基因工程知识点
基因工程知识点总结
基因工程总结一．概念(1)原理：。
(2)优点：与杂交育种相比，；与诱变育种相比，。
（3）基因工程成功的原因：①成功拼接的原因：②成功表达的原因：二．基本工具1、两种酶：(1)：作用特点：。
(2)：E ·coli DNA 连接酶与T 4 DNA 连接酶的区别：2、一种运载体（1）条件：①；②；③具有特殊的标记基因（作用：）（2）种类：最常用；其他动植物病毒、三、操作程序(1)：方法：①：不知道脱氧核苷酸序列②：已知目的基因两端一小段序列，便于③利用化学方法人工合成：知道全部序列，且基因比较小。
这种方法不需要模板。
(2)——基因工程的核心基因表达载体的组成：(3)生物种类常用方法受体细胞将目的基因插入到Ti 植物动物受精卵将含有目的基因的表＋微生物原核细胞Ca 2处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA 分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA 分子质粒的T-DNA 上→农达载体提纯→取卵转化过程杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得色体的DNA 上→表达具有新性状的动物(4)①目的基因是否插入到转基因生物的染色体DNA 上：②是否转录：③是否翻译：④个体水平鉴定：抗虫、抗病接种实验易错点说明：1、切割目的基因和运载体的要求：用限制酶。
目的是：。
同种的含义是：同一种或相同两种，即单酶切或双酶切。
选择双酶切的原因是。
2、工具≠工具酶；运载体≠质粒。
3、启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
启动子：。
终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，位于基因的尾端，作用是使转录过程停止。
4、基因探针的要求：①单链②有③5、农杆菌转化法中的“2”次导入：第一次：将含有目的基因的T—DNA的质粒导入农杆菌；第二次（非人工操作）：将含有目的基因的T—DNA导入受体细胞并整合到植物细胞的染色体DNA上。
6、转化：。
基因工程知识点总结归纳(更新版)
基因工程绪论1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。
作动词：基因的分离和重组的过程。
2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。
供体、受体和载体是基因工程的三大要素。
3、基因工程诞生的基础三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。
以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。
三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。
2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。
5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。
6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。
7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。
8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。
9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
10、RNAH降解与DNA杂交的RNA，用于cDNA文库建立时除去RNA以进行第二链的合成。
基因工程知识点
名词说明1.基因工程：是将目的基因或DNA片段与适合的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因和蛋白质的活性表达，使转基因生物取得新的遗传性状的操作。
2.限制性内切核酸酶：能够识别双链DNA分子中的某一段特定核苷酸序列，并在此切割DNA 双链的内切核酸酶。
3.同切点酶：又称同裂酶，是一类来源于不同微生物、能识别相同DNA序列的限制性内切核酸酶。
4.同尾酶：是一类限制性内切核酸酶，它们来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同的黏性结尾。
5.酶的星号活性（Star activity）：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的酶的星号活性现象。
连接酶：是能催化双链DNA片段靠在一路的3’羟基结尾与5’端磷酸基团结尾之间通过形成磷酸二酯键，使两结尾连接的一种核酸酶。
7.载体：在基因克隆中能携带外源基因进入受体细胞复制、整合或表达的工具称为载体。
8.多克隆位点：是包括多种同一个限制性酶切点的一段很短的9. α互补：为质粒DNA编码β—半乳糖苷酶的α亚基，宿主细胞可编码β亚基尽管宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们能够融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫α互补。
10.黏粒载体（考斯质粒载体）：是一类人工构建的含有λ-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。
11.质粒：是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳固遗传的一类核酸分子12.探针：当用一个标记的核酸分子与核酸样品杂交,即可查明该样品中是不是存在与该标记核酸分子具有同源性的核酸分子。
那个标记的核酸分子称为探针(probe)，能够是DNA，也能够是RNA，或合成的寡核苷酸.13、SD序列：是存在于原核生物起始密码子上游7-12个核苷酸内的一种4-7个核苷酸的保守片段，它与16SrRNA3’端反向互补，因此可将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译作用。
基因工程复习知识点
基因工程复习资料一、知识点1.根据基因工程的定义，能替代基因工程的术语。
2. 含有II型限制性内切酶切位点的DNA 片段的特点。
3.已知一双链DNA分子，分别用限制酶Ⅰ、限制酶Ⅱ切割单独切割得到不同片段；同时用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割时，得到另外的片段，据此分析该双链DNA分子结构及酶切位点情况。
4．质粒分子生物学的描述。
5．在植物基因工程中广泛使用的载体。
6．质粒带有α互补的 lacZ'标记基因，那筛选培养基中加入显色底物和诱导物分别为？7．载体常用的选择性标记：抗生素、生化标记、营养缺陷型标记的包括哪些（要能区分缩写符号）。
8．DNA双链是靠什么化学键维持？9．能有效区分重组子与非重组子的是方法有哪些？10．离体cDNA 合成中所涉及的工具酶是有哪些？11．强化基因转录的元件是哪些？12．基因调控元件中属于负调控顺式作用元件的是哪些？13．关于包涵体的叙述。
14. 在单子叶、双子叶植物及动物的遗传转化过程中，应用最成功的间接转化法分别是什么15. 在对转基因植物进行分子鉴定时，检测外源基因的整合、表达、转录，分别可以采用哪些方法？16．细菌存在限制-修饰的现象，其生理意义是什么？17．Taq DNA 聚合酶的发现使得 PCR 技术的广泛运用成为可能，是利用其哪个特点？18．关于柯斯质粒（cosmid）描述。
19．Cosmid、 -DNA 、 Plasmid几种常用载体的装载量大小比较20．载体质粒 pBR322上的两个选择性标记： Ap r、 Tc r。
它们分别含有一个单一酶切位点： Pst I 、 Sph I。
若将一外源基因插入Ap r中的Pst I位点，那么转化子和重组子如何筛选，若插入Sph I又如何筛选？21．DNA-DNA,DNA-RNA分子杂交的化学原理是什么（靠什么维持其双链稳定性）？22．cDNA 法获得目的基因的特点表现为？23．原核生物启动子的特征是有哪些？24．强化 mRNA 翻译的元件是哪些？25．高等哺乳类动物基因在大肠杆菌中高效表达时，包涵体形成的原因是？26.动物基因转移法中的胚胎干细胞法有何特点？（）27. 如何正确理解基因漂移？28.熟悉pBR322、pUC18/19载体的组成元件及作用、简写所代表的含义。
基因工程知识点
基因工程各章知识点第一章绪论1．基因工程的首例操作实验三大理论基础：DNA是遗传物质、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码的破译和遗传物质传递方式的确定三大技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的发现与DNA片段的连接、基因工程载体的研究与应用基因工程的诞生：72年，P.Berg首次实现体外DNA重组：体外用EcoRI分别切割SV40和λDNA,并用T4 DNA连接酶连接成为重组的杂种DNA分子73年，S.Cohen 体外重组DNA并转化：具Kanr的E.Coli质粒R6－5和具Tetr的E.Coli质粒pSC101切割并连接转化的大肠杆菌具有双重抗性S.Cohen 和H.Boyer首次实现真核基因在原核中表达：将非洲爪蟾的DNA与E.Coli质粒（pSC101）体外切割并连接，转化大肠杆菌2．基因工程的基本概念基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种新物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或具有新性状的DNA体外操作技术，也称为分子克隆或重组DNA 技术。
