第三章细菌质粒

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优选现代微生物遗传学第三章质粒

中被淘汰
– 选择性抑制带有质粒的菌的生长。
– 2.原生质体消除法
• 使待消除质粒的菌株在一定条件下形成原生质体，在再生后生长的菌株中可出现高频率质粒消除菌。
• 二、遗传转移
– 将质粒导入已经消除了该质粒的原宿主细胞，比较导入前后表型性状的差异或恢复程度。
• 三、分子杂交
– 在初步确定某菌株可能含有质粒的情况下，利用已知表型性状的基因片段作探针进行分子杂交，来检测其菌株是否含有该种质粒。
第二节质粒编码的遗传表型
• 大多数质粒均控制着宿主细胞的一种或几种特殊性状，具有一定的表型，质粒可依据其表型不同可划分为以下几类： – 1.致育质粒 – 2.抗药性质粒 • 组成：转移区和抗性决定子 • 抗药的机制：改变抗生素作用的靶点；修饰抗生素；组织抗生素进入；产生一种酶能代替宿主细胞中被抗生素作用的靶点。
• 二、质粒的复制
– 1.质粒复制的方式(P120)
• 质粒的复制起点称为oriV,大肠杆菌为 oriC。
• 复制主要通过型复
制和滚环复制之一
进行。其中以型复
制为主（包括单向和双向）。
• 质粒只编码一种或少数几种与复制有关的蛋白质，其他复制蛋白都来自宿主。
– 2.复制起点区oriV的功能和pBR322质粒 • 复制起点区oriV 功能与质粒载体的构建、寄主范围
– 3.产生抗生素的质粒
• 细菌素：细菌产生的一般只能抑制或杀死种内不同亚种或菌株中敏感细菌的特殊多肽类代谢产物。
• Col质粒：10种，有非接合型和接合型之分。 – 4.产生毒性的质粒(BT) – 5.降解质粒：
• 假单胞菌属是一类能广泛利用有机化合物进行生长的细菌。其体内含有大量的降解质粒。

