门冬酰胺酶的测定 SEC 球状蛋白亲水改性硅胶柱 中国药典指定 体积排组 液相色谱图 液相分析 HPLC
胞内门冬酰胺酶实验讲义 (中文版)
实验一重组表达门冬酰胺酶II工程菌的构建【实验目的】1. 了解构建重组质粒的原理2. 掌握质粒提取方法、PCR技术、酶切等基本技术方法【实验原理】门冬酰胺酶，别名L-门冬酰胺酶、天冬酰胺酶或天门冬酰胺酶。
L-天冬酰胺是细胞合成蛋白质的必需氨基酸。
肿瘤细胞中的天冬酰胺合成酶含量非常低，故自身不能合成L-天冬酰胺，需依赖外源L-天冬酰胺才能生存。
而L-天冬酰胺酶可通过降解L-天冬酰胺从而抑制肿瘤细胞中蛋白质的正常合成，导致肿瘤细胞的死亡。
人体内正常细胞则因能自身合成L-天冬酰胺，所以受L-ASP的影响较小。
故L-ASP可用于急性淋巴细胞白血病的治疗。
目前临床上使用的L-ASP 泛指来源于大肠杆菌的 E.coli L-ASP II。
从1974年天津生化制药厂开始生产L-ASP，到1995年吴梧桐教授等进行的E.coli天冬酰胺酶ansB基因的克隆和表达研究，并首次在国内成功构建了高效表达L-ASP的基因工程菌pKA/ CPU210009，工程菌发酵单位比野生株高出100倍。
随后又优化了基因工程菌的培养条件和发酵工艺，确定了重组L-ASP 的纯化路线，并对重组产品进行了鉴定。
L-ASP的制备纯化工艺越来越成熟，这些研究成果为我国工业化生产优质、低价的注射用E. coli L-ASP开辟了新的道路。
聚合酶链式反应，简称PCR。
聚合酶链式反应是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，利用DNA变性和复性的特点，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
双酶切：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
两种门冬酰胺酶效价检测方法的比较
两种门冬酰胺酶效价检测方法的比较作者：郭睿来源：《中国化工贸易·中旬刊》2018年第10期摘要：L-门冬酰胺酶（Asparaginase）是一种被收录进《中国药典》2015年版用于治疗小儿急性白血病的药物。
在《中国药典》2015年版中用于检测其效价的是比色法。
但出现用反相高效液相色谱法检测效价的方法，通过试验发现反相高效液相色谱法不能用于门冬酰胺酶效价检测。
关键词：L-门冬酰胺酶;效价检测L-门冬酰胺酶（Asparaginase）是一种被收录进《中国药典》2015年版[1]用于治疗临床主要用于急性淋巴细胞性白血病，也用于急性粒细胞性白血病，急性单核细胞性白血病和恶性淋巴瘤的药物。
因淋巴肿瘤细胞不能自身合成对生长必要的氨基酸门冬酰胺，必须依赖宿主供给，而门冬酰胺酶能使门冬酰胺水解，使细胞缺乏门冬酰胺，从而抑制其生长的作用。
正常细胞由于能够自主合成门冬酰胺，故受影响较少。
在《中国药典》2015年版中，对于L-门冬酰胺酶的活性测定方法为终点法，即是考察一定量的蛋白酶在一定时间内水解酰胺基产生的游离铵离子的量，再将碘化汞钾与氨反应生成黄色溶液用比色法测定，根据氨量计算酶的效价。
并规定每1 mg蛋白含门冬酰胺酶的活力不得低于250单位。
我公司的一家印度客户则提供另一种利用反相高效液相色谱法来测定门冬酰胺酶的效价。
本文主要对这两种方法进行分析研究，探索L-门冬酰胺酶效价更高效、更准确的测定方法。
1 《中国药典》2015年版中门冬酰胺酶效价检测方法1.1 试验材料与方法1.1.1 试验仪器紫外-可见分光光度计、恒温水浴锅、105℃鼓风干燥箱、电子天平（感量为0.1mg）、秒表、容量瓶、吸量管、进样器。
1.1.2 试剂与药品试剂：0.1mol/L磷酸氢二钠、0.1mol/L磷酸二氢钠、25%三氯醋酸溶液、0.0015mol/L硫酸铵溶液;药品：门冬酰胺酶（常州千红生化制药股份有限公司，批号：47170531008C）。
03注射用门冬酰胺酶(3)
实验方法：双向电泳法是等电聚焦和SDS-PAGE的组合，即先
