乙型肝炎病毒_ayw型_转基因小鼠的建立_雷章恒
转基因小鼠的构建
转基因小鼠的构建
转基因小鼠的构建主要涉及到显微注射法或利用DNA转座子系统提高转基因的表达阳性率。
以下是具体的步骤：
1.准备阶段：选择适合构建转基因小鼠的受体小鼠，如7~8周龄雌性小鼠，并进行相应的生理调整，
如注射PMSG和HCG。
2.受精卵的获取：通过手术从供体小鼠的输卵管中取出受精卵，并在适当的培养条件下进行培养。
3.转基因操作：在显微镜下，将线性化的外源DNA片段或构建到转座子质粒中的外源待表达的DNA
片段，通过显微注射法直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到小鼠基因组中。
4.受体小鼠的准备：将受体小鼠麻醉后，进行受精卵的移植。
5.转基因小鼠的筛选和鉴定：通过PCR等方法对转基因小鼠进行筛选和鉴定，确认外源基因已经成
功整合到小鼠基因组中，并且能够过量表达。
需要注意的是，转基因小鼠的构建过程需要高度的专业知识和技术，同时还需要遵守相关的伦理和法规。
因此，在进行转基因小鼠的构建前，需要充分了解相关的知识和技术，并遵循相关的规定和指导原则。
rAAV8-HBV1.3病毒用于建立HBV小鼠模型[发明专利]
![rAAV8-HBV1.3病毒用于建立HBV小鼠模型[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/125bb0caed630b1c58eeb59d.png)
专利名称：rAAV8-HBV1.3病毒用于建立HBV小鼠模型专利类型：发明专利
发明人：董小岩,吴小兵,董哲岳,谭文杰
申请号：CN201010216797.0
申请日：20100705
公开号：CN102311974A
公开日：
20120111
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种rAAV8－HBV1.3病毒用于建立HBV小鼠模型。
本发明将携带了多拷贝HBV基因组DNA的重组AAV病毒用于制作小鼠慢性乙型肝炎模型。
所使用的HBV小鼠模型动物为免疫系统正常的C57BL/6小鼠和/或Balb/c小鼠。
将重组AAV病毒通过小鼠尾静脉注射到小鼠体内，重组AAV病毒可感染小鼠的肝脏组织细胞，重组AAV病毒所携带的HBV基因组DNA自主复制产生子代HBV，后者与机体免疫系统共同作用造成了小鼠慢性乙型肝炎模型。
重组AAV病毒所包装的HBV的亚型为ayw亚型或adw、adr、ayr亚型。
申请人：北京五加和分子医学研究所有限公司,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
地址：100176 北京经济技术开发区宏达北路12号B座三区3415号
国籍：CN
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乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立及培育
乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立及培育熊俊;訾晓渊;姚玉成;金艳花;李建秀;朱海英;王新民;胡以平;余宏宇【期刊名称】《第二军医大学学报》【年(卷),期】2002(23)11【摘要】目的:建立可表达乙型肝炎病毒X蛋白的HBx基因(adr亚型)转基因小鼠模型,以研究x基因的功能。
方法:采用基因重组技术构建含有CMV启动子和HBx 基因(adr亚型)开放阅读框(ORF)的真核表达载体pcDNA3-HBx。
该载体经Sal I 限制性内切酶线性化后,琼脂糖电泳回收目的片段,用原核显微注射法将其注射入雄原核,制备转基因小鼠。
复合PCR法在基因组水平筛选HBx基因转基因小鼠founder;免疫组织化学法在蛋白水平检测X蛋白在这些小鼠中的表达情况。
结果:成功构建了HBx基因真核表达载体pcDNA3-HBx。
经原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后,出生并存活了11只新生鼠,经PCR检测后获得5只founder转基因小鼠,命名为C57-TgN(HBx)SMMU。
免疫组织化学检测发现5只PCR阳性小鼠的肝细胞质中均有X蛋白的表达。
将这5只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配,进行传代培育,复合PCR法筛选阳性转基因小鼠,目前已传至F4代。
结论:本研究成功地产生了稳定遗传HBx基因并表达X蛋白的转基因小鼠C57-TgN(HBx)SMMU,它将有利于体内研究HBx基因在肝细胞癌发生中的作用。
【总页数】4页(P1184-1187)【关键词】乙型肝炎病毒;X蛋白;转基因小鼠;HBx基因【作者】熊俊;訾晓渊;姚玉成;金艳花;李建秀;朱海英;王新民;胡以平;余宏宇【作者单位】第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室;长征医院病理科【正文语种】中文【中图分类】R373.21【相关文献】1.乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠的建立 [J], 刘红;张钦宪;胡以平2.人乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立 [J], 屠亚军;琦祖和;杨鹏3.乙型肝炎病毒X基因转基因小鼠模型的建立及其应用研究进展 [J], 毛华伟;赖国旗4.乙型肝炎病毒(adr亚型)preS2-S基因转基因小鼠的建立 [J], 苏小平;姚玉成;訾晓渊;赵书民;熊俊;李建秀;王新民;丁佳;许燕;余宏宇;胡以平5.乙型肝炎病毒X基因转基因小鼠的建立及其表型分析 [J], 熊俊;訾晓渊;姚玉成;李建秀;刘厚奇;胡以平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒、乙肝病毒小鼠模型的建立方法
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110034255.X(22)申请日 2021.01.11(71)申请人 武汉大学地址 430072 湖北省武汉市武昌区八一路299号(72)发明人 夏宇尘 李聪 钟有权 (74)专利代理机构 北京金智普华知识产权代理有限公司 11401代理人 杨采良(51)Int.Cl.C12N 7/01(2006.01)C12N 15/36(2006.01)C12N 15/864(2006.01)A01K 67/027(2006.01)(54)发明名称一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒、乙肝病毒小鼠模型的建立方法及应用(57)摘要本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于S基因断裂的AAV ‑HBV重组病毒、乙肝病毒小鼠模型的建立方法及应用。
本发明采用同源重组的方法构建pAAV ‑HBV1.04质粒，通过三质粒共转染293T细胞方法体外包装生产重组病毒。
用重组病毒通过尾静脉注射免疫系统正常的C57BL/6小鼠形成HBV cccDNA持续存在的HBV慢性感染小鼠模型。
本发明中的小鼠模型能产生真实HBV cccDNA 并且能作为唯一得转录模板发挥功能。
本发明构建的新型HBV慢性感染小鼠模型可用于研究长期慢性感染条件下HBV cccDNA形成和维持的机制，用于研究与免疫系统相关的问题，用于寻找和评估新的抗HBV药物。