医学微生物学复习考试论述题答案

第一章微生物基本概念思考题1．从形态结构、培养特性和致病性上,比较原核细胞型微生物、真核细型微生物和非细胞型微生物(de)主要区别.（1）形态结构：原核细胞型微生物如细菌,只有原始核,由裸露(de)环状双链DNA构成,无核膜和核仁,细胞器很不完善,只有核糖体.真核细胞型微生物如真菌,细胞核分化程度高,有核膜和核仁,细胞器分化明显.非细胞型微生物如病毒,无典型(de)细胞结构,只能在活(de)易感细胞内生长繁殖.只有一种类型核酸（为DNA或RNA）.（2）培养特性：细菌和真菌能在人工合成培养基上生长,病毒不能在无生命培养基上生长,需采用鸡胚接种、动物接种和细胞培养方法培养.（3）致病性：细菌主要依靠侵袭力和内、外毒素致病.病毒可直接杀死宿主细胞,但主要是通过免疫病理损伤致病.第二章细菌(de)形态与结构思考题1．试比较革兰阳性菌和阴性菌细胞壁结构上(de)差异及其在致病性、抗原性、染色性和药物敏感性(de)意义.革兰阳性菌细胞壁由肽聚糖和穿插其中(de)磷壁酸组成,特点是肽聚糖含量高,结构致密,为三维立体网状结构.革兰阴性菌细胞壁中肽聚糖含量少,结构疏松,但具有由脂蛋白、脂质双层和脂多糖构成(de)外膜.（1）致病性：脂多糖由脂质A、核心多糖和O特异性多糖所构成,是细菌内毒素(de)主要成分.革兰阴性菌主要靠内毒素致病,而革兰阳性菌无内毒素,主要靠外毒素致病.（2）抗原性：磷壁酸是革兰阳性菌特有(de)成分,是重要(de)表面抗原.（3）药物敏感性：革兰阴性菌脂质双层上镶嵌有孔蛋白,可阻止一些抗菌药物如青霉素(de)进入,故绝大多数革兰阴性菌对青霉素不敏感,而大多数革兰阳性菌对青霉素敏感.（4）染色性：脱色时,革兰阳性菌肽聚糖结构更加致密,结晶紫不被脱出体外,菌体呈紫色.革兰阴性菌细胞壁主要成分是外膜,含大量脂质,可溶于乙醇,结构更为疏松,结晶紫易被脱出菌体外,故菌体最终呈红色.2．细菌(de)特殊结构有哪些各有何主要功能及医学意义细菌特殊结构主要包括荚膜、鞭毛、菌毛和芽胞.（1）荚膜：具有抗吞噬作用,并参与细菌生物被膜(de)形成,与细菌(de)致病性有关.（2）鞭毛：细菌(de)运动器官,有利于细菌主动地趋向高浓度营养物质和逃避有害环境,与某些细菌(de)致病性有关.可用于鉴定细菌.（3）菌毛：普通菌毛具有黏附能力,与细菌致病性有关；性菌毛可传递遗传物质,与细菌(de)毒力或耐药性转移等有关.（4）芽胞：对热、干燥、化学消毒剂、辐射等抵抗力极强,是细菌在不利环境下形成(de)休眠细胞,在适宜条件下可迅速发芽转化为繁殖体,应以杀灭细菌芽胞作为判断灭菌效果(de)指标.芽胞(de)形状、大小、位置等可用于鉴别细菌.3．细菌L型是怎样形成(de)有何特点和临床意义细菌Ｌ型是细胞壁缺陷型细菌.少数自发产生Ｌ型,多数诱导产生Ｌ型,主要诱导剂有溶菌酶和作用于细菌细胞壁(de)抗生素如青霉素.细菌Ｌ型因缺乏完整(de)细胞壁,不能维持其固有(de)形态,呈现高度多形性,大多为革兰染色阴性.在高渗、低琼脂、含血清(de)培养基中能缓慢生长,2～7天后形成“油煎蛋”状细小菌落.去除抑制物后,Ｌ型细菌可返祖而恢复成原来形态(de)细菌.Ｌ型本身可能不致病,其致病性与回复有关.此外,有些Ｌ型亦有一定(de)致病性,并可引起免疫病理损伤.因此,细菌Ｌ型与许多慢性反复发作(de)感染有关,在临床上可引起尿路感染、骨髓炎、心内膜炎等,并常在作用于细胞壁(de)抗生素治疗后发生,易复发.在临床上遇到症状明显而标本细菌分离培养为阴性者,应考虑Ｌ型感染(de)可能性.4．试述革兰染色法(de)步骤、结果判定和医学意义.革兰染色法是最常用、最重要(de)染色法,其步骤是：在细菌涂片固定后,先用结晶紫初染、芦戈碘液媒染、95%乙醇脱色,再用稀释复红或沙黄复染.菌体最终呈紫色者为革兰阳性菌,染成红色者为革兰阴性菌.革兰染色法在鉴别细菌、指导临床选用抗菌药物、了解细菌致病性等方面具有极其重要(de)意义.第三章细菌(de)生理思考题1．细菌分离培养和生化反应在感染性疾病诊断中有何意义为什么（1）感染性疾病(de)病原学诊断：由细菌引起(de)感染性疾病,最确切、最可靠(de)诊断依据（“金标准”）是,从患者标本中将病原菌分离培养出来,并鉴定其菌属、种和型.细菌(de)生化反应对菌体形态、革兰染色反应和菌落特征相同和相似(de)细菌(de)鉴定尤为重要.