供体、载体、受体是基因工程的三大基本元件。
3．基因工程的基本操作过程a分离目的DNA片段：酶切、PCR扩增、化学合成等。
b重组：体外连接的DNA和载体DNA，形成重组DNA分子。
c转化：将重组DNA分子导入受体细胞并与之一起增殖。
d筛选：鉴定出获得了重组DNA分子的受体细胞。
e对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。
第二章载体1．理解用PBR322和PUC18作载体的克隆外源基因的原理。
答案不确定PBR322作载体的克隆外源基因的原理:PBR322质粒具有12 种限制性内切酶的单一识别位点：T et r 基因内有7个酶切位点：Bam HⅠ，SalⅠ：Amp r基因内有3 个酶切位点：PstⅠ。
Eco RⅠ和HindⅢ不在抗生素基因内，不导致插入失活。
高中生物 基因工程知识点
专题1 基因工程（一）基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。
原理是基因重组，操作水平是分子水平。
优点：打破物种界限；定向地改造生物的遗传性状。
（二）基因工程的基本工具1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）（1）主要从原核生物中分离纯化出来。
（2）功能：使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开（3）特点具有专一（特异）性。
（4）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2.“分子缝合针”——DNA连接酶（1）两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端；而T4-DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
（2）与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的脱氧核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。
DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
3.“分子运输车”——载体（1）载体具备的条件：①能够稳定保存并复制；②有一至多个限制酶酶切位点③含有标记基因，便于筛选。
④对受体细胞无害。
（2）最常用的载体是质粒，化学本质是小型环状DNA分子。
（3）其它载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒（三）基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取1.目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以指具有调控作用的因子。
2. 基因文库包括基因组文库和cDNA文库。
二者的区别：3.人工合成目的基因的两个条件：基因比较小；核苷酸序列已知。
4.PCR技术扩增目的基因（1）PCR是多聚酶链式反应的缩写，原理DNA双链复制。
（2）过程：第一步变性：加热至90～95℃，DNA解链，不需要解旋酶；第二步复性：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链。
变性和复性利用了DNA的热变性原理；第三步延伸：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
基因工程知识点全
第一章基因工程概述1.什么是基因工程,基因工程的基本流程基因工程Genetic engineering原称遗传工程;从狭义上讲,基因工程是指将一种或多种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体受体内,使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状;因此,供体、受体和载体称为基因工程的三大要素;1.分离目的基因2.限制酶切目的基因与载体3.目的基因和载体DNA在体外连接4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养5.选择、筛选含目的基因的克隆6.培养、观察目的基因的表达第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件➢具有对受体细胞的可转移性或亲和性;➢具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点;➢具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点;➢具有合适的筛选标记;➢分子量小,拷贝数多;➢具有安全性;2. 质粒载体有什么特征,有哪些主要类型1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒3. 质粒的构建1删除不必要的 DNA 区域,尽量缩小质粒的分子量,以提高外源 DNA 片段的装载量;一般来说,大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞,而且极不稳定;2灭活某些质粒的编码基因,如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因,杜绝重组质粒扩散污染环境,保证 DNA 重组实验的安全,同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因,提高质粒的拷贝数3加入易于识别的选择标记基因,最好是双重或多重标记,便于检测含有重组质粒的受体细胞;4在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列,即多克隆接头Polylinker,便于多种外源基因的重组,同时删除重复的酶切位点,使其单一化,以便环状质粒分子经酶处理后,只在一处断裂,保证外源基因的准确插入;5根据外源基因克隆的不同要求,分别加装特殊的基因表达调控元件;4. 什么是人工染色体载体将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起,即可构成染色体载体5. 什么是穿梭载体人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体;6.入-噬菌体载体及构建-DNA为线状双链DNA分子,长度为,在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端;➢1缩短长度提高外源 DNA 片段的有效装载量删除重复的酶切位点➢引入单一的多酶切位点接头序列,增加外源DNA片段克隆的可操作性➢灭活某些与裂解周期有关基因;➢使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌,以避免可能出现的污染现象的发生;➢加装选择标记,便于重组体的检测单链噬菌体DNA载体➢过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口;➢引入合适的选择性标记基因,如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列lacZ’的乳糖操纵子片段lac、组氨酸操纵子片段his以及抗生素抗性基因等;➢将人工合成的多克隆位点接头片段插在 lacZ’标记基因内部,使得含有重组子的噬菌斑呈白色,而只含有载体 DNA 的混浊噬菌斑呈蓝色;➢4在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的 DNA 测序引物序列,使得重组 DNA 分子的单链形式经分离纯化后,可直接进行测序反应;8. II类限制性内切核酸酶的特点限制性核酸内切酶 Restriction endonucleases是一类能在特异位点上催化双链DNA 分子的断裂,产生相应的限制性片段的核酸水解酶;➢识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点,通常是由4、5或6核苷酸组成的特定序列靶序列;➢识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构,即双链的核苷酸顺序呈回文结构;➢切割位点的规范性：双链DNA被酶切后,分布在两条链上的切割位点旋转对称可形成粘性末端或平末端的DNA分子;同位酶：一部分酶识别相同的序列,但切点不同,这些酶称为同位酶;同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶同尾酶Isocandamers：识别位点不同,但切出的 DNA 片段具有相同的末端序列,这些酶称为同尾酶;9.