权利要求书1页 说明书8页序列表10页 附图3页CN 112725292 A 2021.04.30C N 112725292A1.一种基于S基因断裂的AAV ‑HBV重组病毒，其特征在于：将HBV基因组从S基因处断开使得AAV ‑HBV1.04本身无法支持HBV复制，只有当重组发生产生cccDNA后HBV复制才能发生，所述重组病毒载体质粒序列见SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的一种基于S基因断裂的AAV ‑HBV重组病毒的制备方法，其特征在于：扩增AAV载体骨架，以2倍体为模板扩增HBV目的片段，再通过同源重组方法构建到AAV载体质粒中；其中，所述HBV2倍体的核苷酸序列见SEQ ID NO.2，用于扩增AAV载体骨架的引物序列见SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，用于扩增HBV目的片段的引物序列见SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
AAV-HBV转染小鼠模型构建方法
AAV-HBV转染小鼠模型构建方法2001年，Sprinzl等[29]开发了腺病毒载体携带1.3倍的鸭HBV基因组(Ad-DHBV)，经尾静脉注射进入小鼠体内的方法。
采用类似的方法，von Freyend等[30]将含有1.3倍HBV基因组的腺病毒载体(Ad-HBV)注射到C57BL/6小鼠体内，在小鼠肝脏中检测到3个月以上的HBV转录产物。
由于腺病毒载体很大，同时编码一些非HBV病毒产物，这些产物也可能诱导免疫反应来清除HBV[31]。
肝细胞靶向AAV载体具有低免疫原性的特点，将AAV-HBV通过小鼠尾静脉注射，成功建立了AAV-HBV小鼠模型[32-33]。
这类模型可以持续产生HBV病毒颗粒和HBV抗原且1年以上无血清转化，重现了临床CHB患者的部分免疫学特征。
因而，AAV-HBV模型也被用于评估新的基于免疫的疗法和抗病毒治疗[34]。
目前常用的rAAV8-1.3HBV病毒载体，经尾静脉注射到野生C57BL/6小鼠体内，其表达水平随重组病毒注射剂量的增加而升高，高剂量注射时可造成超过40%的肝细胞感染HBV，血清中HBV DNA可达105 IU/ml。
但要注意不同小鼠品系HBV感染的表型存在差别。
2017年Lucifora等[35]报道通过Southern印迹分析可检测到AAV-HBV中存在cccDNA，然而这些cccDNA，是不是通过小鼠肝细胞中的rcDNA前体产生的仍不清楚，目前也无新的研究报道。
另外在这些模型中，HBV的复制不是由cccDNA直接驱动的，而且重组AAV 基因组进入体内后，一部分可以形成大的多聚体并整合到宿主基因组中，从而使得这些模型与cccDNA的相关性降低[36]。
尽管如此，AAV-HBV模型仍是用于评估免疫疗法和抗病毒治疗的主要模型。
1.3copyC型HBV转基因小鼠的制备研究的开题报告
1.3copyC型HBV转基因小鼠的制备研究的开题报告
一、选题背景
乙型肝炎病毒（HBV）是一种造成急性和慢性肝炎以及肝癌的病毒，在全球范围内都发生了很高的流行率。
尽管已经发现了有效的HBV疫苗，但仍然有许多患者不适合接种疫苗或疫苗接种失败。
因此，寻找新的治疗HBV的方法仍然是非常重要的。
HBV转基因小鼠是一种研究HBV相关疾病的理想模型，它可作为疫苗和治疗试验的基础，具有重要的应用价值。
二、研究目的
本研究的目的是制备一种C型HBV转基因小鼠模型，以评估其对HBV感染和治疗的响应，并为HBV相关疾病的研究提供一个新的模型。
三、研究内容
1.构建C型HBV转基因小鼠模型
根据已知的C型HBV的DNA序列，设计特异性引物并扩增C型HBV的全长DNA。
利用质粒转染技术将得到的C型HBV DNA插入小鼠的基因组，构建C型HBV转基因小鼠模型。
2.研究C型HBV转基因小鼠对HBV感染和治疗的响应
将C型HBV转基因小鼠感染HBV，并观察其肝脏中HBV的表达和复制水平。
随后，对C型HBV转基因小鼠进行抗HBV治疗，并观察疗效。
四、研究意义
本研究将为HBV相关疾病的研究提供一个新的模型。
同时，研究结果还将为开发新的治疗HBV的药物提供重要依据，促进HBV相关疾病的治疗。
转基因动物模型建立-“乙肝小鼠”成人类替身
转基因动物模型建立-“乙肝小鼠”成人类替身
佚名
【期刊名称】《传染病网络动态》
【年(卷),期】2005(000)009
【摘要】据医学空间网8月1日报道，目前新一代持续表达乙肝病毒表面抗原的转基因小鼠已稳定繁殖了7代。
这一动物模型的建立，对研究和治疗我国为数巨大的乙肝病毒携带者具有重要意义。
【总页数】1页(P8)
【正文语种】中文
【中图分类】R512.62
【相关文献】
1.人类AIDS的研究替身--非人灵长类动物模型 [J], 李明华;何昭阳;郑永唐
2.类人型机器人成功打捞沉船:可作为人类替身探索大海 [J], 叶子
3.乙肝歧视何时不再成社会话题调查称:逾六成国企入职仍查乙肝 [J], 彭洋
4.仿真模型，人类安全实用的替身 [J], 朱利丹
5.乙肝舒对小鼠细胞免疫功能及白细胞介素-2生成的影响 [J], 聂淑琴;王金华;李兰芳;薛宝云;梁爱华;曹秀芳;杨庆;赵良辅
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复制型HBV转基因小鼠的建立与应用
复制型HBV转基因小鼠的建立与应用孔祥平;刘光泽;易学瑞【摘要】尽管有了有效的疫苗,但乙肝病毒(HBV)感染依然是全球性公共卫生问题,在我国形势尤为严峻.由于HBV的自然宿主仅限于人和黑猩猩,现有的模型都有不同的缺陷,因此关于其生物学及治疗方法研究的诸多问题依然没有解决.复制型HBV转基因小鼠模型的建立,极大地提高了我们对HBV生活史、免疫生物学和肝脏病变的免疫发病机制的认识.本文简要介绍国际上由Francis V.Chisari实验室和国内由本实验室建立的复制型HBV转基因小鼠,以及利用该模型开展抗病毒药物和乙肝发病机制的研究工作.%Despite the existence of a preventive vaccinet hepatitis B virus (HBV) infection is still a major worldwide health problem, especially in China. As HBV naturally Despite of the existence of a preventive vaccine, hepatitis B virus CHBV) infection is still a major worldwide healthy problem, especially in China. As HBV naturally infects only human and chimpanzees, many issues pertaining to the biology and the therapeutic of HBV infection remain unresolved due to the limitation of the establishment of a HBV model. However, the establishment of HBV-replication transgenic mice has greatly improved our understanding of life cycle, immunobiology and pathogensis of HBV. The establishment of HBV transgenic mice and its use in assessing the antiviral potential of pharmacological agents and HBV immunopathogenesis are herewith briefly described in the present paper.【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2011(036)009【总页数】5页(P954-958)【关键词】小鼠,转基因;肝炎病毒,乙型;抗病毒药;模型,动物【作者】孔祥平;刘光泽;易学瑞【作者单位】510600 广州解放军458医院全军肝病中心、全军转基因动物重点实验室;510600 广州解放军458医院全军肝病中心、全军转基因动物重点实验室;510600 广州解放军458医院全军肝病中心、全军转基因动物重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R576.1一般认为乙肝病毒(HBV)急性感染后,机体清除病毒是以非损伤性(noncytolytic)机制和特异性CD8+T细胞进入肝脏为特征的,但这些认识是基于对病毒清除与否的特异性HBV免疫反应以及黑猩猩感染HBV的有限实验结果推测而来的[1-2]。
