-170℃处理1小时或150℃处理2小时，适用于经高温处理不易损坏的干燥物质。湿热灭菌，即高压蒸汽灭菌，是将灭菌物放入灭菌锅内，维持一定的蒸汽压力，一般为1公斤/cm2左右（相当于121℃），维持半小时，以确保杀死所有微生物，适用于高温高压下不易分解变质的物质和玻璃器皿。湿热灭菌比干热灭菌效率高。

病原菌接种培养是杀菌剂毒力测定经常进行的工作之一，因培养基性状不同，可采用不同的接种方法。本实验是练习在固体培养基上接种。固体培养基的接种方法分倾注和斜面两种接种方法。

接种后的菌种，必须放在适温下培养，在培养期间注意观察菌种的生长情况和有无杂菌污染，温度要保持恒温，培养成熟的菌种必须很好地保存。

三．主要仪器及试材：

1、实验器皿：培养皿、容量瓶、移液管、无菌水、PDA培养基[注：以上器皿须经灭菌。]

2、实验仪器：超净工作台、灭菌锅、培养箱、打孔器、酒精灯等。

四．实验方法与步骤：

（一）、培养基的制作：

1、培养基的组成（PDA）：

去皮马铃薯块200克葡萄糖（或蔗糖）10-20克

琼脂17-20克水1000ml

2、步骤：

（1）、在大烧杯中加入1000ml的水，作上标记；

（2）、称取去皮马铃薯200克，切成小块，放入盛有水的烧杯中，煮沸30分钟左右，将薯块捞出，留下汁液；

（3）、称取17-20克琼脂（事先用水浸泡），加入烧杯中，煮溶后，称取葡萄糖（或蔗糖）10-20克，加入汁液中溶解。

（4）、加水至标记处，趁热用双层纱布过滤；

（5）、将制好的培养基在未凝固前及时分装。

（二）、湿热灭菌：

1、在灭菌锅内加入去离子水到指定高度；

2、将须灭菌的物品放入灭菌锅内，将盖封闭加热；

3、当气压表指到0.3/ cm2时，排出锅内空气；

4、当气压升到所须压力（1公斤/ cm2，温度121℃）时，维持压力半小时；

5、灭菌完毕，缓慢放气；

6、取出锅内培养基，试管作成斜面，以备接种用。

（三）、病原菌接种和培养：

1、试管斜面接种，用左手握好装有斜面培养基的试管和菌种试管的底部，右手拔出棉塞，

靠近酒精灯火焰，将接种针在酒精灯焰上灼烧后，直接挑取少量菌丝和孢子或连同带菌的培养基小块，放入斜面培养基试管内，轻轻涂抹在斜面上。并在试管上注明菌种名称、接种日期、组名。

五．实验注意事项：

1、注意灭菌操作的方法和灭菌锅的使用方法。

2、病原菌的接种实验要注意无菌操作，整个实验操作过程在无菌操作台上完成。

六．实验结果处理：

将接种后的菌种，放在适温下（28℃培养箱中）培养。并在培养期间注意观察菌种的生长情况和有无杂菌污染。

七．思考题：

1、常用的灭菌方法有哪些？

实验二杀虫剂精密毒力测定——微量点滴法

一．实验目的：

1、学习和掌握触杀毒力精密测定技术—微量点滴法。

2、学习农药生物测定数据的处理方法—绘图法，最小二乘法和机率值分析法，求出致死中量（LD50）和致死中浓度（LC50）。

3、明确杀虫剂杀虫毒力表示方法的意义和应用。

二．实验原理：

在进行农药杀虫作用方式的实验后，了解某些化合物具有触杀作用的基础上，为了明确其触杀强度以及比较几种药剂的触杀毒力大小时，需采用精密触杀毒力测定技术来求出它的致死中量（或致死中浓度）。目前许多有机合成杀虫剂大多数都具有触杀作用，因而触杀毒力测定具有一定的重要性，测定方法虽然很多，但基本上可分为两大类：一是全部施药法：如定量喷粉法、定量喷雾法和用一定浓度药液浸渍法等。其优点是操作方便，比较符合实际施药情况。但药剂容易被试虫吞食产生胃毒作用。二是局部施药法：是目前比较精确的触杀毒力测定方法。一般包括药膜法和微量点滴法。微量点滴法是将一定浓度和容积的药液点滴在试虫体的一定部位，溶剂挥发后，药剂即可自体壁进入体内发挥触杀作用，药剂不致被试虫吞食。本实验采用微量点滴法来测定农药的触杀毒力作用。

三．主要仪器及试材：

1、试虫：棉铃虫（3龄）

2、药剂：氯氰菊酯等

3、实验仪器及用具：养虫室、毛细管点滴器、分析天平、滤纸、通针、培养皿（5cm）、容量瓶、具塞小试管及试管架、镊子、移液管、丙酮等。

四．实验方法与步骤：

（一）试验前的准备工作

1、试虫的移取：

选取3龄棉铃虫，大小均匀一致的个体，放在垫有吸水纸的培养皿内，每皿10头，为一个处理。每个处理重复三次，分别在分析天平上称重，求出平均体重，备用。

2、称药配药：

将试药小心地移入洗净干燥的称量瓶中，在分析天平上准确称取一定量试药，放入小烧杯内，加少量丙酮溶解，再移入容量瓶中，加丙酮定容。摇匀即为母液，备用。

3、毛细管点滴器的质量检定：

检查毛细管微量点滴器是否通畅，并练习使用。

（二）预备试验

为了确定合适的施药浓度（或剂量）（要求试虫死亡率分布在20-80%范围内），在正式试验前，必须先用几个浓度或剂量（范围较大）进行试点滴，根据死亡结果，确定最合适的点滴浓度，预备试验所用试虫可以减少一半左右。

（三）正式试验步骤

1、药液的配制：

根据预备试验结果，将容量瓶中的母液按等比级数用丙酮稀释成5个浓度，如1.6、0.8、0.4、0.2、0.1μg/μl等。每浓度5ml，装入具塞小试管。并以丙酮为对照。