甲基化酶Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴,甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同,并在识别序列内使某位碱基甲基化,从而封闭该酶切口;甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时,却产生出另一种酶的切口➢甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列,从而使DNA免受相应的限制性核酸内切酶的切割;➢甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点;连接酶连接作用的特点:①DNA连接酶需要一条DNA链的3’末端有一个游离的羟基-OH,另一条DNA链的5’末端有一个磷酸基-P的情况下,只有在这种情况下,才能发挥连接DNA分子的作用;②只有当3’－OH和5’－P彼此相邻,并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时,DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键;③DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子,被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分;④DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口nick,而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口gap;⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应,因此,DNA连接酶在进行连接反应时,还需要提供一种能源分子NAD＋或ATP11.大肠杆菌 DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用DNA聚合酶作用的特点：➢要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA;➢接受模板指导;➢需要有引物3’羟基的存在;➢不能起始合成新的DNA链;➢催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端;➢催化DNA的合成方向是5’→3’;Klenow酶的基本性质：➢大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端604个氨基酸残基片段,即Klenow酶;分子量为76kDa;➢Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和5’→3’的核酸外切酶活性,但失去了5’→3’的核酸外切酶活性;Klenow酶的基本用途：➢修复由限制性核酸内切酶造成的 3’凹端,使之成为平头末端;➢以含有同位素的脱氧核苷酸为底物,对DNA片段进行标记;➢用于催化 cDNA 第二链的合成;➢用于双脱氧末端终止法测定 DNA 的序列;聚合酶T4-DNA聚合酶酶的基本特性：➢有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性;➢在无dNTP时,可以从任何3’-OH端外切;➢在只有一种dNTP时,外切至互补核苷酸;➢在四种dNTP均存在时,聚合活性占主导地位;T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端13. 影响连接效率的因素有：➢温度最主要的因素离子浓度➢ATP的浓度 10μM - 1μM➢连接酶浓度平末端较粘性末端要求高➢反应时间通常连接过夜➢插入片段和载体片段的摩尔比➢DNA末端性质➢DNA片段的大小14.如何将不同DNA分子末端进行连接1.相同粘性末端的连接如果外源DNA与载体DNA均用相同的限制性内切酶切割,则不管是单酶酶解还是双酶联合酶解,两种DNA分子均含有相同的粘性末端,因此混合后能顺利的连接成一个重组DNA分子 2.平头末端的连接T4-DNA连接酶在ATP和高浓度酶的条件下,能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子,但平末端连接效率不高,基因操作不经常采用;3.不用粘性末端的连接3’端的粘性末端用T4-DNA聚合酶切平5’端的粘性末端用klenow酶补平,或者用S1核酸酶切平最后用T4-DNA连接酶进行平末端连接15. 碱性磷酸酶有什么作用1.该酶用于载体 DNA的5’末端除磷操作,以提高重组效率；2.用于外源DNA片段的5’端除磷,则可有效防止外源 DNA 片段之间的连接;16. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用➢给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾;➢DNA片段3’末端的同位素标记;17. 2、细菌转化的步骤：∙感受态的形成;感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类,负责转化因子的结合、切割及加工;感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子,其功能是与细胞表面受体结合,诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质如细菌溶素的合成,使细菌胞壁部分溶解,局部暴露出细胞膜上的 DNA 结合蛋白和核酸酶等;∙转化因子的结合;受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合,单链DNA或RNA双链RNA以及DNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上;∙转化因子的吸收;双链 DNA 分子与结合蛋白作用后,激活邻近的核酸酶,一条链被降解,而另一条链则被吸收到受体菌中;∙整合复合物前体的形成;进入受体细胞的单链 DNA 与另一种游离的蛋白因子结合,形成整合复合物前体结构,它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解,并将其引导至受体菌染色体DNA处;∙转化因子单链DNA的整合;供体单链DNA片段通过同源重组,置换受体染色体DNA的同源区域,形成异源杂合双链 DNA结构;+诱导转化原理：①在0℃的Cacl2低渗溶液中,细菌细胞发生膨胀,同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,诱导大肠杆菌形成感受态;②Ca2+能与加入的DNA分子结合,形成抗DNA酶DNase的羟基-磷酸钙复合物,并黏附在细菌细胞膜的外表面上;当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时,细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,并随之出现许多间隙,为DNA分子提供了进入细胞的通道;③Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用,因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞,可以提高DNA的转化效率;∙但该法要求条件高,对外界污染物极为敏感,通常很少采用;介导细菌的原生质体转化∙PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构, 使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合;20.电穿孔法是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲,在质膜上形成纳米大小的微孔,DNA直接通过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中,这种方法称为电穿孔法;P52 接合转化,入噬菌体感染未归纳21.转化率的影响因素.载体及重组DNA方面载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞,其转化率不同;载体的空间构象：与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体; 插入片段大小：对质粒载体而言,插入片段越大,转化效率越低;重组DNA分子的浓度和纯度受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配转化操作的影响22.转化细胞的扩增转化细胞的扩增操作：指转化完成之后细胞的短时间培养;在实验时,扩增操作往往与转化操作偶联在一起,如：∙Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时∙原生质体转化后的再生过程∙λ噬菌体转染后的30℃培养等,均属扩增操作扩增操作的目的∙增殖转化细胞,使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序;∙扩增和表达载体分子上的标记基因,便于筛选;∙表达外源基因,便于筛选和鉴定;23.抗药性筛选法这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法;抗药性筛选法的基本原理：抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcs抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Tc的平板上在Ap平板上生长,但在Tc平板上不长的转化子即为重组子 P56抗药性标记插入失活选择法∙经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括需要的重组子,也含有不需要的非重组子;为了进一步筛选出重组子,可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选;如果外源基因插入在载体的抗药性基因中间使得该抗药性基因失活,这种抗药性标记就会消失,从而筛选出阳性重组子;24. 