C基因型HBV转基因小鼠的制备
C基因型HBV转基因小鼠的制备尤玉琴，黄黎珍，刘光泽，佟明华，李秀梅，胡莲美，顾为望，孔祥平【摘要】目的：成立C型HBV转基因小鼠，为乙肝防治研究提供实验动物模型. 方式：采纳受精卵显微注射法，制备HBV转基因小鼠，用PCR，ELISA,荧光定量PCR和免疫组化的方式研究HBV基因在转基因小鼠体内的整合、复制和表达情形. 结果：注射受精卵2840枚，挑选注射后成活的受精卵共2256枚，注射成活率％. 注射后受精卵共移植假孕雌鼠85只，其中有42只怀孕，假孕雌鼠怀胎率49％，共产下F0代小鼠168只，PCR检测共有14只小鼠阳性，其中ELISA检测血清HBsAg阳性5只,HBeAg均阴性. 荧光定量PCR血清HBV DNA显示，2只小鼠的拷贝数别离为×105copies/L,×105copies/L，经传代产下F1代小鼠61只，PCR检测HBV DNA阳性5只，ELISA检测HBsAg阳性4只，其中肝脏HBsAg免疫组化阳性2只，HBcAg均阴性，且肝组织表达HBsAg为胞浆型. 结论：构建的C型HBV基因不但能够在转基因小鼠体内进行复制表达，而且能够遗传给下一代小鼠.【关键词】肝炎病毒乙型小鼠转基因肝炎表面抗原乙型肝炎核心抗原乙型血清 DNA【Abstract】 AIM： To generate HBV (C) genome transgenic mice to provide suitable animal models for the related researches in China. METHODS： The HBV transgenic mice were generated by microinjection of copies HBV genome into the pronucleus of FVB/N zygotes. The PCR assay,ELISA,RT-PCR and immunohistochemical methods were used to detect the HBV integration,replication and expression in the transgenic mice. RESULTS： In this study,2840 zygotes were injected,the survived 2256 zygotes after microinjection were reimplanted into the oviducts of 85 psudopregnant KM female mice. After birth,42 female mice were pregnant and 168 F0 offsprings were born. PCR analysis indicated that 14 out of 168 F0 were integrated with HBV genome. With ELISA,5 of them expressed HBsAg in serum. And two mice were positive for HBV DNA replication in serum with ×105copies/L and ×105 copies/L respectively. Then the transgenic mice were mated to normal mice to establish transgenic mouse strain. 61 F1 offsprings were born. Further study demonstrated that 5 of them were integrated with HBV genome by PCR,4 of them were serum HBsAg positive by ELISA and 2 of them with the intracellular distribution of HBsAg in hepatocytes by immunohistochemistry. Both serum HBeAg and liver HBcAg immunohistochemistry were negative. CONCLUSION：Theestablished HBV (C) genome could be not only replicated and expressed in transgenic mice but also inherited to the next generations.【Keywords】 hepatitis B virus mice transgenic,hepatitis B surface antigens;hepatitis Bcore antigens；serum;DNA0 引言依照HBV基因序列的不同＞8%，可将HBV毒株分为不同的基因型，目前已确信有A-H 8个基因型. 不同基因型呈必然的地理区域性散布，而且HBV基因型与其流行特点、致病性、疾病医治及预后等方面存在十分紧密的关系［1-5］. 我国HBV的要紧流行株有B型和C 型，而C型在全国各地均有流行，尤其以北方地域流行为主，有的城市乃至高达69％［6］. 转基因小鼠的成立，为乙型肝炎的基础研究和抗HBV药物的研究提供良好动物模型. 因此咱们在成功成立培育D 型HBV转基因小鼠基础上［8］，又在国内率先构建C型倍加长片段，并利用显微注射法试图成立一种C型HBV基因高效复制和表达的转基因小鼠，以期为乙型肝炎预防和医治研究提供加倍理想的动物模型.1 材料和方式材料 SPF级KM雌性小鼠体质量20～22 g，6～8 wk龄；雄性小鼠22～25 g，8～10 wk龄，由南方医科大学实验动物中心提供(合格证号： 2006A044)，雄性鼠结扎后用于制备假孕母鼠，雌性鼠那么用作胚胎移植的受体鼠. SPF级FVB小鼠（雄性和雌性），4～5 wk龄，由解放军第458医院全军肝病中心转基因室提供，做为供卵鼠. 质粒pUC19-HBV(C)由解放军第458医院佟明华博士构建. 仔鼠鉴定用引物P1： 5′-TTCTTTCCCGATCACCAGTT-3′，P2： 5′-TAACACGAGCAGGG GTCCA-3′由Invitrogen 公司合成. Taq酶及PCR相关试剂购自Takara公司. HBsAg ELISA 检测试剂盒购自上海科华公司；HBV PCR 荧光定量检测试剂盒为深圳匹基生物公司生产，荧光PCR仪为美国检测试剂盒购自福州迈新生物技术公司，免疫组化检测抗体购自Dako公司.方式注射用(C) DNA片段的预备质粒pHBV(C) 是将拷贝 C型HBV 基因组DNA克隆于PUC-19的Sma I位点，用限制性内切酶酶切质粒pHBV(C)，10 g/L琼脂糖凝胶电泳回收大小约为的条带，即为目的转基因片段HBV(C)，纯化后溶于TE备用.显微注射法制备 C型 HBV转基因小鼠选4～5 wk龄发育良好的FVB/N母鼠，孕马血清（pregnant mare serum gonadotropin,PMSG）5 U，ip，48 h后注射人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,HCG）5 U，激素超排处置后与FVB/N公鼠1∶1合笼，第二天早晨检阴栓阳性为显微注射用受精卵供体鼠. 将结扎KM公鼠与正常KM母鼠合笼，选取有阴栓且阴门肿胀、红润的母鼠做为注射后受精卵移植的受体鼠. 