蛋白质浓缩问题——超滤浓缩管的使用及保存

二、离心超滤管浓缩样品

2.1 浓缩样品

1、要浓缩的样品含盐量必须0.3M以上，含盐量低的样品须补加到0.3MNaCl。

2、在内管（附有3KD膜）中加入500µl样品，将内管套入外管。

3、对称放置离心管，14520rpm(即14000g)离心。（离心5min约浓缩2倍，10min约4倍，15min约6倍，20min约8倍，30min约10倍）。

4、离心结束后，将内管倒置套在另一个干净的离心管呢，3880rpm离心min收集浓缩后的样品。或者用移液器直接吸出内管中的样品。

2.2 浓缩管使用后的处理和保存

1、使用完的浓缩管，立即加入500µl含1MNaCl的缓冲液（此缓冲液与浓缩样品的缓冲液一致），8000rpm离心20min。

2、甩净内管中的盐溶液，将内管放入超纯水中浸泡1h。

3、内管加入超纯水500µl，8000rpm离心5min。

4、甩净内管中的水，加入500µl0.2MNaOH，8000rpm离心20min。

5、甩净内管中的NaOH溶液，用超纯水再8000rpm离心5min。

6、甩净内管中的水，放入含0.2-0.5‰NaN3的生理盐水中。

7、外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。

超滤管使用注意事项

2012-06-06 18:12:28| 分类：默认分类| 标签：|字号大中小订阅

蛋白浓缩和换Buffer通常使用的超滤管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超滤管（MWCO10kD）。也有其它型号的、不同体积大小和MWCO超滤管可选，视目的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩目标体积而定。可重复使用，使用一次就扔掉太浪费。以下是个人总结的使用方法和注意事项。

1、选择合适的超滤管，主要考虑MWCO和浓缩体积，最常见的是Ultra-15（10kD）。到底选择多大截留分子量比较合适呢？10kDa、5kDa、还是30kDa？通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为35kDa，就可以选择10kDa截留分子量的超滤管。若目的蛋白分子量为10kD左右，则可以用截留分子量3kD的超滤管。认真阅读使用说明书，注意超滤膜对各种化学物质的耐受程度有所不同，表格中有。

2、新买来的超滤是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全过膜，冰浴或冰箱里预冷几分钟。然后将水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超过管顶的白线为准。操作要轻，加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。

3、平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快，否则直接损坏超滤膜。开始离心超滤（离心机预冷至4度）。不同离心机的转速rpm换算成g之后，有所不同。具体可参阅附件里的说明书。离心机的加速度调至最低档，减小对膜的压力。注意，一定要等离心机达到目的转速之后，方可离开离心机，否则离心机出问题时，无法第一时间处理，后果不可预测！膜与转轴的方向根据说明书调整（角转离心机的情况是膜与轴垂直）。在实际使用中，一般转速开的比说明书里的要低，这样可以延长离心管的使用寿命。

4、当浓缩到剩下1ml时，取50ul国产Bradford溶液，加入10ul流穿，看有没变蓝色，以此判断超滤管

是否漏掉蛋白。如果管漏了，将上层和流穿重新倒入新管中开始超滤。要精确判断是否漏管，用5mgml 的BSA离心10min，再取流穿，跑蛋白胶或Bradford粗测，继续加入剩下的蛋白液浓缩（在冰上操作，防止蛋白受热），直到所有浓缩液都加完为止。离心过程中注意是否发生蛋白沉淀，导致堵管。若发生沉淀，要确定沉淀的具体原因，是蛋白浓度过高还是Buffer不合适；前者可用多根超滤管同时超滤，降低浓度的办法解决，后者的方法是换不同的Buffer，直到蛋白不发生沉淀为止。

5、前面几步用以浓缩蛋白，如果要换Buffer，在总蛋白液浓缩至1ml左右的时候，轻轻加入新的Buffer （经0.22um超滤膜超滤），再浓缩至1ml左右，连续三次，最后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定，一般不多于500ul，也有浓缩至200ul以内的情况。按照每次至少10倍左右的体积浓缩算，三次达到1000倍以上，基本上可以达到换buffer的目的。