什么是蓝白斑筛选法这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体;主要是在λ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β—半乳糖苷酶的基因片段,携带有lac基因片段的λ载体转入lac的宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷X-gal平板上形成浅蓝色的噬菌斑;外源基因插人lac或lac基因部分被取代后,重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力,转入lac-宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷 X-gal平板上形成白色的噬菌斑,非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑;筛选法利用合适的引物,以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR,通过对PCR产物的电泳分析,确定目的基因是否插入到载体中;由于在载体DNA分子中,外源DNA插入位点的两侧序列多数是已知的,可以设计合成相应的PCR引物,以待鉴定的转化子或重组子的DNA为模板进行PCR反应,反应产物经琼脂糖凝胶电泳,若出现特异性扩增DNA带,并且其分子量同预期的一致,则可确定含此重组DNA分子的重组子是期待的重组子;第三章基因工程的常规技术1. 探针有哪些类型探针标记有哪些方法类型：同源或部分同源探针cDNA探针人工合成的寡核苷酸探针标记方法：①5’端标记法②反转录标记法③缺刻前移标记法④ABC标记法4.什么是ABC荧光显色酶标记法ABC 标记法;∙A为Avidin生物素抗性蛋白,每个Avidin分子可结合3 - 4个生物素分子；∙B为Biotin生物素,每个Biotin分子可结合2个Avidin分子；∙C为Complex,首先将Biotin共价结合在探针分子上,荧光胺标记在Avidin上,两者形成复合物,即可将荧光胺标记在探针上,发出的荧光也能使普通胶片感光;如果将某一生色酶接在Avidin上,并辅以合适底物,则杂交反应还可直接以颜色反应检测,这一技术称为酶标技术5.亚克隆法∙亚克隆：是将克隆片段进一步片段化后再次进行的克隆;∙一般是将重组DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后,将所得各片段分别重组到载体上再转化宿主细胞,然后通过转化细胞的表型鉴定或鉴定,获得含有目的基因的重组子;此时,该重组分子中的无关DNA区域以被大量删除;6. 菌落嗜菌斑原位杂交的基本原理、流程∙该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA 暴露出来并与滤膜原位结合再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有插入序列菌落;∙操作步骤：∙①菌落生长∙②转移到NC膜上∙③DNA释放和变性∙变成单链DNA：∙ 10％SDS NaOH∙④中和 Tris-HCl pH∙⑤固定 80 ℃ 120’∙⑥杂交包括预杂交,加探针DNA杂交∙⑦放射自显影∙⑧对照比较,选出重组克隆7.鸟枪法∙鸟枪法：将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的 DNA 片段,分别连接到载体 DNA上,转化受体细胞,形成一套重组克隆,从中筛选出含有目的基因的期望重组子;鸟枪法制备目的基因的主要步骤∙①目的基因组DNA片段的制备超声波处理：片段长度均一,大小可控,平头末端;原核生物的基因长度大都在2Kb以内,真核生物的基因长度变化很大,最大的基因可达100Kb以上;全酶切：片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开,大小不可控;部分酶切：片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整;∙②DNA片段与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体;∙③重组DNA分子导入受体细胞如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达的受体细胞;∙④筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法筛选模型的建立;∙⑤目的基因的定位利用鸟枪法获得的期望重组子只是含有目的基因的 DNA 片段,必须通过次级克隆或插入灭活,在已克隆的 DNA 片段上准确定位目的基因,然后对目的基因进行序列分析,搜寻其编码序列以及可能存在的表达调控序列;法酶促逆转录主要用于合成分子质量较大,转录产物mRNA易分离的目的基因;这种方法以目的基因的mRNA为模板,在逆转录酶的作用下合成互补的DNA,即cDNA,然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段,与适当的载体重组后转入受体菌扩增,获得目的基因的cDNA克隆; 的分离纯化绝大多数的真核生物mRNA在其3’端都存在一个多聚腺苷酸的尾巴,利用它可以迅速的将mRNA从细胞总的混合物中分离出来,将寡聚脱氧胸腺嘧啶共价交联在纤维素分子上,制成亲和层析柱,然后将细胞总的RNA混合物上层析柱分离,mRNA会挂在层析住上,后洗脱即可分离10. 简述PCR技术的基本原理,PCR反应体系的主要成分与主要程序是怎样的PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物;过程：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火复性：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链;重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板;每完成一个循环需2～4分钟, 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍;11. 什么是基因组文库其构建方法是怎样的是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中,以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因,这种保存基因遗传信息的材料,就称为基因文库又称DNA文库;基因组文库构建的一般步骤①载体的选择和制备;②高纯度、大分子量基因组 DNA 的提取;③基因组 DNA 的部分酶切与分级分离;④载体与DNA片段的连接;⑤转化或侵染宿主细胞;⑥筛选鉴定基因组及保存;12. 基因组DNA文库的质量标准除了尽可能高的完备性外,一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：∙重组克隆的总数不宜过大,以减轻筛选工作的压力∙载体的装载量最好大于基因的长度,避免基因被分隔克隆;∙克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域,以利于克隆排序;∙克隆片段易于从载体分子上完整卸下;∙重组克隆能稳定保存、扩增、筛选;基因文库的构建通常采用鸟枪法和cDNA法13.外源DNA片段的切割原则片段之间要有一定的重叠序列片段大小要均一文库构建的步骤∙细胞总RNA的提取和mRNA的分离∙第一链cDNA合成∙第二链cDNA合成∙双链cDNA的分级分离∙双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖∙重组体的筛选与鉴定第四章基因在大肠杆菌、酵母的高效表达1. 启动子∙启动子：是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始转录的序列,其大小在20～300个碱基,是控制基因转录的重要调控元件;在一定条件下mRNA的合成速率与启动子的强弱密切相关,而转录又在很大程度上影响基因的表达;∙启动子的特征：①序列特异性②方向性③位置特性④种属特异性2.启动子类型∙组成型启动子：是指在该类启动子控制下,结构基因的表达大体恒定在一定水平上,在不同组织、部位表达水平没有明显差异;∙组织特异启动子：又称器官特异性启动子;在这类启动子调控下,基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达,并表现出发育调节的特性;∙诱导型启动子：是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下,该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平;目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等;3.终止子终止子：是位于结构基因下游的一段DNA序列,基因转录时,该序列被转录为mRNA的一部分,并形成特殊的二级结构,由此终止基因的转录;序列SD序列：mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序,它可以与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补,形成氢键结合,有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始5.密码子不同生物对密码子的偏爱性1.生物体基因组中的碱基含量2.密码子与反密码子的相互作用的自由能3.细胞内tRNA的含量6. 