2种方法检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的比较_罗凯

ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｑｍａｎ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ′ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＥＧＦＲ ｅｘｏｎ １９ａｎｄ ２１ｍｕｔａｔｉｏｎｓ（Ｐ＞０．０５）ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｃｏ－ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｅｘｏｎ １９ａｎｄ ２１ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ９６．７％ （５８／６０）ａｎｄ ９８．３％ （５９／６０），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＤＮＡ ｓｅ－
１．２ 仪 器 与 试 剂 测 序 法、Ｔａｑｍａｎ 实 时 荧 光 ＰＣＲ 法 检 测 ＥＧＦＲ 基因１９、２１外显子 基 因 突 变 试 剂 盒 分 别 购 自 北 京 鑫 诺 美迪 科 技 有 限 公 司、北 京 金 菩 嘉 医 疗 科 技 有 限 公 司 ，两 法 对 应 的检测仪器 分 别 为 美 国 ＡＢＩ ３１３０ｘｌ基 因 测 序 仪 和 ＡＢＩ ７５００ ｆａｓｔ实时荧光定量 ＰＣＲ 仪。 １．３ 方 法 １．３．１ 样品前处理 石蜡切片样 品：取 １．５ ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管 １支，加入１ｍＬ 二甲 苯。 依 据 组 织 大 小 与 肿 瘤 细 胞 含 量 取 石 蜡切片６～１５片，每片滴加１～２滴二甲苯，取洁净手术 刀 片 刮 取玻片上组织放入 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管 中，振 荡 混 匀 后 静 置 １０ ｍｉｎ， １２ ０００×ｇ离心５ｍｉｎ，弃上清液。重复以上步骤 用 １ ｍＬ 二 甲 苯洗涤样品１次，加入１ｍＬ 无水乙醇，１２ ０００×ｇ离 心 ５ ｍｉｎ， 弃上清液。再使用无水乙醇重复洗涤样品１次。室温开盖静 置，待无水乙醇彻底 挥 干。７５％ 乙 醇 固 定 组 织 样 品：用 洁 净 手 术刀于 送 检 肿 瘤 组 织 中 做 ４～６ 点 取 样 放 入 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管 中， ７５％乙醇洗涤样品１ 次，弃 上 清 液。 室 温 开 盖 静 置，待 乙 醇 彻 底挥干。 １．３．２ 基因 组 ＤＮＡ 提 取 使 用 天 根 口 腔 拭 子 基 因 组 ＤＮＡ 提取试剂盒，按试剂盒说明书操作步骤提取基因 组 ＤＮＡ，提 取 后测 ＯＤ２６０、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０评估 ＤＮＡ 含量与纯度。 １．３．３ ＤＮＡ 测序突变检测 实验全程设置 阴、阳 性 对 照。 依 据试剂盒说明书，利用 ＰＣＲ 仪扩增 ＥＧＦＲ 基因１９、２１外显子。 扩 增 引 物 如 下 ：１９－Ｆ ５′－ＣＣＴ ＴＡＧ ＧＴＧ ＣＧＧ ＣＴＣ ＣＡＣ ＡＧＣ－
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ； ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ； ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ
肺 癌 是 威 胁 人 类 健 康 的 主 要 恶 性 肿 瘤 之 一 ，非 小 细 胞 肺 癌 （ＮＳＣＬＣ）约占肺癌的８０％以上，很多 ＮＳＣＬＣ 患者在确诊时已 是肺癌晚期，具有较 差 的 预 后［１］。 近 年 来，表 皮 生 长 因 子 受 体 酪氨酸 激 酶 抑 制 剂 （ＥＧＦＲ－ＴＫＩ）类 小 分 子 靶 向 药 物 已 进 入 ＮＳＣＬＣ 患 者 的 临 床 治 疗 并 取 得 良 好 的 疗 效 。 许 多 研 究 表 明［２－４］，ＥＧＦＲ 基 因 酪 氨 酸 激 酶 功 能 区 的 体 细 胞 基 因 突 变 与 ＮＳＣＬＣ 患 者 ＥＧＦＲ－ＴＫＩ靶 向 治 疗 敏 感 性 密 切 相 关，其 中 约 ９０％的突变发生于１９、２１外显子上，ＥＧＦＲ－ＴＫＩ在突变患 者 中 的有效率可达７０％以 上，而 在 非 突 变 患 者 中 有 效 率 仅 １０％ 左 右。因此检 测 ＥＧＦＲ 基 因 １９、２１ 外 显 子 突 变 对 于 指 导 临 床 ＥＧＦＲ－ＴＫＩ对 ＮＳＣＬＣ 患者的靶向治疗具有重要意义。