进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE
（按照蛋白质分子量大小分离），经染色得到的电泳图是个二
维分布的蛋白质图。
杂蛋白的蛋白质组学研究
常州千红 北京双鹭
等电聚焦电泳凝胶图
结果：以上三种电泳方法结果均提示常州千红杂蛋白种类较少，北京双鹭药业生
64.39 425.2221
%
28.84 824.4131 31.33 744.4053
61.74 1587.0054
62.16 1452.2441
0.84 122.0795 30.19 715.0424 25.49 813.6521 26.73 680.8302
35.81 962.2356 31.96 1113.2075 35.33 36.59 962.4792 622.3429 34.87 840.6744
基本信息
• 处方及工艺
生产企业 常州千红 原辅料名称 甘露醇 甘露醇 磷酸二氢钠 磷酸氢二钠 处方 辅料 辅料 辅料 辅料 加入的目的 赋形剂 赋形剂 pH值缓冲剂 pH值缓冲剂
北京双鹭
常州千红 关键工艺
原料药生产工艺路线
菌种发酵收集 破碎粗提
DEAE层析 疏水层析 精制浓缩 超滤冻干
制剂生产工艺（两个厂家基本一致）
26.95 566.3262
35.95 783.5020
64.20 597.0862 25.07 622.8218 29.18 547.2847 29.70 507.2858
23.49 648.3783
0 2.00 20140822-001 100
门冬酰胺酶
【成份】本品主要成份为门冬酰胺酶，来源于大肠杆菌中提取制备的具有酰胺基水解作用的酶。
辅料：甘露醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠。
【性状】本品为白色冻干块状物或粉末。
【适应症】适用于治疗急性淋巴细胞性白血病(简称急淋)、急性粒细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金病及非霍奇金病淋巴瘤、黑色素瘤等。
本品对上述各种瘤细胞的增殖有抑制作用，其中对儿童急淋的诱导缓解期疗效最好，有时对部分常用化疗药物缓解后复发的患者也可能有效，但单独应用时缓解期较短，而且容易产生耐药性，故多与其他化疗药物组成联合方案应用，以提高疗效。
【规格】（1）5000单位（2）10000单位【用法用量】根据不同病种，不同的治疗方案，本品的用量有较大差异。
以急淋的诱导缓解方案为例：剂量可根据体表面积计，日剂量500单位／m2，或1000单位／m2，最高可达2000单位／m2；以10～20日为一疗程。
【不良反应】成人较儿童多见。
1、较常见的有过敏反应、肝损害、胰腺炎、食欲减退，凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ及纤维蛋白原减少等，过敏反应的主要表现为突然发作的呼吸困难、关节肿痛、皮疹、皮肤瘙痒、面部水肿，严重者可发生呼吸窘迫、休克甚至死亡。
在用肌注给药的晚期儿童白血病，虽其轻度过敏反应的发生率较高，但有报告认为其严重过敏反应的发生率较静注给药低。
过敏反应一般在多次反复注射者易发生，但曾有皮内敏感试验(简称皮试)阴性的患者发生。
另有某些过敏体质者，即使注射做皮试剂量的门冬酰胺酶时，偶然也会产生过敏反应。
肝脏损害通常在开始治疗的2周内发生，可能出现多种肝功能异常，包括血清丙氨酸氨基转移酶[ALT(SGPT)]、门冬氨酸氨基转移酶[AST(SGOT)]、胆红素等升高、血清白蛋白等降低，曾有经肝穿刺活检证实有脂肪肝病变的病例。
患者如感觉剧烈的上腹痛并伴有恶心、呕吐，应疑有急性胰腺炎，其中暴发型胰腺炎很危重，甚至可能致命。
其他尚有恶心、呕吐、腹泻等。
门冬酰胺酶的制备与分析
重组天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定赵雅嫱黄妤璠龙益如王敏敏白华山1 原理本实验主要是利用基因工程手段构建L-天冬酰胺酶基因工程菌。