密码子偏爱性对外源基因表达的影响∙由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性,因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择;一般而言,有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：∙外源基因全合成∙同步表达相关tRNA编码基因7. 包涵体及其性质在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体8. 包涵体的形成机理∙①折叠状态的蛋白质集聚作用;∙②非折叠状态的蛋白质集聚作用∙③蛋白折叠中间体的集聚作用;9. 包涵体的分离检测∙包涵体的分离主要包括菌体破碎、离心收集以及清洗三大操作步骤;10. 分泌型目的蛋白表达系统的构建∙包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外,但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白细菌素分泌到培养基中,这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白,它激活定位于内膜上的磷酸酯酶A,导致细菌内外膜的通透性增大∙因此,只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞;此时,用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞,并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录,则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌;11融合蛋白表达质粒的构建原则：∙受体细胞的结构基因能高效表达,且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化;。
基因工程知识点总结
选修3易考知识点背诵专题1 基因工程基因工程的概念1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有特异性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2.“分子缝合针”——DNA连接酶(1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
(2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。
DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
3.“分子运输车”——载体（1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
（2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
（3）其它载体：噬菌体、动植物病毒(二)基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取1.目的基因是指：是人们所需要转移或改造的基因2.获取目的基因的方法____________ _________________ _____________3.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。
人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。
技术扩增目的基因（1）原理：DNA双链复制（2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
生物基因工程知识点
⽣物基因⼯程知识点 基因⼯程技术为基因的结构和功能的研究提供了有⼒的⼿段，下⾯店铺给你分享⽣物基因⼯程知识点，欢迎阅读。
⽣物基因⼯程知识点(⼀) 基因⼯程的基本⼯具 1.“分⼦运输车”——载体 (1)载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有⼀⾄多个限制酶切点，供外源DNA⽚段插⼊。
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
(2)最常⽤的载体是??质粒,它是⼀种裸露的、结构简单的、独⽴于细菌染⾊体之外，并具有⾃我复制能⼒的双链环状DNA分⼦。
(3)其它载体：噬菌体的衍⽣物、动植物病毒 2.“分⼦⼿术⼑”——限制性核酸内切酶(限制酶) (1)来源：主要是从原核⽣物中分离纯化出来的。
(2)功能：能够识别双链DNA分⼦的某种特定的核苷酸序列，并且使每⼀条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸⼆酯键断开，因此具有专⼀性。
(3)结果：经限制酶切割产⽣的DNA⽚段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
3.“分⼦缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶(E?coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶)的⽐较： ①相同点：都缝合磷酸⼆酯键。
②区别：E?coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA⽚段互补的黏性末端之间的磷酸⼆酯键连接起来;⽽T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
(2)与DNA聚合酶作⽤的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸⽚段的末端，形成磷酸⼆酯键。
DNA连接酶是连接两个DNA⽚段的末端，形成磷酸⼆酯键。
⽣物基因⼯程知识点(⼆) 基因⼯程的基本操作程序 第⼀步：⽬的基因的获取 1.⽬的基因是指：编码蛋⽩质的结构基因。
2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是⼈⼯合成。
⼈⼯合成⽬的基因的常⽤⽅法有反转录法_和化学合成法_。
3.PCR技术扩增⽬的基因 (1)原理：DNA双链复制 (2)过程：第⼀步：加热⾄90～95℃DNA解链;第⼆步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链;第三步：加热⾄70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
生物基因工程知识点
生物基因工程知识点1. 基因工程定义基因工程，又称遗传工程，是指通过人工手段对生物体的基因进行改造，以实现对生物体性状的改变和新品种的培育。
它包括基因克隆、基因转移、基因编辑等多个技术环节。
2. 基因克隆基因克隆是指将特定的基因片段从供体生物体中提取出来，并在体外进行复制和扩增的过程。
这一过程通常涉及限制性内切酶、DNA连接酶和载体等分子生物学工具。
3. 基因转移基因转移是将克隆的基因片段导入到受体细胞中，使其成为受体细胞基因组的一部分，并能够表达出新的性状。
常用的基因转移方法包括质粒介导、病毒载体和基因枪等。
4. 基因编辑基因编辑是指对生物体基因组中的特定位点进行精确的添加、删除或替换。
CRISPR-Cas9是目前最流行的基因编辑技术，它允许科学家在细胞中进行特定DNA序列的编辑。
5. 转基因生物转基因生物是指通过基因工程技术改变了基因组的生物。
这些生物可能会展现出抗虫、抗病、抗旱等特性，或者提高营养价值。
6. 伦理和法律问题基因工程的发展引发了一系列伦理和法律问题，包括生物安全、生物多样性保护、知识产权和公众接受度等。
各国政府和国际组织都在制定相关法规以确保基因工程的安全和合理应用。
7. 基因工程的应用基因工程在农业、医学、工业生产和环境保护等多个领域都有广泛应用。
例如，在医学领域，基因工程被用于生产重组蛋白药物；在农业领域，用于培育抗病虫害的转基因作物。
8. 安全性评估由于基因工程可能对环境和人类健康产生影响，因此对转基因生物的安全性评估至关重要。
这包括对转基因生物的环境影响、长期食用安全性等进行系统的研究和评估。
9. 未来发展趋势基因工程的未来发展趋势包括提高基因编辑的精确性和效率、发展新的基因工程技术、加强跨学科研究以及推动基因工程在全球范围内的合理应用和监管。
10. 公众教育和沟通鉴于基因工程的复杂性和伦理问题，公众教育和沟通显得尤为重要。
科学家和政策制定者需要与公众进行有效沟通，提高公众对基因工程的理解，促进科学决策的制定。
高考常考基因工程知识点
高考常考基因工程知识点基因工程是生物学和生物技术中的一个重要分支，也是高考中常考的知识点之一。
它涉及到人类对遗传物质DNA的操作，以达到改变生物体特征的目的。
本文将以简明扼要的方式介绍高考中常被考察的基因工程知识点，包括基因工程的定义、重要技术、应用领域以及伦理道德问题等内容。
一、基因工程的定义基因工程是指通过技术手段对细胞或有性生殖生物的基因进行人工改造，以达到某种预期效果的技术。
核心方法是将目标基因从一个生物体转移到另一个生物体中，实现基因的增加、删除或修饰。
该技术的兴起给农业、医学和生物工程等领域带来了革命性的变革。
二、重要技术1. DNA重组技术：通过将不同来源的DNA片段进行切割和连接，可以合成新的DNA序列。
其中最重要的技术是限制性酶切和DNA连接酶。
2. DNA克隆技术：将目标基因插入到载体DNA中，并通过细菌进行复制和扩增。
常用的载体有质粒和噬菌体。
3. DNA测序技术：用于确定DNA序列的方法。
包括Sanger测序和新一代测序技术。
测序技术的发展极大地促进了基因工程的研究和应用。