将HBV(C)溶液利用原核显微注射的方式直接注入超排取得的FVB/N单细胞受精卵的原核内，取注射存活的受精卵移植到假孕KM母鼠的输卵管内. 待其怀孕产仔后，进行检测.转基因小鼠HBV基因整合及复制表达检测取小鼠尾组织基因组DNA进行PCR检测，反映体系50 μL按94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，45 s 共35 个循环. 取产物10 μL进行琼脂糖电泳，做PCR 分析. 对PCR阳性鼠，在眼眶后静脉丛采血300 μL，37℃放置2 h，3000 r/min离心6 min，取上清. ELISA检测HBsAg/HBeAg，定量检测HBV DNA，利用实时荧光PCR仪进行结果分析. 取小鼠肝脏，置40 g/L 中性甲醛中，4℃固定12～14 h. 按常规方式制作组织切片，进行免疫组化分析. HBsAg抗体1∶500稀释，HBcAg抗体1∶500稀释. 2 结果目的基因的整合（F0代）共注射受精卵2840枚，挑选注射后成活的受精卵共2256枚，注射成活率％. 注射后受精卵共移植假孕雌鼠85只，其中有42只怀孕，假孕雌鼠怀胎率49％，共产下F0代小鼠168只，PCR检测共有14只整合阳性（A3,A48,A51,A53,A55,A56,A57,A62,A69,A74,A81,A82,M66,M90）（％），携带有外源目的基因，PCR产物电泳后在500 bp处有一条带，为阳性小鼠(图1).1: 阳性对照; 2: 阴性对照.图1 F0代转基因小鼠基因组DNA PCR 检测结果（略）目的基因的体内复制和表达对PCR检测HBV DNA阳性小鼠血清进行HBsAg ELISA 检测，HBsAg阳性鼠有：A56，A69，A74，A81，A82，其中A56和A69呈较弱阳性. HBeAg检测均为阴性. 同时，PCR 检测HBV DNA阳性小鼠血清HBV DNA荧光定量PCR显示，2只小鼠的拷贝数大于105copies/L，别离为A55号鼠×105copies/L)和A69号鼠×105copies/L).转基因小鼠的传代及检测将ELISA阳性鼠与正常的FVB/N 小鼠合笼，经传代产下F1代小鼠61只，PCR检测阳性5只（图2），ELISA 检测HBsAg阳性4只，其中肝脏HBsAg免疫组化阳性有2只，且呈胞浆型表达. 而HBcAg免疫组化均为阴性，肝细胞无表达（图3）.1：阳性对照；2：阴性对照;M: marker.图2 F1代转基因小鼠基因组DNA PCR 检测结果（略）3 讨论最近几年来国内外许多研究均说明［7-8］，HBV基因型与基因变异、感染后疾病临床表现、抗病毒医治及预后等方面都有紧密的关系. 与以往传统的血清型分型方式比较，HBV基因分型更具临床意义. 血清型是由病毒外膜蛋白上的一些氨基酸残基决定的，是病毒外膜蛋白的表现型，并非能真正反映病毒基因组的不同，而且人们发觉它的临床意义并非是专门大. 因此，确信HBV基因型对乙肝基础研究和感染风险预测及临床医治方案选择具有必然的意义. 目前，国内外有关复制型HBV转基因小鼠的研究较多［8］，但大多数是D型等欧洲流行株转基因小鼠，而针对我国C型流行株的研究甚少. 随着HBV基因型临床意义的不断研究验证，C型转基因小鼠的研究对我国乙肝研究具有更重要的意义.A:B12; B:B26.图3 F1代ABV转基因小鼠肝脏HBsAg的表达（箭头所指棕黄色为阳性）显微注射法制备转基因动物是一项技术性很强的工作，操作精细，涉及的步骤繁杂，其效率的高低受多方面因素阻碍. 第一要取得高质量的受精卵，即细胞饱满、边缘滑腻、透明带界面清楚，雌雄原核清楚可见（核膜核仁清楚可辨）. 咱们也采纳FVB/N近交系小鼠为供体鼠，发觉其受精卵原核比国内经常使用的KM鼠大且清楚，比KM鼠更易于注射. 但超排卵的异样率不稳固，有时只有15％，有时高达80％，可能与小鼠个体不同环境因素有关. 注射后胚胎移植是阻碍整个实验的最后关键因素，阻碍胚胎移植成功的因素很多,要紧包括受体的选择和胚胎移植操作技术. 咱们采纳传统的撕破囊膜移植方式，赵四海等［9］应用改良后的囊膜穿刺胚胎移植，与传统的方式与进行比较发觉，囊膜穿刺胚胎移植方式幸免撕破囊膜，降低术中出血和术后炎症引发的输卵管手术部位和腹壁的粘连，可是该方式的移植技术要求更高，且费时较长. 本实验移植后受体的怀孕率达％，高于多数报导［10］，说明本实验胚胎移植操作方式可行且操作技术较好. 本实验中，F0代小鼠PCR阳性有14只，其中有5只小鼠血清ELISA阳性，2只小鼠血清HBV DNA 有复制. 经传代产F1代61只，其中PCR 阳性仅有5只，可能由于部份小鼠传代丢失所致. 而F1代小鼠ELISA 阳性4只，其中2只肝脏免疫组化阳性，说明在该基因可传至下一代. 但上述取得HBV转基因小鼠其复制表达水平较低，尚未达到与本课题组初期制备D型HBV转基因小鼠相近水平，咱们正从多方面研究提高.【参考文献】［1］ Wang Z，Liu Z，Zeng G，et al．A new intertyperecombinant between genotypes C and D of hepatitis B virus identified in China［J］. 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Int J Med Sci,2006,3:14-20.［8］ Enomoto M,Tamori A,Nishiguchi S. Hepatitis B virus genotypes and response to antiviral therapy［J］. Clin Lab,2006,52:43-47.［9］赵四海，郑华东，楚雍烈,等. 两种小鼠胚胎移植方式的比较［J］. 第四军医大学学报,2007,28(6):493-495.［10］吴金明，林菊生，陈碧涛，等．乙型肝炎病毒基因组转基因小鼠模型的制备和鉴定［J］. 中华肝脏病杂志，2006，11（6）：338-340.。
乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠的建立
乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠的建立刘红;姚玉成;何金;李文林;李建秀;苏小平;张钦宪;胡以平【期刊名称】《第二军医大学学报》【年(卷),期】2003(24)2【摘要】目的 :建立乙型肝炎病毒核心抗原 (ayw亚型 )转基因小鼠模型。
方法 :采用受精卵显微注射的方法制备转基因小鼠 ,以 PCR、免疫组化和 H- E染色法分析导入基因在小鼠基因组中的整合、肝脏中的表达及肝组织的病理变化。
结果 :得到 6只基因组中整合了核心抗原基因的首建者 (founder)小鼠 ,其中 1只在肝细胞核和胞浆均有 HBc Ag的表达。
将肝脏中表达的小鼠继续传代 ,F1 代 10只小鼠中的 4只小鼠肝细胞有 HBc Ag的表达。
结论 :建立了乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠 ,核心抗原基因能够在小鼠肝脏中表达。
【总页数】3页(P172-174)【关键词】乙型肝炎病毒;核心抗原;转基因小鼠;动物模型【作者】刘红;姚玉成;何金;李文林;李建秀;苏小平;张钦宪;胡以平【作者单位】第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室;第二军医大学长征医院病理科;郑州大学医学院组织胚胎学教研室【正文语种】中文【中图分类】R373.21【相关文献】1.乙型肝炎表面抗原与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合表达质粒免疫乙型肝炎病毒转基因小鼠的研究 [J], 卿玉玲;赵嘉将;任红2.乙型肝炎病毒核心抗原与前S1抗原融合蛋白诱导小鼠免疫反应的实验研究 [J], 陈心春;周伯平;李美忠;王召钦;王火生;张斌;唐蔚3.乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠的建立 [J], 刘红;张钦宪;胡以平4.苦参乌梅汤影响乙型肝炎病毒转基因小鼠乙型肝炎表面抗原表达的研究 [J], 郭朋;刘燕玲;孔伟;郑蕊;张引强5.氧化苦参碱对乙型肝炎病毒转基因小鼠乙肝抗原表达的影响 [J], 陈小松;王国俊;蔡雄;余宏宇;胡以平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