L-天冬酰胺酶的生理作用主要体现于其抗癌抗肿瘤活性，特别是对非霍奇金淋巴瘤和ALL 的有很强的抑制作用，目前适用于治疗黑色素瘤、非何杰金病淋巴瘤等，也可以用于治疗急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病等。
目前，我国虽已投入生产L-天冬酰胺酶，但是较国外生产成本高、菌种产酶活性低，提取纯化工艺落后。
针对这些问题，本实验对大肠杆菌重组L-天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定进行了系统性的探究，意图改进重组L-天冬酰胺酶的表达，优化其纯化工艺，分析其鉴定方法与性质。
本实验主要进行了重组克隆载体和表达载体构建、表达与鉴定的摸索；酶蛋白的诱导表达条件分析；酶蛋白分离纯化手段的比较和选择，如蔗糖溶液提取、硫酸铵分级沉淀、CM-Sephadex和DEAE-Sepharose 离子交换层析以及亲和层析；重组蛋白酶活力监控与本底蛋白活力测定等等。
2 实验材料实验仪器见表1.1。
型号和生产厂家根据实验室现有条件核定。
表1.1 实验仪器或装置仪器名称型号生产厂家超净工作台PCR扩增仪恒温培养箱超低温冰箱台式离心机恒温摇床涡轮振荡器高压灭菌锅蛋白电泳仪核酸电泳仪凝胶成像仪紫外分光光度计高效液相色谱仪扫描型紫外分光光度计制冰机超声清洗机实验试剂和材料见表1.2。
材质或规格以及来源根据实验需求以及实验室现有条件核定。
表1.2 试剂和材料试剂或材料材质或规格来源E.coli 野生型菌株CPU21009 实验室储存pMD18-T 50ng/μl 宝生物工程有限公司pET-22b 50ng/μl 宝生物工程有限公司Nde Ⅰ10U/μl 宝生物工程有限公司Xho Ⅰ10U/μl 宝生物工程有限公司T4 DNA Ligase 350U/μl 宝生物工程有限公司DNA纯化试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司Ni-NTA树脂纯化试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司质粒提取试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司胶回收试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司CaCl260mmol/L 实验室储存PBS 50x 实验室储存NaCl 分析纯Taq 酶 Mix 分析纯(NH4)2S2O8分析纯C 2H6OS 分析纯CH4O 分析纯冰乙酸分析纯C 2H6O 分析纯氨基丁三醇分析纯考马斯亮蓝分析纯SDS 分析纯Nessler's 试剂Reagent,ACS 美国Spectrum公司酵母粉分析纯L-天冬酰胺分析纯英国OXOID公司蛋白胨分析纯甘氨酸分析纯琼脂糖分析纯葡萄糖食品级TEMED 优级纯溴酚蓝分析纯IPTG 优级纯丙三醇分析纯3 实验思路与步骤本实验设计从大肠杆菌野生型菌株CPU210009中提取总DNA，通过PCR 扩增目的基因ansB，随后对PCR产物进行纯化。
门冬酰胺酶
【成份】本品主要成份为门冬酰胺酶，来源于大肠杆菌中提取制备的具有酰胺基水解作用的酶。
辅料：甘露醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠。
【性状】本品为白色冻干块状物或粉末。
【适应症】适用于治疗急性淋巴细胞性白血病(简称急淋)、急性粒细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金病及非霍奇金病淋巴瘤、黑色素瘤等。
本品对上述各种瘤细胞的增殖有抑制作用，其中对儿童急淋的诱导缓解期疗效最好，有时对部分常用化疗药物缓解后复发的患者也可能有效，但单独应用时缓解期较短，而且容易产生耐药性，故多与其他化疗药物组成联合方案应用，以提高疗效。
【规格】（1）5000单位（2）10000单位【用法用量】根据不同病种，不同的治疗方案，本品的用量有较大差异。
以急淋的诱导缓解方案为例：剂量可根据体表面积计，日剂量500单位／m2，或1000单位／m2，最高可达2000单位／m2；以10～20日为一疗程。