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国际检验医学杂志２０１３年１月第３４卷第２期 Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１３，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．２
·临床检验研究论著·
２种方法检测非小细胞肺癌 ＥＧＦＲ 基因突变的比较
罗 凯１ ，王 倩２ ，刘 季 芳１ ，潘 东 晓１ ，薛 兴 阳１ ，傅 文 凡１ ，贺 智 敏１△ （１．广 州 医 学 院 肿 瘤 研 究 所／广 州 医 学 院 附 属 肿 瘤 医 院 ，广 东 广 州 ５１００９５；
ＰＣＲ 酶解产物３μＬ、Ｂｉｇｄｙｅ３．１（美 国 ＡＢＩ公 司 ）１μＬ、测 序 引 物 ２μＬ。反应条件为：预变性９６ ℃ １ｍｉｎ；变性９６ ℃ １０ｓ、退 火５０ ℃ ５ｓ、延伸６０ ℃ ４ｍｉｎ，２５个循环；４ ℃恒温保存。测序 反应产物加入醋 酸 钠 乙 醇 溶 液 （３ ｍｏｌ／Ｌ 醋 酸 钠 ∶ 无 水 乙 醇 ＝ １∶１５）１６μＬ，剧烈振荡，避光静置１５ｍｉｎ，４ ℃ １２ ０００×ｇ离心 ３０ｍｉｎ，弃上清液。加７０μＬ ７０％ 预 冷 乙 醇，温 和 颠 倒 混 匀 数 次，４ ℃ １２ ０００×ｇ 离 心 １５ ｍｉｎ，弃 上 清 液。７０％ 预 冷 乙 醇 重 复洗涤１次。室温开盖静置待乙醇挥发干净，加入１０μＬ 高 去 离子甲酰胺后置 ＰＣＲ 仪 上 变 性：９５ ℃ ４ ｍｉｎ，４ ℃ ４ ｍｉｎ，上 ＡＢＩ ３１３０ｘｌ测序仪测序。所得 序 列 图 采 用 Ｃｈｒｏｍａｓ２．２３ 软 件 通过与 ＮＣＢＩ基因库标准序列比对，分析测序结果。
１．３．４ Ｔａｑｍａｎ实时荧光 ＰＣＲ 突变检测 按试剂盒说明书配
制双重荧光 ＰＣＲ 反 应 体 系，１９ 外 显 子 检 测 ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０、ｄｅｌ
Ｌ７４７－Ｐ７５３ｉｎｓＳ两种突 变 类 型，２１ 外 显 子 检 测 Ｌ８５８Ｒ、Ｌ８６１Ｑ
两种突变类型，实验设置阴、阳性对照和空白对照。反应条 件：
作者简介：罗凯，男，主管检验师，主要从事肿瘤靶向治疗与耐药研究。 △ 通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｅｚｈｉｍｉｎ２００５＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ。
国际检验医学杂志２０１３年１月第３４卷第２期 Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１３，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．２
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３′，１９－Ｒ ５′－ＣＡＴ ＴＴＡ ＧＧＡ ＴＧＴ ＧＧＡ ＧＡＴ ＧＡＧ Ｃ－３′；２１－Ｆ ５′－ＣＡＧ ＣＣＡ ＴＡＡ ＧＴＣ ＣＴＣ ＧＡＣ ＧＴＧ－３′，２１－Ｒ ５′－ＴＣＣ ＴＣＣ ＣＣＴ ＧＣＡ ＴＧＴ ＧＴＴ ＡＡＡ Ｃ－３′。ＰＣＲ 反 应 条 件 为： ９４ ℃ ２ｍｉｎ；９４ ℃ １５ｓ，５５ ℃ ３０ｓ，７２ ℃ ４５ｓ，４５ 个 循 环；７２ ℃ ７ｍｉｎ。取 ＰＣＲ 产物５μＬ 加入２μＬ ＳＡＰ 酶混合物混匀，３７ ℃ １ｈ，８０ ℃ １５ｍｉｎ。酶解产物做双向测序反应，以 ＰＣＲ 上下 游扩增引物分别作 为 正、反 向 测 序 引 物。 测 序 反 应 体 系 如 下：
ＣＴ≤３８判断为可疑 样 品 需 重 复。 所 有 阴 性 样 品 ＰＣＲ 产 物 均
进 行 ２％ 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 排 除 假 阴 性 。