HBV(ayw)转基因小鼠HBV复制中间体的检测
HBV(ayw)转基因小鼠HBV复制中间体的检测陈阳述;尤玉琴;苏蔚;易学瑞;袁有成;陈文吟;张锋;孔祥平【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2011(36)9【摘要】Objective To establish highly sensitive and stable chemiluminescent Southern blotting system, and to detect the replication levels of HBV DNA in liver, kidney, spleen and muscles of HBV (ayw) transgenic mice. Methods The HBV probe was labeled with digoxigenin with PCR, and the sensitivity and reproducibility of hybridization system were detected by pTHBV1047. The total genomic DNA was extracted from the tissues of HBV transgenic mice and digested with Hind IE for 18 hours. After eletrophoresis, the digested DNA was transferred to nylon membrane. The replicated intermediates in the liver and other tissues of HBV transgenic mice were detected by chemiluminescent hybridization Southern blotting system. Results The sensitivity of the detection 9ystem labeled with digoxigenin was about 0. Lpg, and the hybridization system was stable and reliable. Both the integrated transgene of HBV DNA and the HBV replicated intermediates were detected in the liver of HBV transgenic mice, but the level of HBV replication was lower than that in HepG2. 2.15 cell line. HBV DNA replication also existed in kidney, spleen and muscles, but the replicated levels in these tissues were lower than that in the liver. Conclusions The 27th generation of HBV (ayw) transgenic miceis replicated in HBV transgenic mice with HBV gene stably integrated in the genome thereof.%目的建立稳定、高灵敏度化学发光Southern blotting检测系统,检测HBV(ayw)转基因小鼠肝脏及其他组织的HBV复制水平.方法采用地高辛标记HBV探针,利用pTHBV1047质粒检测杂交系统的灵敏度及重复性；提取第27代HBV(ayw)转基因小鼠肝、肾、脾和肌肉组织总DNA,经HindⅢ酶切后电泳、转膜,利用高灵敏度化学发光杂交Southern blotting检测各组织中HBV复制中间体的水平.结果地高辛标记的化学发光检测系统灵敏度达0.1pg,且杂交系统稳定可靠.HBV(ayw)转基因小鼠基因组DNA中检测到整合的外源HBV DNA,但低于HepG2.2.15细胞的HBV复制水平.肝、肾、脾和肌肉组织中都有HBV复制中间体存在,以肝组织中含量最高.结论第27代HBV(ayw)转基因小鼠染色体含有稳定的HBV基因整合,为复制型HBV转基因小鼠.【总页数】3页(P959-961)【作者】陈阳述;尤玉琴;苏蔚;易学瑞;袁有成;陈文吟;张锋;孔祥平【作者单位】510600 广州解放军458医院全军肝病中心、全军转基因动物重点实验室;510600 广州解放军458医院全军肝病中心、全军转基因动物重点实验室;510600 广州解放军458医院全军肝病中心、全军转基因动物重点实验室;510600 广州解放军458医院全军肝病中心、全军转基因动物重点实验室;510600 广州解放军458医院全军肝病中心、全军转基因动物重点实验室;510600 广州解放军458医院全军肝病中心、全军转基因动物重点实验室;510600 广州解放军458医院全军肝病中心、全军转基因动物重点实验室;510600 广州解放军458医院全军肝病中心、全军转基因动物重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R512.62【相关文献】1.复制型HBV（ayw）转基因小鼠血清中病毒颗粒的免疫电镜检测 [J], 胡莲美; 李秀梅; 黄黎珍; 刘光泽2.HBVS基因的反义锁核酸对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响 [J], 邓益斌;农乐根;王燕菲3.化学发光法检测体外HBV复制 [J], 崔静;胡接力;张文露;王媛媛;李毅;黄爱龙4.PTD-HBcAg融合蛋白诱导特异性CTL抑制转基因小鼠HBV复制 [J], 陈小华;潘庆春;汤正好;余永胜;臧国庆5.应用荧光定量聚合酶链反应检测血清、肝组织中HBV-DNA含量观察HGV感染对慢性乙型肝炎HBV复制的影响 [J], 商庆华;于建国;卓海龙;徐传镇;王宁;张光曙因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
乙型肝炎病毒转基因研究进展
乙型肝炎病毒转基因研究进展
岳惠芬;苏建家
【期刊名称】《广西医学》
【年(卷),期】2005(27)8
【摘要】乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一种嗜肝DNA病毒，可以引起急慢性肝炎、肝细胞癌。
自从转基因技术出现以来，人们可以通过转基因动物的研制来建立转基因动物模型。
研制的HBV转基因小鼠可以用来研究HBV的致病机制、肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的发生机理、评估药物治疗乙肝的效果。
【总页数】3页(P1195-1197)
【作者】岳惠芬;苏建家
【作者单位】广西壮族自治区肿瘤防治研究所,南宁,530021;广西壮族自治区肿瘤防治研究所,南宁,530021
【正文语种】中文
【中图分类】R5
【相关文献】
1.乙型肝炎病毒转基因小鼠模型的应用研究进展 [J], 宋育林;曾民德
2.甲基阿魏酸对乙型肝炎病毒转基因小鼠的抗病毒作用研究 [J], 杨成芳;李丽;李勇文;容明智;庞勇军;方舒萍;韦冰华
3.乙型肝炎病毒垂直传播研究进展rn乙型肝炎病毒垂直传播研究进展 [J], 蒋就喜
4.乙型肝炎病毒X基因转基因小鼠模型的建立及其应用研究进展 [J], 毛华伟;赖国
旗
5.乙型肝炎病毒转基因小鼠的研究进展 [J], 陈湖光