细菌药物敏感试验能指导临床选用抗菌药物治疗.（2）生物制品(de)制备：制备疫苗、类毒素、抗毒素等用于防治,制备菌液、抗血清等用于诊断.2．根据培养基(de)性质与用途,可将培养基分为几类培养基是人工配制(de)适合微生物生长繁殖或产生代谢产物(de)营养基质.按营养组成和用途,可分为基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基等；按物理性状分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基三大类.其中,平板固体培养基用作纯种细菌(de)分离；斜面固体培养基用于菌种(de)保存；液体培养基主要用于细菌(de)增菌；半固体培养基主要用于检查细菌(de)动力,即有无鞭毛.第四章消毒与灭菌思考题1．在防治疾病过程中,为什么强调医务人员一定要树立无菌观念和严格执行无菌操作从预防感染出发,医务工作者必须建立“处处有菌”和无菌观念,严格执行无菌操作,这就要求必须对所用(de)物品（如注射器、手术器械、手术衣等）、工作环境（如无菌操作室、手术室、产房等）和人体体表进行灭菌或消毒,以确保所用(de)物品和工作环境(de)无菌或处于无菌状态.为防止疾病(de)传播,对传染病患者(de)排泄物和实验废弃(de)培养物亦须进行灭菌或消毒处理.2．简述湿热灭菌法(de)杀菌机制和各种湿热灭菌法(de)特点和用途.热力灭菌(de)杀菌机制主要是,促使菌体蛋白质（酶）变性和凝固,失去生物活性而死亡.（1）巴氏消毒法：72℃ 15～30s,可杀灭液体中(de)病原微生物或特定微生物,用于牛奶和酒类等不耐高温物品(de)消毒.（2）煮沸法：100℃ 5min,常用于饮水、食具、注射器等消毒.（3）间歇灭菌法：100℃水蒸汽15～30 min,取出后置37℃培养过夜,次日再加热一次,如此连续3d,可达到灭菌目(de),用于不耐高温(de)含糖、牛奶或血清等培养基灭菌.（4）高压蒸汽灭菌法：在一定蒸汽压下,水蒸汽温度达到121．3℃,维持15～20 min,可杀死包括细菌芽胞在内(de)所有微生物.这是最有效和最常用(de)灭菌方法,常用于一般培养基、生理盐水、手术器械等耐高温、耐湿物品(de)灭菌.3．简述化学消毒剂(de)分类与常用化学消毒剂(de)主要用途.（1）使菌体蛋白质变性或凝固：红汞（皮肤黏膜、小创伤）、乙醇（皮肤、温度计）、重金属盐类如高锰酸钾（尿道、阴道冲洗）、甲醛（浸泡尸体）等.（2）破坏细菌(de)酶系统：双氧水（外耳道、口腔冲洗）、碘液（皮肤）、氯（饮用水）等.（3）改变细菌细胞壁或细胞膜(de)通透性：新洁尔灭（洗手）、肥皂（洗手）、醋酸（空气消毒）.第五章噬菌体思考题1．试述噬菌体感染细菌(de)可能结局.噬菌体侵入宿主菌后有两种结局：一是能在宿主细胞内复制增殖,产生子代噬菌体,并最终裂解细菌,释放出大量(de)子代噬菌体,这类噬菌体称为毒性噬菌体；二是噬菌体核酸整合到宿主菌染色体基因组中,随细菌DNA复制而复制,随细菌(de)分裂而传代,不产生子代噬菌体,也不引起细菌裂解,即为溶原状态,这类噬菌体称为温和噬菌体或溶原性噬菌体.2．为什么质粒、噬菌体和转座子可作为基因工程(de)重要载体噬菌体基因数量少,结构简单,容易获得大量(de)突变体,已成为分子生物学研究(de)重要工具.例如,利用λ噬菌体作为载体,构建基因文库；利用噬菌体展示技术,可将外源目(de)基因插入到噬菌体衣壳蛋白基因中,以融合蛋白形式表达在噬菌体表面,从而简化抗体库和单克隆抗体(de)筛选过程.第六章细菌(de)遗传与变异思考题1．试述细菌(de)生物学性状变异及其在医学实践中(de)意义.（1）耐药性突变：耐药菌产生、选择标记.（2）毒力突变：减毒活疫苗研制、新现传染病(de)产生.（3）营养缺陷体突变：新药诱变作用检测.（4）高产突变：抗生素等药品、食品生产.（5）抗原性突变：逃逸免疫机制.2．什么是质粒质粒DNA有哪些主要特征质粒是细菌染色体外(de)遗传物质,大多由闭合环状双链DNA组成.质粒DNA(de)特征：①具有自我复制(de)能力；②所携带(de)基因往往赋予宿主菌新(de)生物学性状（如F质粒、R质粒、毒性质粒、代谢质粒）,增加细菌在不利环境下(de)存活机会；③非生命活动所必需,可自行丢失或消除；④可在细菌之间转移.3．