三、应用领域1. 农业领域：基因工程在农业领域的应用主要包括转基因作物和转基因动物。
转基因作物常见的有抗虫、抗病作物。
转基因动物则可以用于提高农业生产效率和改良畜禽品种。
2. 医学领域：基因工程在医学领域的应用主要包括基因治疗、基因诊断和基因药物。
基因工程可以通过修复或替代有缺陷的基因来治疗遗传性疾病。
同时，基因工程也可以开发出用于基因诊断和基因靶向治疗的药物。
3. 生物工程领域：基因工程在生物工程领域的应用涉及到生物制药、酶工程和生物燃料等方面。
通过利用基因工程技术，可以制造出大量的蛋白质药物和高效酶催化剂，同时也可以利用微生物进行生物能源的制造。
四、伦理道德问题基因工程的发展也带来了一系列的伦理道德问题。
其中最常被讨论的问题包括食品安全问题、资源分配问题、基因隐私和克隆技术等。
对于这些问题，社会各界需要进行广泛而深入的讨论和研究，以寻找到既能促进科技发展又能保障人类福祉的平衡点。
基因工程生物知识点
第一章基因工程基因工程是狭义的遗传工程，遗传工程的核心是构建重组DNA分子。
基因工程也称为“重组DNA技术”。
第一节工具酶的发现和基因工程的诞生基因工程的理论基础：DNA是遗传物质，DNA的双螺旋结构，以及遗传信息的传递方式。
基因工程的技术保障：限制性核酸内切酶，DNA连接酶和质粒载体发现与应用。
一、限制性核酸内切酶：能够识别和切割DNA分子内一小段特殊核苷酸序列的酶。
（平末端和黏性末端）限制性核酸内切酶可作为切割DNA分子的手术刀，它的发现和应用，使DNA重组成为可能。
二、DNA连接酶：将具有末端碱基互补的2个DNA片段连接在一起，形成的DNA分子称为重组DNA分子。
DNA连接酶具有缝合DNA片段的作用。
三、质粒：能够自主复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于大型DNA分子之外的方式存在，是一种特殊的遗传物质。
最常用的是大肠杆菌的质粒，其含有抗生素抗性基因。
标志基因工程诞生的试验：通过重组，使大肠杆菌同时具有四环素和卡那霉素的抗性。
四、基因工程的载体载体是运载外源DNA进入宿主细胞的车子，即运载工具。
除质粒外，基因工程载体还有入噬菌体、植物病毒和动物病毒。
入噬菌体：将外源基因载入大肠杆菌等宿主细胞。
植物病毒：将外源基因带入植物细胞。
动物病毒：将外源基因带入动物细胞。
第二节基因工程的原理和技术基因工程的基本原理是让人们感趣的基因（目的基因）在宿主细胞中稳定和高效表达。
基因工程的基本要素：工具酶、目的基因、载体和宿主细胞。
基因工程的基本操作步骤：A目的基因的获得；B重组DNA的形成；C重组DNA导入受体细胞（宿主细胞）；D筛选含有目的基因的受体细胞；E目的基因的表达。
一、获得目的基因目的基因序列已知：化学合成方法合成目的基因，PCR扩增目的基因。
目的基因序列未知：构建基因文库。
二、形成重组DNA分子用相同的限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体，两者形成相同的黏性末端，然后用DNA连接酶将目的基因和载体连接在一起，形成重组DNA分子。
基因工程知识点
基因工程：诞生于20世纪70年代。
概念：实在分子水平上进行的操作，指将多种生物体（供体）的基因或基因组提取出来，或者人工合成基因，按照人们的愿望，严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体（受体）细胞中，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。
三要素：供体受体载体。
基因工程的主要内容：1.目的基因的获取2.重组体的制备 3.重组体的转化4、克隆鉴定5、目的基因的表达限制性内切酶：是一种能够识别双链DNA分子中的某种特定核酸序列（4-8bp）并由此处切割双链的核酸内切酶。
1、来源：原核生物2、性质：在核酸分子链的内部制造切口3、功能：自身保护作用（R/M体系：保护自身的DNA不受限制，破坏外源的DNA使之迅速讲解）影响限制酶活性的主要因素：1、DNA的纯度2、DNA 的甲基化程度3、温度4、缓冲溶液5、DNA的分子结构Klenow片段：E.coli DNA聚合酶Ⅰ经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。
该片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性，但缺少完整酶的5ˊ-3ˊ外切酶活性。
功能：1、3ˊ断的补平；2、DNA 3ˊ末端标记；3、cDNA第二链的合成。
平齐末端DNA 的连接方法：1、同聚物加尾法2、衔接物法；3、接头连接发。
双酶切相对单酶切的优点：可保证插入外源片段的方向，防止载体自连，提高重组率。
星号活性：在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。
部分酶切：指选用的核酸内切酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割。
发生部分酶切的原因：底物DNA纯度低；识别序列甲基化；酶用量不足；反应缓冲液和温度不适宜。
碱性磷酸酶和S1磷酸酶的功能：碱性磷酸酶主要是脱磷酸作用，其产物具有5-OH末端，这种功能使它在DNA 分子克隆实验中发挥着重要作用，利用该酶可以有效防止粘性末端分子自连。
S1核酸酶：是一种高度单链特异的核酸内切酶，可降解单链DNA或RNA，不仅能催化RNA 和单链DNA分子降解成为5单核苷酸，而且它也能作用于双链核苷酸单链区。
基因工程知识点
专题１基因工程1.1 DNA 重组技术的根本工具１．基因工程又叫 DNA 重组技术，是指依据人们的梦想，进行严格的设计，并经过体外 DNA 重组和转基因等技术，给予生物以新的遗传特征，从而创建出更切合人们需要的新的生物种类和生物产品。
操作水平是 DNA 分子水平，操作环境是在体外。
２．“分子手术刀〞──限制性核酸内切酶。
这种酶主假如从原核生物中分离纯化出来的。
迄今已从近 300 种微生物中分离出了约 4000 种限制酶。
能够辨别双链 DNA分子的某种特定核苷酸序列；切开两个两个核苷酸之间的磷酸二酯键，形成黏性尾端或平尾端。
３．“分子缝合针〞──DNA 连结酶。
将切下来的 DNA片段拼接成新的 DNA分子，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
种类： 1〕E.coli DNA连结酶：只好将双链 DNA片段互补的粘性尾端之间连结起来 2〕T4 DNA连结酶：既能够“缝合〞双链 DNA片段互补的粘性尾端，又可以“缝合〞双链 DNA片段的平尾端，但连结平尾端之间的效率比较低４．“分子运输车〞──基因进入受体细胞的载体。
作为载体的必需条件：能自我复制、有切割位点、有遗传标志基因等。
载体的种类：细菌质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒1.2 基因工程的根本操作程序１．基因工程的根本操作步骤主要包含：目的基因的获得；基因表达载体的建立；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与判定。
２. 目的基因的获得方法：从基因文库中获得、利用 PCR 提取目的基因、人工合成法。
是一项在生物体外复制特定 DNA 片段的核酸合成技术。
原理 DNA 双链复制。
条件：模板 DNA ；RNA 引物；四种脱氧核苷酸；热稳固 DNA 聚合酶〔 Taq 酶〕。
方法： DNA受热变性解旋为单链、冷却后 RNA引物与单链相应互补序列联合、DNA聚合酶作用下延长合成互补链。
4．基因表达载体的功能：使目的基因在受体细胞中稳固存在；能够遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥作用。
整理基因工程
精品文档一、名词解释1、感受态细胞：就是处于能吸收外源DNA分子的生理状态的细胞2、转化：是指以质粒为载体，将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种过程3、回文序列：从5,一3,端两条链中的核甘酸碱基排列顺序完全相同的序列4、粘性末端：是指DNA分子在限制性内切核酸酶的作用下形成的具有互补减记的单链延伸形成的末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新连接起来5、平齐末端：限制性核酸内切酶在识别序列的对称轴上切割，形成的片段末端为平末端6、Ti质粒：是根癌农杆菌中发现的可引发植物产生冠瘿瘤的质粒；7、质粒：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。
8、cos位点：入DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。
9、lacZ'基因：大肠杆菌lacZ的a -肽链序列，是LacZ的氨基端片断。
10、克隆载体：以繁殖外源DNA片段为目的载体通称为克隆载体11、clone：含有目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖12、同尾酶：它们的来源不同，识别的靶序列也不同，但切割后能产生相同的粘性末端的一类限制性核酸内切酶13、同切点酶：又称同裂酶，是一类来源不同而能识别相同靶序列的限制性内切核酸酶14、星号活性：当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性的现象15、转导：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移的过程16、转染：以噬菌体为载体，不经过蛋白包装成病毒颗粒，用DNA连接酶使噬菌体DNA环化，在通过质粒转化方式导入受体菌的过程17、感染：以入噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒颗粒，使其感染受体菌的过程18、基因枪法：又称微弹轰击法、粒子轰击法，是一种借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术19、转化率：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数，是衡量转化效率的重要指标20、限制性内切核酸酶简称限制酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核甘酸序列(4-8bp),并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