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adr型乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠的制备
adr型乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠的制备
王洪敏;刘光泽
【期刊名称】《传染病信息》
【年(卷),期】2000(013)001
【摘要】目的制备用于人乙型肝炎研究的ＨＢＶ转基因小鼠模型。
方法将首层相连的ａｄｒ型ＨＢＶ全基因组克隆至ｐＢＲ３２２质料，经扩增纯化后，用显微注地射法导入Ｃ５７ＢＬ／６小鼠受精卵原核，让外源ＨＢＶ自然整合至小鼠受精卵基因组。
用ＰＣＲ、ＤＮＡ测序、放免及免疫组化等方法分析ＨＢＶ在小鼠体内的整合、复制、表达情况。
结果显微注射１７１２枚卵，产仔１２８只，其中有１４只鼠尾ＨＢＶＰＣＲ检测阳性。
１２只在血清中
【总页数】2页(P18-19)
【作者】王洪敏;刘光泽
【作者单位】全军传染病中心转基因工程研究所;全军传染病中心转基因工程研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R512.62
【相关文献】
1.乙型肝炎病毒adr型全基因组C区突变株的构建及其生物学活性检测 [J], 陈伟红;林裕龙;王燕军;骆抗先
2.中国株乙型肝炎病毒全基因组克隆的制备与鉴定 [J], 余祖江;李晓菲;阚全程;杨
东亮;郝连杰
3.Adr型HBV全基因转基因小鼠DC和T细胞功能的研究 [J], 邵永祥;沈关心
4.乙肝病毒（Adr）全基因组在转基因小鼠体内（HBV）DNA的存在状态 [J], 张萍萍;万大方;成国祥;励雁峰;成勇;顾健人
5.人乙型肝炎病毒(ayw型)全基因组转基因小鼠病理学观察 [J], 余宏宇;雷章恒;龚志锦;沙继宏;杨勇骥;潘星华;王肖鹏;傅继梁;胡以平
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转基因小鼠在乙肝分子生物学及免疫学研究中的应用
转基因小鼠在乙肝分子生物学及免疫学研究中的应用
郑素军;钟森;张建军
【期刊名称】《泸州医学院学报》
【年(卷),期】2002(025)002
【摘要】乙型肝炎病毒(HBv)是严重损害人健康的病毒性肝炎重要致病因子。
HBV 自然感染宿主范围狭窄，建立合适的动物模型很是困难，在很大程度上限制了对乙肝的深入研究。
HBv转基因小鼠，对乙肝研究起了极大的推动作用。
本文就HBv 转基因小鼠在乙肝分子生物学及免疫学研究中的应用作一综述。
【总页数】3页(P176-178)
【作者】郑素军;钟森;张建军
【作者单位】泸州医学院附属医院感染科,四川泸州,646000;泸州医学院附属医院感染科,四川泸州,646000;泸州医学院附属医院感染科,四川泸州,646000
【正文语种】中文
【中图分类】R512.6.2
【相关文献】
1.广州研究出内地唯一能应用的乙肝转基因小鼠 [J],
2.抗乙肝病毒新药Bay41-4109在HBV转基因小鼠中的药效学研究 [J], 李秀梅;陈阳述;刘光泽;黎经纬;陈媚娟;周军辉;孔祥平
3.HBV转基因小鼠孕前期及孕期应用乙肝疫苗的实验研究 [J], 雷小英;闫永平;徐德忠;门可;李端
4.转基因小鼠及其在免疫学研究中的应用 [J], 朱晴晖;章谷生
5.转基因小鼠在乙肝发病机制研究中的应用 [J], 尹华;唐红
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乙型肝炎病毒转基因小鼠研究现状
乙型肝炎病毒转基因小鼠研究现状
卿玉玲;任红
【期刊名称】《国际病毒学杂志》
【年(卷),期】2002(009)005
【摘要】由于HBV感染具有明显的种属特异性,只感染人及黑猩猩等灵长类动物,使乙型肝炎的研究一直缺乏理想的动物模型.转基因小鼠出生前就能在内源性HBV 启动子的控制下,主要在肝脏内持续转基因表达,在肝细胞内没有HBsAg积累,也没有肝细胞病变,HBsAg以亚病毒颗粒的形式以9 000ng/ml的浓度分泌入血[1].这些小鼠对高水平的循环抗原耐受,不产生抗HBs,可被用作HBV慢性携带状态模型.本文对HBV转基因小鼠转基因表达、免疫耐受及打破免疫耐受的机理等作一简要综述.
【总页数】4页(P141-144)
【作者】卿玉玲;任红
【作者单位】重庆医科大学附属二院病毒性肝炎研究所,重庆,400010;重庆医科大学附属二院病毒性肝炎研究所,重庆,400010
【正文语种】中文
【中图分类】R373
【相关文献】
1.高复制HBV转基因小鼠模型对抗乙型肝炎病毒药物的效应研究 [J], 刘光泽;孔祥平;任向荣;李秀梅;胡莲美;黄黎珍;顾为望
2.甲基阿魏酸对乙型肝炎病毒转基因小鼠的抗病毒作用研究 [J], 杨成芳;李丽;李勇文;容明智;庞勇军;方舒萍;韦冰华
3.小干扰RNA长期作用乙型肝炎病毒转基因小鼠对机体免疫系统的影响 [J], 张卫云;石玉玲;孙朝晖;任广立;张蓉;唐荣芝
4.转基因小鼠特异性免疫效应淋巴细胞影响乙型肝炎病毒复制的体外研究 [J], 宋红丽;郑卫萍;杨洋;刘涛;吴本娟;付楠楠;张友成;沈中阳
5.疏肝健脾补肾方对乙型肝炎病毒转基因小鼠脾T淋巴细胞及病毒载量的影响 [J], 刘亚梅;郭兴伯
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乙肝病毒基因在转基因小鼠中高效表达的研究
乙肝病毒基因在转基因小鼠中高效表达的研究
耿士忠;鞠辉明;杨跃飞;成勇
【期刊名称】《扬州大学学报：农业与生命科学版》
【年(卷),期】2002(23)4
【摘要】采用传统育种方法,将整合含有人类乙肝病毒(HBV)基因的转基因小鼠通过近交和远交的育种方法,获得纯合子小鼠,收集由纯合子小鼠产生的双重杂合子小鼠及后代小鼠的血清,用竞争PCR联合产物酶联杂交技术定量测定血清中的HBVDNA量。
结果表明:相对于单纯杂合子小鼠,纯合子小鼠的表达量增高不明显,而双重杂合子小鼠的表达量有明显提高。
将双重杂合子再进行杂交传代,其后代也有增高趋势。
【总页数】3页(P12-14)
【关键词】乙肝病毒基因;转基因小鼠;高效表达;PCR酶联杂交;转基因动物;家畜【作者】耿士忠;鞠辉明;杨跃飞;成勇
【作者单位】扬州大学转基因动物实验室
【正文语种】中文
【中图分类】S852.4
【相关文献】
1.Nestin转基因小鼠模型的建立及nestin基因在器官中的表达 [J], 郑文宏;李振林;贾俊双;安靓
2.乙肝病毒基因组高效复制与表达转基因小鼠模型的制备与鉴定 [J], 吴金明;林菊
生;等
3.牛α—S1—酪蛋白—乙肝病毒表面抗原融合基因在转基因羊中的表达 [J], 张靖溥;成勇
4.不同杂交方式获得高效表达乙肝病毒基因转基因小鼠 [J], 耿士忠;曾显营;鞠辉明;杨跃飞;成勇
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乙型肝炎病毒S基因片段的克隆及其原核表达的实验研究
乙型肝炎病毒S基因片段的克隆及其原核表达的实验研究刘桂香;魏虎来【期刊名称】《青海医药杂志》【年(卷),期】2004(34)9【摘要】目的 :获得adw亚型乙肝病毒表面抗原S基因在原核中的克隆和表达 ,经家兔免疫后产生抗 -HBs抗体。
方法 :从乙型肝炎病人血清中提取HBVDNA后扩增出 5 0 1bp的核苷酸片段 ,经纯化限制性内切酶(BamHⅠ和HindⅢ )切后 ,分别与PUC19和pGEMEXTM - 1载体连接后转化入宿主菌JM 10 9中和BL2 1,重组质粒经蓝/白斑,筛选、PCR鉴定、酶切鉴定,序列分析得到阳性重组质粒pGE -S。
通过IPTG诱导在大肠杆菌BL2 1中表达出重组抗原 ,重组抗原免疫家兔后 ,用ELISA法在血清中检测到抗 -HBs的存在。
