基因敲除技术研究新进展2011

基因敲除技术研究新进展

黄薇,严放北京大学医学部心血管研究所

gene knockout）技术是20世纪80年代发展起来的一门新技术。应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚em cells，ES cells）以取代目的基因，再筛选出已靶向灭活的细胞，微注射入小鼠囊胚。该细胞参与胚胎发育形成可得到纯合基因敲除小鼠。基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明，使现代生物学进展。基于基因敲除技术对医学生物学研究做出的重大贡献，在该领域取得重大进展的三位科学家，70岁的美国人chi）、82岁的美国人奥利弗•史密西斯（Oliver Smithies）和66岁的英国人马丁•埃文斯（Martin Evans）分享了2

80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。关于第二代区域和组织于1993年。Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除oxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。

imizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统re的表达。该技术使目的基因的敲除在时间上可人为控制，避免了死胎或动物出生后不久即死亡等现象的出现。

实验室Cui[3]等又报道了第四代基因工程技术，即可诱导的区域性蛋白质敲除技术，用这一技术构建的模式动物可在定蛋白质的功能，从根本上改变了前三代基因敲除技术对蛋白质代谢速度的内在依赖性，达到空前的时间精度，成组研究最先进的工具之一。

以来上述基因敲除技术只能在小鼠上完成，因为只有小鼠的ES细胞能在体外培养中无限增殖并同时保持多分化潜能以及猴等大动物模型在疾病研究中更接近于人类，大动物更有益于某些繁琐的手术操作，同时血浆及组织样本量较大家介绍近两年来基因敲除技术在大动物模型上的突破及进展。

一、大鼠ES细胞基因打靶技术

，大鼠的生理和药理特性与人类更相近，是研究人类疾病的一种重要动物模型，在心血管疾病和糖尿病等领域的作S细胞在体外难以长期维持自我更新，用传统培养方法无法获得具有生殖传代能力的大鼠ES细胞[5]。因此在过去二物模型远不及小鼠发展迅速。2010年Tong等[6]于《Nature》报道了p53基因敲除大鼠，这在基因敲除技术上又是

，1D）。其中体外成功培养大鼠ES细胞是基因敲除大鼠模型建立的关键。

ng等[7]于《Nature》报道，在ES细胞的获取、增殖和多能化过程中并不需要添加外源性刺激。消除MAPK通路的自我更新能力，在此基础上抑制GSK3可增强ES细胞的生物合成，抑制其继续分化。Ying等认为ES细胞的固有状信号的作用下才进行分化。

室Li等[6]于《Cell》报道，在GSK3、MEK和FGFR酪氨酸激酶受到特异性抑制的条件下，可获取大鼠ES细胞并细胞具有多能性，将经过基因操作的ES细胞移植入早期胚胎中可获得嵌合体并通过生殖细胞遗传。其使用的两种培清的N2B27培养基和小分子化学物质：3i含有CHIR99021（抑制GSK3）、PD184352（抑制MAPK）和SU540而2i除含有CHIR99021外还含有能同时抑制MAPK和FGFR的PD0325901（图1A）。这两种培养基通过抑制诱FGF/MAPK/ERK）使其持续处于自我更新状态，从而获得功能完备的大鼠ES细胞系[8,9,10]。前文所述p53基因敲因打靶技术得到的p53敲除的ES细胞，这一模型的建立对于癌症机理和信号网络的研究具有重大意义。

胞系的成功建立使大鼠的遗传学操作成为可能，是生物医学领域一项革命性的进展。参照该方法可能在未来的研究胞系，为人类疾病的研究提供新的动物模型。

二、锌指核酸酶技术在基因敲除大鼠和猪中的应用

（Zinc Finger Nuclease，ZFN）是一种由锌指蛋白和FokI核酸内切酶的剪切结构域重组形成的嵌合蛋白，其中锌kI核酸内切酶则负责对DNA序列进行非特异性剪切。当两个ZFN分别结合到位于DNA的两条链上间隔5至7个碱进而激活FokI核酸内切酶的剪切结构域，使DNA在特定位点产生双链断裂，再通过非同源末端连接或同源重组修对靶基因进行定点断裂，显著提高同源重组效率，是一种高效的新型基因打靶技术，已应用于果蝇[12]、斑马鱼[13]、芥[15]等多种动植物的基因靶向敲除。

eurts等[16]于《Science》报道了利用ZFN技术获得的基因敲除大鼠，这是该技术首次成功地在哺乳动物胚胎中进行

ZFN，分别以外源基因GFP、内源基因IgM和Rab38为靶点，将编码ZFN的DNA或mRNA通过原核注射或胞，从而获得了敲除特定基因的转基因大鼠（图2B），而且这一基因操作的结果可稳定遗传。这一成果对哺乳动物转有里程碑式的意义。2010年Mashimo等[17]将编码特定ZFN的mRNA原核注射至大鼠受精卵中，敲除了IL-2受体锁重症联合免疫缺陷（X-SCID）大鼠，为评估药物治疗和基因治疗的效果提供了新的动物模型。

ZFN技术在其他哺乳动物身上也得到了成功应用。2010年Carbery等[18]采用ZFN技术成功地敲除了小鼠的Mdr1a 1年Whyte[19]等利用ZFN技术在带有增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因的转基因猪的成纤维细胞中敲除eGFP基，成功建立了大动物基因敲除模型。

的优势在于仅通过向受精卵内注射ZFN表达载体或mRNA就可获得基因敲除动物，可在短时间内高效地建立起新的核移植技术等传统方法相比，ZFN具有效率高、操作简单、应用范围广等优势。这一技术不仅在生物医学研究中应引入外源序列而在临床医学和农业等领域受到了重视。

除小鼠模型建立的时间在80年代约需2-3年时间，现在半年时间就能得到嵌合型小鼠。同时小鼠基因敲除模型也由区域可控性的敲除。本篇报道的大动物基因敲除模型的建立，是生物医学领域又一项革命性的进展。将来对时间和，猪以及和人类更为接近的猴的研究，将会成为遗传工程中的另一重大飞跃，对疾病的分子机理研究和疾病的基因