试述抗菌药物(de)作用机制和主要种类.临床应用(de)抗菌药物包括抗生素和化学合成抗菌药物.抗菌药物(de)作用机制主要有：（1）抑制细胞壁(de)合成：主要有：①β-内酰胺类如青霉素类、头孢菌素类等；②糖肽类如万古霉素.（2）干扰细菌核糖体(de)功能,抑制蛋白质(de)合成：主要有：①氨基糖苷类如链霉素；②四环素类如四环素、多西环素；③大环内酯类如红霉素.（3）抑制核酸(de)合成：主要有：①喹诺酮类如环丙沙星,可抑制DNA聚合酶,干扰DNA复制；②利福霉素类如利福平,抑制DNA依赖(de)RNA聚合酶,干扰mRNA(de)合成；③磺胺类药物如磺胺甲恶唑,竞争抑制核酸前体物质(de)合成.（4）影响细胞膜(de)功能：多黏菌素作用于革兰阴性杆菌(de)磷脂,使细胞膜受损,细胞质内容物漏出,引起细菌死亡.4．试述细菌产生耐药性(de)生化机制和遗传机制,并举例说明.如何防止细菌耐药性(de)产生和扩散（1）耐药(de)生化机制：①灭活作用：这是细菌产生耐药性(de)最重要方式.细菌被诱导产生灭活酶,通过修饰或水解作用破坏抗生素,使之失去活性；②靶位改变：通过产生诱导酶对抗生素(de)作用靶位进行化学修饰,或通过基因突变造成靶位变异,使抗菌药物不能与靶位结合,失去杀菌作用；③药物累积不足：通过减少药物吸收或增加药物排出,使菌体内(de)抗生素浓度明显降低,不足以杀死细菌.（2）耐药(de)遗传机制：①基因突变：由突变产生(de)耐药性一般只对一种或两种相类似(de)药物耐药,且比较稳定,突变频率较低；②R质粒接合转移：细菌(de)耐药性质粒（R质粒）可携带一种或多种耐药基因,主要通过接合方式在相同或不同种属细菌之间转移,造成耐药性(de)广泛传播；③转座：当转座子或整合子插入某一基因时,可因带入耐药基因而使细菌产生耐药性,并与多重耐药性(de)产生密切相关.此外,还有转化和转导等方式.为了提高抗菌药物(de)疗效,防止耐药菌株(de)出现和扩散,应合理、科学地使用抗菌药物.在使用抗生素前,除危重患者外,应根据细菌药物敏感试验结果,选用敏感(de)药物.联合用药必须有明确(de)指征,如病原体不明或单一抗菌药物不能控制(de)严重感染或混合感染.剂量要足,疗程要尽量缩短.5．试述细菌遗传物质(de)主要种类及其特点.（1）细菌染色体：为一条环状双链DNA,含核蛋白,但缺乏组蛋白,无核膜包围.有4000多个基因,遗传信息是连续(de),无内含子,功能相关(de)基因组成操纵子结构.（2）质粒：是染色体外(de)遗传物质,为环状闭合(de)双链DNA.（3）转座元件：是存在于细菌染色体或质粒上(de)特异性DNA片段,可在质粒与质粒之间或质粒与染色体之间随机转移.转座元件主要有插入序列和转座子.其中,转座子不能独立复制,必须依附在染色体或质粒上与之同时复制.在结构上分为中心序列和二个末端反向重复序列.中心序列带有遗传信息,如常带有一种或多种耐药基因.（4）整合子：是可移动(de)基因元件,由5＇端保守序列、中间(de)可变序列和3＇端保守序列组成,具有启动子、整合酶基因和位点特异性(de)重组表达系统,可识别和捕获外源基因和基因盒,尤其是抗生素耐药基因.6．试述微生物基因组序列测定(de)意义.（1）研究病原微生物(de)致病机制及其与宿主(de)相互关系：阐明病原微生物致病基因及其产物对于了解其致病机制至关重要.根据病原微生物(de)全基因序列,应用现代生物信息软件对基因序列进行分析,可以确定哪些基因与毒力有关,为研究细菌(de)致病性和毒力因子提供了有效(de)途径.（2）寻找更灵敏及特异(de)微生物分子标记,作为诊断、分型等依据：通过测定多种致病与非致病微生物(de)基因组序列,可以获得大量(de)基因信息.如特异DNA序列用于诊断,菌株特异性基因用于分型,特异性毒力基因用于判断疾病进展,耐药基因用于预测临床治疗效果等.（3）促进抗微生物新药(de)开发和新疫苗(de)发展：病原菌全基因组序列(de)测定一方面能揭示细菌耐药(de)确切机制,另一方面可找到对细菌生存必不可少并在感染过程中常优先表达(de)因子.选择这些因子作为抗菌药物(de)靶位点,可设计出具有很强针对性(de)药物.病原菌全基因组序列(de)测定还可大大加速新疫苗(de)研制.第七章细菌(de)感染和免疫思考题1．试述正常菌群转化为条件致病菌(de)条件.