结果 :HBVDNA经扩增得到 5 0 1bp的核苷酸片段 ,与质粒重组后形成的重组质粒 ,在IPTG诱导形成重组抗原 ,重组抗原两次免疫家兔后的血清抗体阳性率比较 ,差别有显著性(χ2 =0 .2 5 ,P≤ 0 .0 5 )【总页数】3页(P10-12)【关键词】重组抗原;乙型肝炎病毒S基因;重组质粒;HBV;抗-HBs;扩增;家兔;IPTG;克隆和表达;片段【作者】刘桂香;魏虎来【作者单位】兰州医学院【正文语种】中文【中图分类】R512.62;R373.21【相关文献】1.小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因特异片段的克隆、原核表达及多克隆抗体制备[J], 童睿;潘红春;马静静;朱国萍;郝家胜2.乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A的克隆与原核表达 [J], 张健康;郭江;成军;伦永志;王丹琼;赵龙凤;蓝贤勇;洪源;毛羽3.乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节人类新基因HBVDNAPTP1的克隆及原核表达与组织表达分析 [J], 伦永志;张黎颖;成军;郭江;洪源;赵宝昌4.IV型胶原片段阻滞原的基因克隆及原核表达研究 [J], 傅建新;白霞;阮长耿5.桑树1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活化酶基因cDNA片段的克隆及原核表达与植物反义表达载体的构建 [J], 冀宪领;盖英萍;王洪利;牟志美因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠的病理及免疫学特征研究的开题报告
乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠的病理及免疫学特征研究的开题报告一、研究背景及意义乙型肝炎（HBV）是一种非常常见的病毒性疾病，影响全球超过2亿人口。
乙型肝炎病毒（HBV）是一种含有DNA的病毒，它可以通过血液、性行为以及垂直传播感染人体。
HBV感染后，可以引起肝脏炎症、肝纤维化、肝硬化以及肝癌等不同程度的病变，给人类健康带来了巨大威胁，因此对其进行深入研究有非常重要的临床和基础科研意义。
小鼠作为常用的实验动物，对于乙型肝炎的研究具有重要的作用。
传统的小鼠模型是利用质粒或病毒载体介导病毒基因的表达，但是这种方法存在一些操作难度大、表达水平低且快速消退的局限。
利用转基因技术构建HBV全基因组转基因小鼠是目前研究HBV病理机制、肝癌发生机制以及病毒抗原学等方面的重要模型之一。
二、研究内容本项目将利用转基因技术构建HBV全基因组转基因小鼠模型，并对其进行病理学及免疫学特征研究。
具体内容如下：1. 构建HBV全基因组转基因小鼠模型。
本实验将选择C57BL/6小鼠作为研究对象，采用肝特异性启动子片段（ALB）驱动HBV全基因组的表达。
首先，根据GenBank中已发布的HBV全基因组序列，设计引物扩增其全长DNA后构建转染载体；然后将转染载体注射入小鼠的肝内，利用基因转染的技术将HBV全基因组转移到小鼠的体内，构建HBV全基因组转基因小鼠模型。
2. 观察HBV全基因组转基因小鼠的病理学特征。
通过临床观察、病理学检测等方式，观察HBV全基因组转基因小鼠的肝脏炎症情况、肝纤维化病变、肝细胞癌等病变形态和程度的变化。
同时，对比正常小鼠肝脏的组织形态，并结合血清学指标及生化参数，分析其病理学变化的特征。
3. 分析HBV全基因组转基因小鼠的免疫学特征。
通过检测小鼠的免疫细胞水平、炎性因子表达及细胞因子水平等指标，分析HBV全基因组转基因小鼠在发病过程中免疫系统的变化。
同时，进一步通过ELISA等实验方法检测小鼠的抗体水平及抗原水平，评估其对HBV感染的免疫反应。
乙型肝炎病毒感染小鼠模型的建立的开题报告
乙型肝炎病毒感染小鼠模型的建立的开题报告一、选题背景乙型肝炎病毒（HBV）是一种严重危害人类健康的病原体，全球有2亿多人携带HBV，导致严重肝炎、肝硬化、肝癌等疾病。
建立一个可靠的动物模型对HBV感染的研究具有重要的科学价值和实际意义。
近年来，家养小鼠已被广泛运用于传染病研究，因其易于获取和处理，而且它们的免疫系统和生物学特性与人类相似。
因此，建立乙型肝炎病毒感染小鼠模型，对于HBV感染的深入了解和防治具有重要的意义。
二、研究内容及目的本研究的主要目的是建立一个乙型肝炎病毒感染的小鼠模型。
研究内容主要包括：小鼠接种乙型肝炎病毒，观察病毒感染的临床症状和免疫血清学指标的变化；采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和实时荧光定量PCR技术检测HBV DNA的存在和表达；通过肝脏组织病理学和免疫组织化学检测了解HBV感染对小鼠肝脏组织的影响。
三、研究意义建立一个乙型肝炎病毒感染的小鼠模型，可供HBV感染相关药物的筛选和评估，有助于深入了解HBV的病理生理机制。
此外，还可以对HBV感染的传播途径和防治方法进行研究，提高控制疫情和降低人类患病率的能力。
四、研究方法和步骤1.选用多株家养小鼠，按体重随机分组，接种不同浓度的HBV。
2.周期性观察小鼠处于HBV感染状态时的病理变化，包括临床症状、体重、食欲等指标。
3.采用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术检测小鼠体内HBV DNA的存在和表达。
4.对小鼠的肝脏组织进行病理学和免疫组织化学检测，以了解HBV感染对小鼠肝脏组织的影响。
五、预期成果建立一个可靠的乙型肝炎病毒感染小鼠模型，并对小鼠进行小鼠体内HBV DNA的检测和肝脏组织病理学检测以了解HBV感染对小鼠肝脏组织的影响。
这将为乙型肝炎病毒感染的预防和治疗提供重要的理论支持和实践指导。
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乙型肝炎病毒(ayw 型)转基因小鼠的建立*雷章恒 李建秀 余宏宇△ 王新民 孙 伟▲ 潘星华 郝光荣▲ 王肖鹏 傅继梁 胡以平述 评 转基因动物是实验动物学、生物学及医学领域中的一项先进技术。
选择目的基因、筛选转基因动物并进行传代,需要长期持之以恒的工作。
本研究建立了有乙肝病毒复制及抗原表达的转基因小鼠,为进一步研究乙肝的发病及免疫机制、抗病毒治疗等提供了有价值的模型。
但对这一模型既要看到其模拟人持续性感染的一面,也望注意与乙肝病毒感染者间的差别。
中国微生物学会理事长上海医科大学教授卫生部医学分子病毒室主任 闻玉梅摘要 目的:建立遗传上稳定的、带有乙型肝炎病毒(HBV )ayw 亚型的转基因小鼠品系。
方法:通过对受精卵显微注射进行基因转移的途径制备转基因小鼠,以PCR -Souther n 杂交、ELI SA 、组织切片免疫组化和透射电镜等方法,分析所导入DN A 在转基因小鼠体内的功能情况。
结果:得到21只建立者小鼠,在它们的血清中检测到了HBs Ag 和HBe Ag 的存在,还在肝细胞中观察到了HBV 样病毒颗粒。
结论:HBV 基因组DN A 已经整合至小鼠的基因组,其中的基因能够表达,整个基因组DN A还能复制,并被有效地包装。