５０ ℃ ２ｍｉｎ；９５ ℃ １０ｍｉｎ；９５ ℃ １５ｓ，６２ ℃ １ｍｉｎ，４０个循环。
结果判读：首先空白对照、阴性对照无扩增曲线，阳性对照出 现
扩增曲线，实验有效。然后未出现扩增 曲 线 或 ＣＴ＞３８ 判 断 为
阴性样 品，出 现 扩 增 曲 线 且 ＣＴ≤３４ 判 断 为 阳 性 样 品，３４＜
２．广州市中医医院病理科，广东广州 ５１０１３０）
摘 要：目的 比较测序法和 Ｔａｑｍａｎ实时荧光 ＰＣＲ 法检测 表 皮 生 长 因 子 受 体（ＥＧＦＲ）基 因 １９、２１ 外 显 子 基 因 突 变 的 一 致
性，为寻找适宜临床应用的 ＥＧＦＲ 基因突变检测方法提供实验依据。方法 收集 ６０ 例 非 小 细 胞 肺 癌 患 者 肿 瘤 组 织，应 用 测 序 法
和 Ｔａｑｍａｎ实时荧光 ＰＣＲ 法分别检测 ＥＧＦＲ 基因１９、２１外显子基因突变，比较两种方法的有效性。结果 两法检测 ＥＧＦＲ 基因
１９、２１外显子突变结果符合率分别为９６．７％（５８／６０）和９８．３％（５９／６０），差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论 ２种方法均可用 于
ＥＧＦＲ 基因１９、２１外显子突变检测，测序法更适合指导临床分子靶向治疗。
目前临床应用的检测 ＥＧＦＲ 基 因 突 变 的 方 法 主 要 为 测 序 法和实时荧光 ＰＣＲ 法，其 中 实 时 荧 光 ＰＣＲ 法 又 分 为 Ｔａｑｍａｎ 实时荧光 ＰＣＲ 法、特 异 引 物 双 扩 增 荧 光 ＰＣＲ 法 等 亚 类，上 述 方法各有 优 缺 点。 本 研 究 选 择 临 床 常 用 的 测 序 法 和 Ｔａｑｍａｎ 实时荧光 ＰＣＲ 法 检 测 ６０ 例 ＮＳＣＬＣ 患 者 肿 瘤 组 织 ＥＧＦＲ 基 因１９、２１外显子突变 情 况，并 分 析 结 果 间 的 差 异，旨 在 为 临 床 选择合适的 ＥＧＦＲ 基因突变检测方法提供实验依据。 １ 资 料 与 方 法 １．１ 一 般 资 料 收 集 ２０１１ 年 广 州 医 学 院 附 属 肿 瘤 医 院 ＮＳＣＬＣ 患 者 肿 瘤 组 织 样 品 ６０ 例，其 中 石 蜡 切 片 样 品 ４２ 例， ７５％乙醇固定组织样 品 １８ 例；男 性 ３７ 例，女 性 ２３，年 龄 ３４～ ７８ 岁 ，中 位 年 龄 ５８ 岁 。
关 键 词 ：受 体 ，表 皮 生 长 因 子 ； 基 因 测 序 ； 聚 合 酶 链 反 应
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－４１３０．２０１３．０２．０１６
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１６７３－４１３０（２０１３）０２－０１６２－０３
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＧＦＲ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｙ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ Ｌｕｏ Ｋａｉ１，Ｗａｎｇ Ｑｉａｎ２，Ｌｉｕ Ｊｉｆａｎｇ１，Ｐａｎ Ｄｏｎｇｘｉａｏ１Ｚｈｉｍｉｎ１△ （１．Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｎｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ５１００９５，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ５１０１３０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｑｍａｎ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＥＧＦＲ ｅｘｏｎ １９ａｎｄ ２１ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｏｒ－ ｄｅｒ ｔｏ ｆｉｎｄ ａ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＥＧＦＲ ｅｘｏｎ １９ａｎｄ ２１ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ６０ｎｏｎ－