（1）宿主免疫防御功能下降：宿主先天或后天免疫功能缺陷,患有慢性消耗性疾病,烧伤或烫伤,接受放疗与化疗,使用激素或免疫抑制剂等,免疫防御能力普遍下降,成为免疫容忍性宿主,易发生机会性感染.（2）菌群失调：当较长期服用广谱抗生素,或抗生素使用不当时,可诱发菌群失调,体内原本处于劣势(de)机会致病菌（耐药菌）则趁机大量繁殖,成为优势菌,引起疾病.（3）定位转移：正常微生物群在其原籍生境通常是不致病(de),如果转移到外籍生境或无菌部位,则可能致病.2．试述细菌致病(de)物质基础.物质基础包括菌体表面结构、侵袭性酶类和内外毒素等.例如,鞭毛运动逃离不利环境；菌毛黏附作用,避免被排除体外；荚膜抗吞噬作用.透明质酸、链激酶、链道酶有利于链球菌在组织或血液中扩散.尿素酶有利于幽门螺杆菌创造适合生长(de)中性微环境.内毒素引起发热反应、内毒素休克、DIC 等.外毒素引起特殊临床病变.3．试比较内毒素与外毒素(de)主要区别.细菌内毒素与外毒素(de)主要区别区别要点外毒素内毒素产生菌存在革兰阳性菌与部分革兰阴性菌由活菌分泌,少数细菌死革兰阴性菌细菌死亡裂解后才释放脂多糖.主要毒性组分是部位化学组成稳定性毒性作用抗原性亡后释放出蛋白质.大多为A-B型毒素多不耐热（60～80℃30min被破坏）强,对组织器官有选择性毒性作用,引起特殊(de)临床病变强,刺激机体产生抗毒素,可被甲醛脱毒形成类毒素脂质A耐热（160℃ 2～4h才被破坏）弱,毒性作用大致相同,有发热反应、内毒素血症、内毒素休克和DIC等弱,刺激机体产生(de)中和抗体作用弱,不被甲醛脱毒形成类毒素4．以破伤风梭菌和伤寒沙门菌为例,试述影响感染过程发生与发展(de)主要因素.致病菌侵入宿主能否致病,主要取决于细菌(de)毒力、侵入数量、侵入部位和机体免疫力(de)强弱.（1）毒力：破伤风梭菌靠破伤风痉挛毒素致病.伤寒沙门菌具有菌毛、Vi抗原、内毒素.（2）侵入数量：破伤风痉挛毒素毒性仅次于肉毒毒素.（3）侵入部位：破伤风梭菌需有厌氧微环境.伤寒沙门菌通过粪-口途径传播.（4）宿主免疫力：破伤风愈后免疫力不持久,伤寒愈后可获得终身免疫.5．试述病原菌抵抗宿主免疫防御机制(de)主要策略.（1）抗吞噬和消化作用：有些致病菌能引起吞噬细胞凋亡.有些致病菌（如肺炎链球菌）具有荚膜,可抵抗吞噬细胞(de)吞噬作用.金黄色葡萄球菌凝固酶能使血浆中(de)液态纤维蛋白原变成固态(de)纤维蛋白,沉积于菌体表面,阻碍吞噬细胞(de)吞噬.有些胞内菌虽被吞噬细胞吞噬,但能抵抗杀伤作用,在吞噬细胞中生存和繁殖.（2）产生IgA蛋白酶：流感嗜血杆菌能产生IgA蛋白酶,水解宿主黏膜表面(de)SIgA,降低其免疫防御机能,增强致病菌在黏膜上皮细胞黏附与生存能力.（3）抗原变异：通过修饰菌体表面抗原,可协助致病菌逃避宿主特异性免疫应答.（4）干扰补体活性：某些致病菌能抑制补体活化或灭活补体活性片段,抵抗补体(de)溶菌、调理及趋化作用.6．什么是内源性感染为什么目前内源性感染有逐渐增多(de)趋势内源性感染是指病原体来自患者体内或体表(de)感染,大多为机会性致病菌,少数是以潜伏于体内(de)致病菌.机会性致病菌大多来自患者自身,亦可来自其他住院患者、医务人员或医院环境.近年来,由于免疫容忍性宿主(de)增加和抗菌药物与介入性诊治手段(de)广泛应用,机会性致病菌所致内源性感染呈不断上升趋势,已成为二重感染(de)主要病原菌.7．试述医院感染病原菌(de)主要特点.引起医院感染(de)常见病原体具有以下微生态学特点：（1）大多为机会致病菌：病原体主要是患者体内(de)毒力较低(de)、甚至是无致病力(de)机会致病性微生物,如凝固酶阴性葡萄球菌、大肠埃希菌、白假丝酵母菌等,以及来自医院环境中(de)非致病性微生物.（2）具有耐药性：由于在医院环境内长期接触大量抗生素,医院内耐药菌(de)检出率远比社区高,尤其是多重耐药菌株(de)出现,使许多抗生素失效.（3）具有特殊(de)适应性：一些细菌在获得耐药性质粒(de)同时,也可能获得侵袭力及毒素基因,从而增强其毒力,更容易攻击免疫力低下(de)宿主.表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌等具有黏附于插（导）管、人工瓣膜等医用材料表面(de)能力,可形成生物被膜,增强对抗生素、消毒剂和机体免疫细胞及免疫分子(de)抵抗能力.8．