基因工程复习知识点
质粒名称和大小、复制启动子、多克隆酶切位点MCS、选择标记基因16°C连接，37°C酶切凝胶电泳pH8.0带负电1.基因工程：又称遗传工程，是通指重组DNA技术的产业化设计和应用的流程。
强调基因克隆、载体构建、遗传转化、性状表达与产品提取及纯化等全部过程。
2.基因操作技术：利用遗传重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将包含目的基因、特殊载体在内的各种必需元件的DNA分子经过改造和重组后，转入另一受体生物细胞内。
3.基因：DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列。
4.核酸：由许多核苷酸单位通过3，5-磷酸二酯键连接起来形成的不含侧链的具有方向性的长链状化合物。
5.顺反子（基因同义词）：在反式构型中不能互补的各个突变型在染色体上所占的一个区域称为一个顺反子。
是一个必须保存完整才具有正常生理功能的遗传物质最小单位。
6.突变子（muton）：突变单位，基因内部有许多突变位点，突变后产生变异的最小单位。
（最小的突变单位为1个碱基对bp）7.重组子（recon）：重组单位，基因内部有多个重组单位，不能由重组分开的最小单位。
一个基因不是一个突变单位，也不是一个重组单位。
8.断裂基因（split gene）：指基因内部被一个或更多不翻译的编码顺序即内含子所隔裂。
基因都可划分为转录区（转录起始点至转录终止子的区域）和调控区（位于转录起始点5’上游，包括核心启动子、上游启动元件及增强子等序列）结构基因并非都是连续的，原核生物基因是连续的，而真核生物的基因是断裂的9.内含子（intron）：在成熟mRNA的片段中未反应出的DNA区段；10.外显子（extron/exon）: DNA序列中被转录成为mRNA中的片段。
基因中能变成核苷酸序列的是外显子，内含子不能。
11.核小体（nucleosome）：在真核生物中，双螺旋的DNA分子围绕一蛋白质八聚体进行盘绕，从而形成特殊的串珠状结构。
基因工程知识点归纳
基因工程(习题详见2016天利活页)DNA重组技术的基本工具知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。
注意：对本概念应从以下几个方面理解：知识点二基因工程的基本工具1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”（1）限制性内切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。
（2）限制性内切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。
（3）限制性内切酶的切割方式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。
②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。
2.DNA连接酶——“分子缝合针”（1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体（2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。
（3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。
注意：比较有关的DNA酶(详情见附件)DNA聚合酶：在DNA复制时起作用，将多个脱氧核苷酸催化聚合为脱氧核苷酸链（也就是DNA单链），此时形成的化学键是磷酸二酯键。
DNA解旋酶：在DNA复制或转录时起作用，将DNA的双链解开，作用对象是氢键，使氢键断裂DNA水解酶：在消化道或细胞内起作用，将DNA水解为脱氧核苷酸，作用对象是磷酸二酯键下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶：在DNA修饰过程或基因工程中起作用，将两个DNA片段连接起来，此时形成的化学键是磷酸二酯键。
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”（1）分子运载车的种类①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA 分子， 独立于拟核之外。
高中生物选修三基因工程常考知识点归纳
1．基因工程的概念(1)供体：提供目的基因。
(2)操作环境：体外。
(3)操作水平：分子水平。
(4)原理：基因重组。
(5)受体：表达目的基因。
(6)本质：性状在受体体内的表达。
(7)优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状。
2．基础理论和技术的发展催生了基因工程(1)20世纪中叶，基础理论取得了重大突破①DNA是遗传物质的证明：1944年，艾弗里等人通过不同类型肺炎双球菌的转化实验，不仅证明了生物的遗传物质是DNA，还证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。
艾弗里等人的工作可以说是基因工程的先导。
②DNA双螺旋结构和中心法则的确立：1953年，沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。
1958年，梅塞尔松和斯塔尔用实验证明DNA的半保留复制。
随后不久确立的中心法则，解开了DNA复制、转录和翻译过程之谜，阐明了遗传信息流动的方向。
③遗传密码的破译：1963年，尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码。
1966年，霍拉纳用实验证实了尼伦伯格提出的遗传密码的存在。
这些成果不仅使人们认识到，自然界中从微生物到人类共用一套遗传密码，而且为基因的分离和合成等提供了理论依据。
(2)技术发明使基因工程的实施成为可能①基因转移载体的发现：1967年，罗思和赫林斯基发现细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移，这一发现为基因转移找到了一种运载工具。
②工具酶的发现：1970年，阿尔伯、内森斯、史密斯在细菌中发现了第一个限制性内切酶(简称限制酶)后，20世纪70年代初相继发现了多种限制酶和连接酶，以及逆转录酶，这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
③DNA合成和测序技术的发明：自1965年，桑格发明氨基酸序列分析技术后，1977年，科学家又发明了DNA序列分析的方法，为基因序列图的绘制提供了可能，之后，DNA 合成仪的问世又为引物、探针和小分子量DNA基因的获得提供了方便。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
名词解释1.基因工程：是将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。
2.限制性内切核酸酶：能够识别双链DNA分子中的某一段特定核苷酸序列，并在此切割DNA 双链的内切核酸酶。
3.同切点酶：又称同裂酶，是一类来源于不同微生物、能识别相同DNA序列的限制性内切核酸酶。
4.同尾酶：是一类限制性内切核酸酶，它们来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同的黏性末端。
5.酶的星号活性（Star activity）：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的酶的星号活性现象。
6.DNA连接酶：是能催化双链DNA片段靠在一起的3’羟基末端与5’端磷酸基团末端之间通过形成磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。
7.载体：在基因克隆中能携带外源基因进入受体细胞复制、整合或表达的工具称为载体。
8.多克隆位点：是包含多种同一个限制性酶切点的一段很短的DNA序列9. α互补：为质粒DNA编码β—半乳糖苷酶的α亚基，宿主细胞可编码β亚基虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫α互补。
10.黏粒载体（考斯质粒载体）：是一类人工构建的含有λ-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。
11.质粒：是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子12.探针：当用一个标记的核酸分子与核酸样品杂交,便可查明该样品中是否存在与该标记核酸分子具有同源性的核酸分子。
这个标记的核酸分子称为探针(probe)，可以是DNA，也可以是RNA，或合成的寡核苷酸.13、SD序列：是存在于原核生物起始密码子上游7-12个核苷酸内的一种4-7个核苷酸的保守片段，它与16SrRNA3’端反向互补，所以可将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译作用。