【不良反应】成人较儿童多见。
1、较常见的有过敏反应、肝损害、胰腺炎、食欲减退，凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ及纤维蛋白原减少等，过敏反应的主要表现为突然发作的呼吸困难、关节肿痛、皮疹、皮肤瘙痒、面部水肿，严重者可发生呼吸窘迫、休克甚至死亡。
在用肌注给药的晚期儿童白血病，虽其轻度过敏反应的发生率较高，但有报告认为其严重过敏反应的发生率较静注给药低。
过敏反应一般在多次反复注射者易发生，但曾有皮内敏感试验(简称皮试)阴性的患者发生。
另有某些过敏体质者，即使注射做皮试剂量的门冬酰胺酶时，偶然也会产生过敏反应。
肝脏损害通常在开始治疗的2周内发生，可能出现多种肝功能异常，包括血清丙氨酸氨基转移酶[ALT(SGPT)]、门冬氨酸氨基转移酶[AST(SGOT)]、胆红素等升高、血清白蛋白等降低，曾有经肝穿刺活检证实有脂肪肝病变的病例。
患者如感觉剧烈的上腹痛并伴有恶心、呕吐，应疑有急性胰腺炎，其中暴发型胰腺炎很危重，甚至可能致命。
其他尚有恶心、呕吐、腹泻等。
中国药典-2019年版仪器分析方法应对精品文档
甲氨蝶呤
甲氨蝶呤片
牛血清白蛋白键合硅胶柱
注射用甲氨蝶呤
12
色谱法的应用：高效液相色谱
2019版药典主要修订项目
1、色谱柱 （1）常用色谱柱填料粒径3～10μm （2）微径柱填料粒径 约2μm（UPLC或UFLC） 硬件须匹配 色谱条件可适当调整 以品种正文规定条件的测定结果为准
2、柱温 （1）通常为室温 （2）以硅胶为载体的普通色谱柱，最高使用温度不得超过60℃，（HTLC）
注射用头孢替唑钠
头孢噻吩钠 注射用头孢噻吩钠 头孢噻肟钠 注射用头孢噻肟钠 阿洛西林钠 注射用阿洛西林钠 普鲁卡因青霉素 注射用普鲁卡因青霉素
阿莫西林 阿莫西林胶囊 青霉素V钾 青霉素V钾胶囊 青霉素钠
注射用青霉素钠
青霉素钾 注射用青霉素钾 苯唑西林钠 注射用苯唑西林钠 美洛西林钠 注射用美洛西林钠 磺苄西林钠 注射用磺苄西林钠
HPLC法
2019年版
530 0
142
24 4 315 165 107 216 359
2019年版
580 73
707
97 45 414 219 132 372 694
4
色谱法在2019年版药典的应用
柱色谱 纸色谱 薄层色谱 气相色谱
• 高效液相色谱 • 离子色谱
正相色谱 反相色谱 离子对色谱
63.6
6.9
6.7
83.0
7.0
6.2
84.3
7.7
6.0
81.4
5.8
4.3
15.2
4.3
4.8
14.8
5.2
4.3
14.3
6.2
6.9
81.5
8.0%
注射用门冬酰胺酶效价测量的不确定度评定
注射用门冬酰胺酶效价测量的不确定度评定谢鹏【摘要】目的:对门冬酰胺酶效价测量的不确定度进行评定.方法:分析了门冬酰胺酶效价测量过程中几种因素对门冬酰胺酶效价测定不确定度的影响,其中包括:重复性测量,对照品和样品的稀释体积及使用仪器等测量因素并进行了评定,由此计算合成不确定度,最终给出测量在95%置信区间下的扩展不确定度.结果:本实验测量结果为(10495.29±165.82)IU/瓶(K=2).结论:分析并量化了检测方法的不确定度,为优化实验方法提供科学依据.【期刊名称】《广东轻工职业技术学院学报》【年(卷),期】2011(010)001【总页数】5页(P18-21,32)【关键词】门冬酰胺酶;效价;不确定度【作者】谢鹏【作者单位】广州市微生物研究所,广东,广州,510250【正文语种】中文【中图分类】R9测量不确定度[1]是表征合理地赋予被测量值的分散性,与测量结果相关联的参数。
是评定测量结果可信度的依据,在药品质量分析检验中对一个试验的方法以及整个过程进行测量不确定度的量化有助于分析各种不确定度来源对试验结果产生的影响,对药物分析检验具有实际的重要意义。
根据《测量不确定评定与表示》[2],并参考《化学分析中不确定度的评估指南》[3],对按 2010年版《中国药典》[4]检测门冬酰胺酶效价的方法过程产生的不确定度分量进行评定,以提高测定结果的准确性与可靠性,同时为优化实验方法提供科学依据。