试述二重感染产生(de)原因和防治措施.二重感染是指在抗菌药物治疗原感染性疾病过程中,造成体内菌群失调而产生(de)一种新感染.在正常情况下,宿主正常菌群之间相互依存、相互制约而维持动态平衡.但是,当较长期或大量服用抗生素,尤其是广谱抗生素时,宿主正常菌群中(de)敏感菌株大部分被抑制,来自医院环境(de)或体内原本处于劣势(de)耐药菌则趁机侵入和大量繁殖,成为优势菌,引起疾病.例如,抗生素使用不当时,可破坏肠道内微生态平衡,寄居在肠道(de)艰难梭菌趁机迅速生长繁殖,释放大量(de)外毒素A和B,引起假膜性肠炎.若发生二重感染,除立即停用正在使用(de)抗菌药物外,需对临床标本中优势菌类进行药敏试验,以选用敏感药物治疗.同时,亦可使用微生态制剂,如双歧杆菌、乳杆菌等益生菌,协助调整菌群类型和数量,加快恢复微生态平衡.9．试述外毒素(de)主要种类和作用特点.根据作用机制和所致临床病理特征(de)不同,外毒素可分为神经毒素、细胞毒素和肠毒素三大类.①神经毒素：通过抑制神经元释放神经介质,引起神经传导功能异常；②细胞毒素：通过作用于靶细胞(de)某种酶或细胞器,致使细胞功能异常而死亡,引起相应组织器官炎症和坏死等；③肠毒素：可引起胃肠道各种炎症、呕吐、水样腹泻、出血性腹泻等症状.根据作用部位(de)不同,外毒素可分为膜表面作用毒素、膜损伤毒素和细胞内酶活性毒素.根据肽链分子结构特点,外毒素又可分为两大类：①A-B 型毒素：是由两种不同功能(de)肽链构成完整毒素；②单肽链毒素：主要包括膜损伤毒素和磷脂酶类毒素.10．具有超抗原性质(de)细菌毒素有哪些有何生物学作用具有超抗原性质(de)主要有葡萄球菌肠毒素A～E、毒性休克综合征毒素-1、链球菌致热外毒素A～C、链球菌M蛋白、铜绿假单胞菌外毒素A等.细菌毒素性超抗原作为一类强大(de)免疫激活因子,生物学效应主要有：①对免疫系统(de)直接效应：SAg可超常量地激活T细胞.由于T细胞被大量激活后,随之出现凋亡,T细胞数量骤减,必然使宿主免疫功能下降,继发免疫抑制.此外,SAg 还可能大量激活B细胞,使之分化为浆细胞,产生自身抗体,引起自身免疫.例如,毒性休克综合征患者常伴有关节炎等；②由细胞因子介导(de)间接效应：SAg超常量激活T细胞和MHC分子表达细胞,使之分泌过量(de)细胞因子,尤其是IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ等,导致免疫功能严重紊乱,往往对机体产生毒性效应,与毒性休克样综合征、食物中毒、链球菌性肾小球肾炎、猩红热等密切相关.11．试述抗细菌感染(de)免疫特点.吞噬细胞（中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞）是杀灭和清除胞外菌(de)主要力量,黏膜免疫和体液免疫是抗胞外菌感染(de)主要免疫机制.特异性抗体(de)作用有：阻断致病菌黏附与定植、中和外毒素、调理作用、激活补体等.体液免疫对胞内菌感染作用不大,主要依靠以T细胞为主(de)细胞免疫,主要包括CD4＋Th1细胞和CTL.12．试述医院感染(de)危险因素和防治措施.患者绝大多数是婴幼儿和老年人.婴幼儿由于免疫器官尚未发育完善,免疫功能处于未完全成熟状态.老年人免疫水平随着寿命(de)延长却相应地呈下降趋势,并可能患有免疫受损(de)基础性疾病,对微生物感染(de)抵抗力较青年人和中年人低.因此,婴幼儿和老年人较易发生医院感染.现代医疗手段(de)应用,如接受激素、免疫抑制剂、化疗和放疗,以及介入性诊治手段,使医院患者免疫防御功能受损(de)机会增加,受到机会致病菌感染(de)机会亦相应增加,尤其是抗菌药物(de)不合理应用,可导致微生态失调而出现二重感染.对医院感染发病情况实施全方位(de)监测,认识医院感染现状及其特点,是制定控制与管理医院感染规划和措施(de)依据.控制医院感染(de)关键措施是清洁、消毒、无菌技术、隔离、净化、合理使用抗生素、尽量减少侵袭性操作、一次性使用医用器具、监测和通过监测进行效果评价.其中,手部卫生如洗手最为重要,是阻断医护人员经操作导致在患者之间传播疾病(de)关键环节,手部卫生“达标”可明显减少医院感染(de)发生.第八章细菌感染(de)检查方法与防治原则。