14、包含体：目的蛋白子啊细胞质的还原性环境中，以不溶性的形式产生并聚集形成蛋白质聚合物即为包含体。
简答：1. 影响限制性核酸内切酶活性的因素答：1）DNA的纯度2）DNA的甲基化程度3）消化反应的缓冲液系统4）DNA的分子结构5）酶的纯度6）酶切反应的温度7）酶的星号活性2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ与klenow片段的比较答：1）结构上的区别：Klenow片段是完整DNA聚合酶Ⅰ的一个片段，是用枯草杆菌蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ时，得到的两个片段中分子量较大的一个，具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'的外切酶活性，不含5'→3'外切酶活性。
2）功能上的区别：DNA聚合酶I可通过DNA缺口平移的方法制备DNA探针。
而klenow酶主要用于缺口平移标记DNA，也用于DNA的缺口补平和延伸。
还在cDNA克隆中用于第二条cDNA链的合成。
3.载体的基本条件答：1）.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)，可以携带外源基因进入受体细胞；2）能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；3）.具有多种单一的限制性核酸内切酶识别切割位点；4）.具有较高的外源DNA的载装能力；5）.具有合适的筛选标记。
4.质粒的基本性质答：（1）自主复制。
质粒DNA上都含有一个复制起始区，控制着质粒在宿主细胞内的复制，这一复制起始区称为“复制子”。
一般一个质粒DNA分子上只含有一个复制子。
按复制能力可将质粒分为严紧型和松弛型两类。
（2）不相容性：在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞系中稳定地共存的现象，又称为不亲和性。
这样的两种质粒称为不亲和质粒。
（3）转移性：能在自然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）的质粒称为接合型质粒；不能在自然条件下独立地发生接合作用的质粒称为非接合型质粒。
（4）编码性状：野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状。
5、Southern杂交（DNA）步骤:答：①DNA的片段化及其电泳分离；②凝胶电泳后的变性处理；③转移并固定到滤膜上；④杂交；⑤检测与分析6、基因组文库与cDNA文库的区别基因组文库：基因组文库简称基因文库，是将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后获得的重组子群体的总称。
CDNA文库：是将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了全部表达基因的转录本。
区别：基因组文库包含全部基因，但cDNA文库石油mRNA反转录得到的，，已经去掉基因中的内含子部分7.比较克隆载体与表达载体的异同同：1）.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)，可以携带外源基因进入受体细胞；2）能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；3）.具有多种单一的限制性核酸内切酶识别切割位点；4）.具有合适的筛选标记。
异：1）表达载体在克隆载体的基础上又增加了基因表达的调控元件：即启动子——核糖体结合位点——克隆位点——转录终止信号（区分二者的标志）2）克隆载体在菌体中一般是多拷贝的，而表达载体一般是低拷贝的。
8、外源基因在大肠杆菌中的表达形式有哪些？如何纯化？1）包含体蛋白：纯化步骤：细胞收集与破碎，洗涤与溶解，变性蛋白质的纯化，重组蛋白质的复性，天然蛋白质的分离。
2）融合蛋白：融合蛋白的提取，重折叠，纯化，天然蛋白的回收以及蛋白质的水解保护。
3）分泌型蛋白：首先要进行浓缩处理，然后再根据发酵液中的有效成分和杂质之间的理化性质存在的差异来考虑选择合适的纯化方法。
如离子交换层析，亲和层析，凝胶过滤等。
4）可溶性表达产物：经细胞破碎后的可溶性离心上清液，可利用如果有可利用的单克隆抗体或相对特异性的亲和配基，，可选用亲和层析分离法。
对处于极端等电点的蛋白，采用离子交换层析分离。
5）周质表达蛋白：大肠杆菌细胞低浓度溶菌酶处理，渗透压裂解法，周质腔分离出目的蛋白。
9、抑制性消减杂交（SSH）的原理和过程原理：SSH的核心技术是抑制性PCR，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤融为一体的技术。
抑制性PCR是利用链内复性优先于链间复性的原理，是非目标序列片段两端的长反向重复序列在复性时产生“锅柄样”结构或“发夹结构”而无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。
论述题：1、PCR技术的原理、成分、步骤、应用及引物设计的要求1）原理:PCR技术是以DNA互补链的聚合反应为基础，通过DNA变性、引物与模板DNA一侧的互补序列复性杂交，由DNA聚合酶催化引物延伸,最终获得特异DNA片段的体外扩增方法。
2)成分：模板、引物、DNA聚合酶（耐高温）、Dntp3）步骤：①变性：系统加热至92℃-96℃，使dsDNA（双链）解链成为ssDNA（单链），且热变性不改变其化学性质；②退火：降温至37℃-72℃，使引物与模板的互补区相结合；③延伸：在72℃条件下，DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3‘-OH端，合成DNA。
4）应用：1、引物设计；2、限制性内切酶位点分析；3、DNA 基元查找；4、同源性分析5）引物设计：①长度：至少16bp，通常为18-30bp：②两个引物之间的Tm最好接近，最好1℃以内，最多不超过5℃；③避免引物内部或引物之间存在互补序列；④G+C含量应尽量控制在40%至60%之间；⑤引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响，A的错配概率较高，应尽量避免使用；⑥引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加；⑦最好在模板cDNA的保守区内设计；⑧引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发；⑨的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
2.基因工程技术流程答：1）目的基因克隆2)载体的准备3）目的基因与载体的连接4）重组DNA转化/转染/转导5）体的筛选与鉴定6）重组体的大量培养，外源基因表达效应分析与开发应用3、转化率的计算（结合2回答）例题：某一DNA重组实验的充足率为20%，转化率为107/mg载体，经酶切和连接处理后的重组载体转化率比天然载体低约100倍，欲获得104个重组克隆，需要投入多少载体DNA 进行重组实验？解答：若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要0.1mg载体DNA,重组率为20%时投入载体为0.5mg，载体投入量确定后，即可按10:1的要求算出5mg。
4、根据同源性设计引物（p102-104）/5’RACE扩增1）分析核心区段获得某蛋白质的氨基酸序列，根据密码子与氨基酸对应关系，选取两段连续的保守氨基酸序列，写出其可能的编码序列，对蛋白质同源性或同源性基因cDNA序列进行充分的比对，如果利用的是蛋白质序列资料，在蛋白质数据库中比较与之同源的蛋白序列，找出蛋白质保守性高的区域，作为引物设计的位点，如果是利用同源cDNA的资料，从数据库中获得多个近缘物种同源序列后，进行序列多重比较，选择高保守性区段序列并设计引物。
2）设计简并引物和扩增核心区段由于一个氨基酸可对应一个到多个密码子，因此一段氨基酸序列可以有多个可能的编码序列，称为简并序列。
相应合成这一段序列作PCR扩增体系的引物即为简并引物。
在选取氨基酸序列时往往优先选取对应密码子较少的残基，为了降低简并度，放弃最后一个氨基酸其密码子的第三位碱基。
设计核心区段扩增的简并引物还要考虑扩增区段的长度和在cDNA 分子中的位置，通常扩增序列在几百碱基内效果较好。
3）设计RACE引物，并进行3’RACE和5’RACE扩增3’RACE 根据中间核心序列设计出3’端RACE的上游引物后，利用dT作为下游引物，利用mRNA反转录成的第一链cDNA作为模板将cDNA3’端扩增出来5’RACE尽管其下游引物可以根据克隆的核心序列可以确定下来，但由于5’端上游序列未知，上游的引物难以确定，因而5’ RACE要采用一些特殊方法确定其上游引物位点。
5.基因工程的安全性问题（主观题，可两方面分析）其他知识点1、Northern杂交（RNA）; Western 杂交（蛋白质）2、核酸分子骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；所以核酸带负电荷，在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移。
3、T—A克隆法（填空）A/T克隆法是目前使用最广泛的PCR产物克隆法，无须在产物末端添加酶切位点；主要适用于Taq DNA聚合酶扩增的产物；Taq DNA聚合酶具有末端转移酶的活性，可以在扩增的DNA片段3末端添加一个A(腺苷酸)；Taq DNA聚合酶扩增产物可与T-载体进行互补连接，从而达到高效克隆的目的。