第十三章 PCR基因扩增技术

现代食品检测技术第二部分

第13章PCR基因扩增技术

赵杰文邹小波

江苏大学食品与生物工程学院

第十一章PCR基因扩增技术

1 PCR技术的检测原理

2 PCR引物的设计

3 PCR反应条件与程序优化

4 PCR扩增产物的检测分析

5 PCR技术的发展

6 PCR技术在食品微生物检测中的应用

7 PCR技术在转基因食品检测中的应用

1 PCR技术的检测原理

一、PCR的基本原理

二、PCR技术的特点

一、PCR的基本原理

（一）板DNA变性

（二）模板DNA与引物的退火（复性） （三）引物的延伸

（四）PCR的反应动力学

（五）PCR扩增产物

一、PCR的基本原理

二、PCR技术的特点

（一）特异性强

（二）灵敏度高

（三）简便快速

（四）对标本的纯度要求低

2 PCR引物的设计

一、引物的选择

二、引物设计的原则

三、引物合成的质量

一、引物的选择

位于高保守区互补的引物，可以特异性扩增某一目标DNA，可用于目标基因的分离或鉴定(而随机引物可导致多区域扩增)，产生特征性PCR 扩增指纹图谱，从而用于快速基因分型。

二、引物设计的原则

引物设计的总原则是：提高特异性扩增，抑制非特异性扩增。主要标准有：

（一）长度：应为15~30bp，一般为

18~24bp．与模板顺序互补；

（二）碱基随机分布：引物中四种碱基的分布最好是随机的，避免膘呤、嘧啶一连串堆积。 （三）G+C含量：在40~60%间，以

45%~55%为宜；

二、引物设计的原则

引物设计的总原则是：提高特异性扩增，抑制非特异性扩增。主要标准有：

（四）引物本身：不应存在互补序列；

（五）引物之间：两引物间不应有互补性； （六）引物的3′端：引物的延伸是从3′末端开始的，3′末端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，严格要求配对；

二、引物设计的原则

引物设计的总原则是：提高特异性扩增，抑制非特异性扩增。主要标准有：

（七）引物的5′端：引物5′末端只要与DNA结合的长度足够即可；

（八）避开简并位点；

（九）引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70％或有连续8个互补碱基。

二、引物设计的原则

引物设计的总原则是：提高特异性扩增，抑制非特异性扩增。主要标准有：

（十）扩增片段的长度：在临床检测中扩增片段长度一般在100~800bp间，多在200~600bp 间，以利于循环参数的统一及扩增产物分析。

三、引物合成的质量

引物序列确定之后，由专门实验室和专门的技术人员用核苷酸合成仪合成引物。

3 PCR反应条件与程序优化

一、PCR反应成分

二、循环参数

一、PCR反应成分

（一）模板

（二）引物

（三）dNTP

（四）PCR反应缓冲液

（五）TaqDNA聚合酶

（六）其他因素

二、循环参数

（一）变性时间和温度

（二）引物的退火

（三）引物的延伸

（四）循环次数

4 PCR扩增产物的检测分析

一、琼脂糖凝胶电泳

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳

三、层析技术

四、核酸探针杂交鉴定法

五、微孔板夹心杂交

六、限制性内切酶分析

七、酶免疫法检测PCR

八、单链构型多态性分析法

九、PCR扩增产物的直接测序

一、琼脂糖凝胶电泳

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳

三、层析技术

主要分为两大类别：一是常压软胶系统，包括离子交换层析、凝胶过滤（分子筛层析）、亲和层析及吸附层析；二是新近发展起来的高压液相（刚性胶体）与高效液相层析。

四、核酸探针杂交鉴定法

为了确定PCR产物是否是预先设计的目的片段，或产物是否有突变，都需做分子杂交检测。

五、微孔板夹心杂交

首先是固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异杂交，使PCR产物间接固定于微孔板上，再用非放射性核素标记的检测探针与PCR产物的另一区域杂交

六、限制性内切酶分析

根据目标基因的已知序列资料可以查出包含的酶切位点，用某种限制性内切酶消化扩增产物后进行电泳，观察消化片段的数目及大小是否与序列资料相符，从而确定产物的特异性。

七、酶免疫法检测PCR

DNA酶免疫试验（DNA enzyme immunoassay）是一种以特异杂交的双链DNA 为抗原，用一般标记的抗体进行显色反应，检测PCR扩增产物的技术。

八、单链构型多态性分析法

单链构型多态性分析性（PCR-Single Strand Conformation Polymorphism，简称PCR-SSCP）是一种简便快速的PCR扩增产物分析方法。

九、PCR扩增产物的直接测序 PCR技术在进行分子克隆和模板制备的大部分工作中显示了极大的优势。它不仅省略了通常制备DNA片段的烦琐步骤，也避免了使用亚克隆的经典程序。

5 PCR技术的发展

一、巢式PCR(Nested PCR，nPCR或N-PCR)

二、逆转录PCR(RT-PCR)

三、多重PCR

四、不对称PCR

五、反向PCR

六、增敏PCR

七、RNA的聚合酶链反应

八、锚定PCR