微生物学重点总结(3篇)

微生物学重点总结微生物学第一章绪论1、微生物学。

一般定义为研究肉眼难以看见的称之为微生物的生命活动的科学。

2、微生物的发现。

第一个看见并描述微生物的人是荷兰商人安东列文虎克。

3、微生物学发展的奠基者及其贡献法国的巴斯德。

1>彻底否定了“自生说”；2>免疫学—预防接种；3>证实发酵是由微生物引起；4>创立巴斯德消毒法。

德国的科赫。

1>证实了____病菌是____病的病原菌；2>发现肺炎结核病的病原菌；3>提出证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则—科赫原则。

4、微生物的特点：个体小、结构简、胃口大、食谱广、繁殖快、易培养、数量大、分布广、种类多、变异易、抗性强。

第二章微生物的纯培养和显微技术1、无菌技术。

在分离、转接、及培养纯培养物时防止被其他微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术。

2、菌落。

分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。

3、选择培养。

选择平板培养、富集培养。

4、古生菌。

是一个在进化途径上很早就与真细胞和真核生物相互独立的生物类群。

主要包括一些独特的生态类型的原核生物。

5、真菌。

霉菌（菌体由分枝或不分枝的菌丝构成）、酵母菌（一群单细胞真核微生物）。

6、用固体培养基获得微生物纯培养方法：1>涂布平板法：（菌落通常只在平板表面生长）将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在已倒好的平板表面，再用无菌涂布棒涂布均匀，经培养后挑取单个菌落。

特点：使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀。

2>稀释倒平板法：（细菌菌落出现在平板表面及内部）取一定稀释度的样品与熔化的琼脂培养基混合，摇匀后倒入无菌培养皿中保温培养。

缺点：操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好。

3>平板划线法4>稀释摇管法第三章微生物细胞的结构和功能1、原核生物与真核生物的异同点：原核微生物真核微生物细胞壁除少数外都有肽聚糖无肽聚糖细胞膜一般无固醇常有固醇内膜简单，有间体复杂，有内质网等细胞器只有核糖体有很多种核糖体70s（50s＋30s）80s（60s＋40s）线粒体叶绿体中的70s细胞核拟核，无核膜、无核仁，无成有核膜、核仁，有多条染色体，dna与形染色体，dna不与rna和组rna和组蛋白结合，有有丝分裂蛋白结合，无有丝分裂大小直径通常小于2微米直径在2-100微米之间2、革兰氏阴阳性菌的特点。

人教版高中生物选修3 1.1百科名片：质粒

质粒科技名词定义中文名称：质粒英文名称：plasmid定义1：细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。

现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具。

所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）定义2：独立于染色体之外的、能自主复制的双链环状脱氧核糖核酸物质。

所属学科：水产学（一级学科）；水产生物育种学（二级学科）定义3：细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子。

能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。

现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具。

所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）定义4：细菌细胞内能在染色体外独立复制的遗传因子。

所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）质粒在细胞内的复制质粒在细胞内的复制一般有两种类型：紧密控制型（Stringent control ）和松弛控制型（Relaxed control）。

前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子，如F 因子。

后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝一般在20个以上，如Col E1质粒。

在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA 复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。

利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。

现代微生物遗传学第三章质粒

• 一、质粒的发现
– F质粒(1946年)，第一个被发现的质粒
– 20世纪50-70年代：抗性质粒的大量研究，以及其他质粒的发现
– 20世纪70年代后，质粒广泛应用于遗传工程和分子生物学研究中。
• 二、质粒的命名原则
– 最初发现的质粒由研究者根据表型、大小等特征自行命名。(F因子、R质粒、Col质粒等)
• pBR322质粒：pMB1的ori和rop（ROP蛋白对质粒的复
制负调控）区；pSC101的tetr；Tn3的ampr。属中等拷贝质粒，10~30个/细胞 • pUC类：高拷贝质粒（100~300个/细胞），也是pMB1
的ori，但是没有rop。
• 质粒的寄主范围和质粒的拷贝数均决定
于质粒的ori区域。
• 四、质粒的分离、检测与纯化
– 质粒分离方法：碱变性法
• 菌体的培养和收集
• 溶菌
• 碱变性处理
• 离心分离
• 有时为了快速提取质粒DNA，可以在提取液碱变性后，用pH4.8的醋酸钠高盐缓冲液调节pH到中性，这时染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，而即使变性的质粒可以恢复到原来的构型，再通过离心，这样可以缩短提取质粒的时间。
第一节质粒的发现和命名
• 质粒： – 存在于细菌、真菌等微生物细胞中、独立于染色体外、能进行自我复制的遗传因子。 – 对于宿主，一般是非必需的 – 通常是共价(covalent)、闭合(closed)、环状(circular) 双链DNA.(但也有例外：线状DNA，RNA)
• 附加体：整合在染色体上，或游离，并能携带宿主的染色体基因。
• 二、质粒的复制
– 1.质粒复制的方式(P120)
• 质粒的复制起点称为oriV,大肠杆菌为 oriC。