1.1.1 仪器752N紫外可见分光光度计:上海精密仪器科技有限公司。
电子天平:日本 AND株式会社。
实验室所用的玻璃器皿均为天玻牌A级。
1.1.2 试药注射用门冬酰胺酶 (批号:100601):规格:10000 IU/瓶,广州市明兴制药有限公司。
门冬酰胺:美国 sigm a公司。
三氯醋酸,硫酸铵,碘化汞,碘化钾,磷酸氢二钠均购于广州化学制剂厂。
1.2.1 磷酸盐缓冲液取 0.1mo l/L磷酸氢二钠溶液适量,用 0.1mo l/L磷酸二氢钠溶液调节 pH值至 8.0。
中国药科大学生物制药工艺学实验设计
将涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上长出的单菌落用牙签逐个挑入方格化的新鲜LB培养基上，为每个克隆编号。平板37°C温箱中过夜，待菌落形成后用灭菌牙签逐个挑选少量菌体，移入预先加有0.1mmol/L硼酸缓冲液（ph 8.4）50ul的酶标板反应孔里，待菌体分散后每孔加入0.04mmol/L天门冬酰胺底物溶液50ul，37°C保温15min，加入奈氏试剂50ul，呈深红棕色孔内相应的单菌落即为阳性转化子。
实验材料:
CPU 210009菌体，1% TrioX-100，2mmol/LTris-HCl PH8.5，2mmol/L EDTA，引物E1E2， Mgcl2, dNTP,Taq DNA聚合酶
pET28a载体，Ncol, Hind I ,ddH2O,T4DNA连接酶，Taq酶，CaCl2,
溶菌酶，硫酸铵，50mmol/L,ph7.0磷酸缓冲液，ph7.6的磷酸缓冲液，50mmol/L，ph5.2的磷酸缓冲液，0.1mol/L硼酸缓冲液,奈氏试剂，蒸馏水等
3.4发酵培养：
配制培养基：
牛肉膏5g
蛋白胨10g
NaCl5g
琼脂15-20g
水1000ml
PH7.41
高压蒸汽灭菌20分钟
筛选后呈阳性的重组工程菌于斜面培养基上培养24h,温度保持37℃。
菌种经过斜面培养后，接种到液体培养基中，于37℃、250r/min下摇瓶培养16h。
4.重组酶的分离纯化：
4．1蔗糖溶液抽提
酶活力（µ/ml）=【样品的氨浓度（mol/ml）- 对照的氨浓度（mol/ml）】/（3*10^3）
参考文献
[1]吴晓英，吴振强，林影，夏枫耿.L-天冬酞胺酶的研究进展[J] 广东药学2003年第13卷第6期
酶类药物的分析
蛋白分解酶
胰酶
猪、羊或牛胰中提取的酶混合物
粉剂
助消化药
胰酶肠溶片 胰酶肠溶胶囊
胰激肽原酶 凝血酶冻干粉
糜蛋白酶 注射用糜蛋白酶
胰酶 胰酶 猪胰中提取 牛血或猪血中提取的凝血酶原 牛或猪胰中提取 糜蛋白酶
片剂 胶囊剂
粉剂 冻干粉剂
粉剂 冻干粉剂
助消化药 助消化药 血管舒张药 局部止血药 蛋白分解酶 蛋白分解酶
一、影响因素
1、底物 2、pH 3、温度 4、酶浓度 5、空白和对照
27
底物
酶可以同时作用多个底物。 以Km最小者作为此酶的生理底物。
从底物性质看，选用的底物最好在物理化学性质 上与产物不同，利于测定。
从底物浓度看，为不使酶反应受到它的控制，反 应系统应使用足够高的底物浓度。
28
猪、羊或牛胰中提取 胰蛋白酶
猪、羊或牛胰中提取的酶混合物
胰酶 胰酶 猪胰中提取 牛血或猪血中提取的凝血酶原 牛或猪胰中提取 糜蛋白酶
剂型 粉剂 冻干粉剂 粉剂 冻干粉剂 粉剂 冻干粉剂 粉剂 冻干粉剂 溶液 注射剂 冻干粉剂 粉剂 冻干粉剂 粉剂 片剂 颗粒剂 粉剂 粉剂 冻干粉剂 粉剂
片剂 胶囊剂 粉剂 冻干粉剂 粉剂 冻干粉剂
类别 抗肿瘤药 抗肿瘤药 抗肿瘤药 抗肿瘤药 蛋白酶抑制剂 蛋白酶抑制剂
溶栓药 溶栓药 细胞代谢改善药 细胞代谢改善药 细胞代谢改善药 黏多糖分解酶 黏多糖分解酶 助消化药 助消化药 助消化药 助消化药 蛋白分解酶 蛋白分解酶 助消化药
助消化药 助消化药 血管舒张药 局部止血药 蛋白分解酶 蛋白分解酶
胰酶
胰酶肠溶片 胰酶肠溶胶囊 胰激肽原酶 凝血酶冻干粉
糜蛋白酶 注射用糜蛋白酶
来源 大肠埃希菌提取 门冬酰胺酶（埃希）