关键词 乙型肝炎病毒;转基因小鼠中国图书资料分类法分类号 R-332;R 373.2Generation of transgenic mice harbouring hepatitis B (ayw subtype )Lei Zhangheng ,Li J ianxiu ,Yu Hong yu ,Wang Xinmin ,Sun Wei ,Pan Xinghua ,Hao Guangrong ,Wang Xiaopeng ,Fu J iliang ,Hu Yiping (Depart-ment of Bio logy and O pen Labo ratory of M edical M olecular Genetics ,Depart-ment of Basic M edicine,Second Military M edical Univ ersity,Shanghai,200433)Abstract Objective:To establish the tra nsg enic mouse line ha rbo uring intact hepatitis v irus B (HBV )g enom e.Methods :The tra nsg enic mice w ere g enerated by microinjection o f the co mplete g enom e o f HBV (ay w subtype)into fer tilized eg gs.The functio nal analy sis of the HBV DN A integ rated in the tra nsg enic mice w as carried o ut by using PCR -Southern blot ,ELISA ,imm unohistochemistry a nd transmissio n elec-tro nic micro sco py .Results :Tw enty -one founder mice w ere obtained .HBs Ag and HBe Ag w ere detected in the serum from the founders a nd their offspring,and HBV-like par ticles w ere fo und in hepatocy tes.Con -clusion :The transgenic mice with HBV (ayw subty pe)hav e been g enerated.The HBV genes in the tra ns-g enic mice can be ex pressed and the HBV genome can been replicated and packaged .Key words hepatitis B virus;transg enic mice 人乙型肝炎病毒(HB V )是一种嗜肝DN A 病毒,有宿主特异性。
HBV 感染可致急、慢性肝炎,且与肝细胞癌(HCC)的发生相关。
乙型肝炎每年导致至少200万人死亡[1]。
在与癌症发生有关的环境因素中,·201·第二军医大学学报Acad J Sec Mil M ed Univ 1997Jun ;18(3)∶201～204上海市青年科技启明星计划资助项目,项目编号93QB14002作者单位 第二军医大学基础医学部生物学教研室和医学分子遗传学开放实验室,上海,200433;△第二军医大学基础医学部病理解剖学教研室;▲第二军医大学实验动物中心HBV 感染是仅次于吸烟的重要因素[2]。
据W HO 估计,HCC 患者中80%有HBV 感染[3];全球HB V 携带者约2～3亿[4]。
在感染人群中,HCC 的发病率比非感染人群高200倍[5]。
由HBV 感染引起的乙型肝炎及其后果是世界性的健康问题之一。
HBV 在自然状态下只感染人和高等灵长类动物,这给HBV 及乙型肝炎的实验研究带来了困难。
制作HBV DN A 转基因小鼠模型,有利于在活体水平对HBV 感染及后果进行实验研究。
本实验用两个首尾相连的ay w 型HBV 全基因组DN A 片断通过显微注射法导入小鼠受精卵,成功地获得了HBV DN A 转基因小鼠,并对这类转基因小鼠的特征进行了研究。
1 材料和方法1.1 材料 ayw 型HBV 基因组DN A 来自质粒pDIM ER (美国Scripps 研究所C .Pasquinelli 教授惠赠)。
小鼠为ICR 品系,购自上海计划生育研究所动物中心。
鉴定用PCR 引物根据S 区序列自行设计,由中国科学院上海细胞生物学研究所合成。
引物1:5'CCCAACC TCC AATCACTCACC 3';引物2:5'ACGAACC ACT GAAC AAATGGC3'。
耐热DN A 合成酶购自复旦大学遗传学研究所,核素探针标记试剂盒(Prim e -α-Gene Labeling System )为Promega 公司产品。
HBs Ag -HBeAg 放免检测试剂盒为中国原子能研究院同位素所产品。
血清HB V DN A 检测PCR 试剂盒由第二军医大学长征医院临床免疫研究中心提供。
HB V 抗原-抗体ELISA 检测试剂盒为华美生物工程公司产品。
免疫组化检测所用抗体为Dako 公司产品。
电镜检查所用试剂为常规试剂。
1.2 方法1.2.1 注射用HB V DN A 的制备 pDIM ER 是将两个首尾相连的HB V (ayw )全基因拷贝克隆于质粒Bluescript 的Eco R I 位点构建而成。
用Kpn I 和Sac I 将pDIM ER 切开(图1),0.7%琼脂糖凝胶电泳,回收 6.4kb 条带,纯化后溶于TE(p H 8.0)备用。
1.2.2 转基因小鼠的制备 按文献[6]方法进行。
1.2.3 转基因小鼠基因整合的鉴定 按文献[6]、[7]方法制备小鼠尾组织和耳组织基因组DN A,以此作为PCR 模板,于50μl 反应体系按94℃40s 、62℃40s 、72℃l min 做35个循环。
取15μl PCR 产物于琼脂糖凝胶电泳,随后进行Southern 转移,以α-32P-dA TP 标记的HB V DN A 为探针进行杂交。
1.2.4 转基因小鼠HB V 基因表达的检测 小鼠出生40d 后,对基因组DN A PCR -So uthern 杂交阳性小鼠眼眶静脉采血,离心得到血清,做HBsAg 和HBeAg 放免检测。
图1 pDI MER 酶切位点及注射片段结构示意图Fig 1 Restriction map and microin ject ion f ragment of pDIMERT hin line :V ecto r;Thick line :2copies of co nca tamerizedg enomes of HBV (a yw );Thick line with ar ro ws 4open read-ing f rames o f HBV ;K :Kpn I ;E :Eco R I ;S :Sa c I .The frag -me ntbetw een Kpn I and Sac I w as used fo r micr oinjectio n1.2.5 转基因小鼠血清HBV DN A 的检测 取HBs Ag 和HBeAg 放免检测阳性小鼠血清20μl,加入20μl 裂解液,置37℃水浴1h,加入20μl 蛋白变性液,10000r /min 离心1min,置沸水浴10min,稀释100倍以后,取5μl 作为PCR 模板,其后操作同 1.2.3所述。
1.2.6 转基因小鼠血清抗HBs 抗体检测 取血清HBV DN A PC R -Southern 杂交阳性转基因小鼠及其F 1转基因小鼠血清50μl ,做常规ELISA 酶联检测。
1.2.7 转基因小鼠肝、肾等组织HBsAg 和HBc Ag 免疫组化检测 对肝、肾等组织石蜡切片行常规免疫组化检测。
1.2.8 转基因小鼠肝、肾组织HBV 亚病毒颗粒及Dane 颗粒透射电镜观察 对免疫组化检测显示HBs Ag 强阳性的肝、肾组织多处取材(1m m 3×14块),按常规透射电镜法处理和观察[8]。
2 结 果2.1 转基因小鼠的制备 共注射了497个受精卵,存活325个(存活率为70%);为13只受卵母鼠进行了单侧输卵管移植,6只母鼠怀孕(怀孕率为46%),共产下51只仔鼠,38只存活(存活率为74%)。
2.3 转基因小鼠HBV 基因整合的鉴定 38只存活仔鼠中,尾组织基因组PC R -Southern 杂交检测阳性(图2A)小鼠(F 0)21只,阳性率为55%。
对34,37,16和36号F 0小鼠的52只子代小鼠(F 1)进行了耳组织基因组PCR-Souther n 杂交检测,34只为阳性小鼠,阳性率为65.4%。
2.3 转基因小鼠HBV 基因表达的检测 用21只F 0小鼠血清做HBsAg 和HBe Ag 放免检测,21只全部为HBsAg 阳性,18只为HBeAg 阳性。
2.4 转基因小鼠血清HBV DN A 的检测 用18只HBs Ag 和HBeAg 放免检测同为阳性的小鼠血清做HBV DN A 的PC R -Southern 杂交检测,10只为阳性小鼠(图2B)。