第二章 发酵工业菌种与种子的扩大培养

菌种鉴定工作是各类微生物学实验室都经常 遇到的基础性工作。不论鉴定对象属哪一类， 其工作步骤都离不开以下三步： ①获得该微生物的纯种培养物；
②测定一系例必要的鉴定指标；
③查找权威性的鉴定手册。
通常把鉴定微生物的技术分成四个不同水平：
（经典的分类鉴定方法：微生物分类学发展的早期） ①细胞的形态和习性水平，例如用经典的研究方法，观察细 胞的形态特征、运动性、酶反应、营养要求和生长条件等。 ②细胞组分水平，如细胞壁成分，细胞氨基酸库，脂类，醌 类，光合色素等的分析，所用的技术除常规实验室技术外， 还使用红外光谱、气相色谱和质谱分析等新技术。 ③蛋白质水平，包括氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反 应等若干现代技术。 ④基因或DNA水平，包括核酸分子杂交（DNA与DNA或DNA 与RNA），G＋Cmol%值的测定，遗传信息的转化和转导， 16S rRNA（核糖体RNA）寡核苷酸组分分析，以及DNA或 RNA的核苷酸顺序分析等。 （现代的分类鉴定方法：从20世纪60年代
由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入，藻类 （alga）、病毒（virus）等也正在逐步地变为工业生产用 的生物。
尽管如此，目前人们对微生物的认识还是十分不够的 。已经初步研究的不超过自然界微生物总量的10%左右。
微生物的代谢产物据统计已超过一千三百多种，而大 规模生产的不超过一百多种； 微生物酶有近千种，而在工业上利用的不过四五十种 。可见潜力是很大的。


分离菌株 16S rRNA 基因

从平板中直接挑取一环分离菌株细胞 , 加入 100μL 无 菌重蒸 H 2 O 中 , 旋涡混匀后 , 沸水浴 2min, 12 000r min -1 离心 5min, 上清液中即含 16S rRNA 基因，可直接用 于 PCR 扩增。分离菌株 16S rRNA 基因的 PCR 扩增和序列测 定的一般步骤为： 16S rRNA 基因的 PCR 引物： 5'-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3' ； 5'-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA3' 。扩增反应体积 50 m L ，反应条件为 95 ℃预变性 5min ， 94 ℃变性 1min ， 55 ℃退火 1min ， 72 ℃延伸 2min ，共进行 29 个循环， PCR 反应在 PTC-200 型热循环 仪上进行。取 5 m L 反应液在 10g L -1 的琼脂糖凝胶上进 行电泳检测。 PCR 产物测序可由专门技术公司完成。
藻类工 厂
二、微生物工业对菌种的要求


1、原料廉价、生产迅速、目的产物产量高； 2、易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短； 3、抗杂菌和噬菌体的能力强； 4、菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生 任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。 5、满足代谢控制要求 6、发酵过程中产生泡沫少 7、对需添加的前体有耐受力，且不作碳源 8、不是病原菌
1. DNA的碱基组成(G+Cmol%)

1）每个生物种都有特定的GC%范围，因此后者可以作为分 类鉴定的指标。细菌的GC%范围为25--75%，变化范围最大， 因此更适合于细菌的分类鉴定。而放线菌 DNA 中的 GC 比例范围
非常窄 (37 ％～ 51%)

2）GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌作出鉴定， 并可检验表型特征分类的合理性，从分子水平上判断物种的 亲缘关系。 3）使用原则： G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定。每一种生物都 有一定的碱基组成，亲缘关系近的生物，它们应该具有相似 的G+C含量，若不同生物之间G+C含量差别大表明它们关系 远。但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它们之间具有 近的亲缘关系。


DNA — rRNA 杂交







目前研究 RNA 碱基序列的方法有两种。一是 DNA 与 rRNA 杂交，二是 16S rRNA 寡核苷酸的序列分析。 DNA 与 rRNA 杂交的基本原理、实验方法同 DNA 杂交 一样，不同的是 ① 是 DNA 杂交中同位素标记的部分是 DNA ，而 DNA 与 rRNA 杂交中同位素标记的部分是 rRNA 。 ② DNA 杂交结果用同源性百分数表示，而 DNA 与 rRNA 杂交结果用 Tm(e) 和 RNA 结合数表示。 Tm(e) 值是 DNA 与 rRNA 杂交物解链一半时所需要的 温度。 RNA 结合数是 100mgDNA 所结合的 rRNA 的mg数。根据 这个参数可以作出 RNA 相似性图。在 rRNA 相似性图上， 关系较近的菌就集中到一起。关系较远的菌在图上占据不 同的位臵。 通过测定和比较16SrRNA 寡核苷酸顺序谱可得到属以上 细菌分类单元的较一致的系统发育概念，并导致了古细菌 的建立。
3.建立16 S r RNA系统发育树

a）使生物进化的研究范围真正覆盖所有生物类群； 传统的生物进化研究，主要基于复杂的形态学和化石记载，因 此多限于研究后生生物（metazoa），而后者仅占整个生物进 化历程的1/5 b）提出了一种全新的正确衡量生物间系统发育关系的方法； c）对探索生命起源及原始生命的发育进程提供了线索和理论 依据； d）突破了细菌分类仅靠形态学和生理生化特性的限制，建立 了全新的微生物分类、鉴定理论； e）为微生物生物多样性和微生物生态学研究建立了全新的研 究理论和研究方法，特别是不经培养直接对生态环境中的微生 物进行研究。
在筛选所需的菌种时应考虑的一些重要的指标：
（1） 菌种的营养特征：
（2） 菌种的生长温度： （3） 菌种对所采用的设备及生产过程的适应性： （4） 菌种的稳定性： （5） 产物的得率和产物的浓度：
（6） 产物容易回收：
能满足（3）~（6），则有希望成为效益较高的生产菌种。
第二节 发酵工业菌种鉴定
起，化学分类学再加上数值分类法）
一、经典分类鉴定方法
相对于现代的分类鉴定方法而 言的，通常指长期以来在常规鉴定中 普遍采用的一些形态、生理、生化、 生态、生活史和血清学反应等指标.
群体：菌落形态，在半固体或液体培养基中的生长状态等

个体：细胞形态，染色反应，各种特殊构造等 营养要求：能源，碳源，氮源，生长因子等 生理、生化反应 酶；产酶种类和反应物性等 代谢产物：种类，产量，显色反应等 经典指标 生态特性：生长温度，对氧的需要，宿主种类等 生活史特点 血清学反应 噬菌体的敏感性 其它

分类学意义：作为建立新分类单元的一项基本特征和把 那些G+C含量差别大的种类排除出某一分类单元。
2.核酸的碱基组成和分子杂交：

与形态及生理生化特性的比较不同，对DNA的 碱基组成的比较和进行核酸分子杂交是直接 比较不同微生物之间基因组的差异，因此结 果更加可信。
DNA-DNA 杂交
DNA 杂交法的基本原理：用 DNA 解链的可逆 性和碱基配对的专一性，将不同来源的 DNA 在体外加热解链，并在合适的条件下，使互 补的碱基重新配对结合成双链 DNA ，然后根 据能生成双链的情况，检测杂合百分数。 如果两条单链 DNA 的碱基顺序全部相同，则 它们能生成完整的双链，即杂合率为 100% 。 如果两条单链 DNA 的碱基序列只有部分相同， 则它们能生成的“双链”仅含有局部单链， 其杂合率小于 100% 。





C：藻类（alga）： 培养螺旋藻，按干重计算每公顷可收获60吨，而种植 大豆每公顷才可获4吨；从蛋白质产率来看，螺旋藻是大 豆28倍。 培养珊列藻，从蛋白质产率计算，每公顷珊列藻所得 蛋白质是小麦的20-35倍。此外，还可通过藻类将CO２转 变为石油，培养单胞藻或其他藻类而获得的石油，可占 细胞干重得5%-50%,合成的油与重油相同，加工后可转 变汽油、煤油、和其他产品。 有的国家已建立培植单胞藻的农场，每年每公顷地培 植的单胞藻按5%干物质为碳水化合物（石油）计算，可 得60吨石油燃料。此项技术的应用，还可减轻因工业生 硅藻 产而大量排放CO２造成的温室效应。 国外还有人从“藻类农场”获取氢能的报道，大量 培养藻类，利用其光合放氢作用来取得氢能。
二、现代分类鉴定方法




分子生物学的发展和各项新技术的广泛应用， 促使微生物分类鉴定工作有了飞速发展。 从经典的表型特征的鉴定深入到现代的遗传学特 性的鉴定、细胞化学组分的精确分析以及利用电子 计算机进行数值分类研究等新的层次上。 （一）微生物遗传型的鉴定 DNA—遗传信息载体。 不同微生物间DNA成分和结构的差异程度代表着它们 间亲缘关系的远近。 测定每种微生物DNA的若干重要数据，是微生物鉴定 中极其重要的指标。


杂合率越高，表示两个 DNA 之间碱基序列的相似 性越高，它们之间的亲缘关系也就越近。 如两株大肠埃希氏菌的 DNA 杂合率可高达 100 ％， 而大肠埃希氏菌与沙门氏菌的 DNA 杂合率较低， 约有 70 ％。 G+Cmol ％的测定和 DNA 杂交实验为细菌种 和属的分类研究开辟了新的途径，解决了以表观特 征为依据所无法解决的一些疑难问题，但对于许多 属以上分类单元间的亲缘关系及细菌的进化问题仍 不能解决。
第二章 发酵工业菌种与种子的扩大培养
第一节 工业生产常用的微生物 一、工业生产常用的微生物* · 从自然界中分离出来就能被利用；
· 对野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。 · 使用重组DNA技术改造的菌株
目前育种总趋势 从野生菌转向变异菌 自然选育转向代谢育种 从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。
形态
经典分类法
经典分类法是一百多年来进行微生物 分类的传统方法。其特点是人为地选择几种 形态生理生化特征进行分类，并在分类中将 表型特征分为主、次。一般在科以上分类单 位以形态特征、科以下分类单位以形态结合 生理生化特征加以区分。