绪论、第1章、第3章：《微生物学》复习题

《微生物学》复习题绪论第一章原核生物的形态、构造和功能第三章病毒和亚病毒一、名词解释微生物、微生物化、模式微生物、微生物多样性、细菌、古生菌、L细菌、伴孢晶体、菌落、放线菌、静息孢子、病毒、基本培养基、最适生长温度、巴氏消毒法、细菌质粒、温和噬菌体、前噬菌体、病毒包涵体、噬菌体、阮病毒、周质空间、溶原性细菌、噬菌斑生成单位、一步生长曲线、糖被。

二、填空题1.微生物是一切生物的总称，其特点是、和。

2.微生物主要有三大类群：①类的、、、、、；②类的、、；③类的和。

3.人类对微生物的发现和认识，比对动植物晚得多，其原因是微生物具有、、和四个特点。

4.被誉为微生物学先驱者的是世纪、国的，因为他最早利用见到了。

5.在微生物促进人类医疗保健事业发展过程中，曾发生过“六大战役”，即，，，，，。

6.微生物学为现代生命科学提供的有：，，，，，，，，。

7.微生物的五大共性是，，，和，其中最主要的共性应是。

8.微生物代谢类型的多样性表现在：，，，，，，。

9.细菌的形态主要有状、状和三种，此外，还有少数状和状等。

10.细菌细胞的一般构造有、、、、、和等，而特殊构造则有、、、和等。

11.磷壁酸是革兰氏性细菌细胞壁上的特有成分，主要成分为或。

12.G+细菌细胞壁的特有成分是，G-细菌的则是。

13.古生菌细胞壁的成分与真细菌不同，它们无肽聚糖，只含有、或。

14.在自然界和实验室中可以找到四类缺壁细菌，包括、、和。

15.细菌细胞的内含物有、、和四类。

16.在没有显微镜的条件下，通过观察生长在上的形状或生长在上的现象，可推测某细菌可能长有鞭毛。

17.菌毛多见于革兰氏性致病菌中，它具有功能，如引起严重性病的细菌，它的菌毛可粘附于人体的上。

18.芽胞除了可长期休眠外，还是生命世界中抗逆性最强的生命体，例如抗、抗和抗等。

19.蓝细菌是一类、、和的大型原核生物。

20.能在人工培养基上生长的最小的一类微生物是。

21.根据进化水平和形态构造等特征上的明显差别，可把微生物分成三大类群，即、和。

关于细菌质粒的实验

一细菌细菌是我们用来扩增质粒的宿主。

原因有两个方面：1 细菌的增殖速率极快，可以快速的放大我们的质粒拷贝数；2 细菌体内有严格的DNA合成保真能力，能够确保质粒被忠实的复制。

但是，细菌体内有严格的限制-修饰系统，对有些质粒会有修饰甚至切割的作用。

所以对于有些特殊的质粒，一般会说明哪种细菌适合作它们的宿主。

目前我们用的最多是DH5α，JM109。

我们实验室目前有的是DH5α。

我们用到的Pcdna3,T载体都是可以用DH5α作为宿主。

DH5α是以LB培基作为培养液。

LB培基可以在分子克隆上查到配方。

以后你要是用到其他的细菌时，可能会有不同的培养液。

二培养基细菌培养基，目前我们用的最多的是两种形式，一种是液体培基，一种是固体培基。

两种培基的用途不同。

所谓的固体培基是在液体培基中加入琼脂（英文agar）（切记不是琼脂糖agarose）,每一升液体培基里加入15g琼脂。

之后高压灭菌，琼脂与液体培基熔为一体，之后铺板。

具体操作可以在以后做的时候再说。

两种形式的培基用途在后面会说道。

三质粒我只用过质粒，病毒我没有用过，就不说了。

这方面的资料很多，你可以有空看看。

我们用的质粒主要是两大类：1 测序用的质粒，如最常用的T载体；2 表达载体。

表达载体又可分为两类，一是蛋白表达载体，一是RNA表达载体。

蛋白表达载体是用来在细胞内表达目的蛋白用的，RNA表达载体不是太清楚，但是用作RNAi的载体是属于RNA表达载体的。

我们这边的蛋白表达载体是p CDNA 3 .质粒根据在细菌体内的拷贝数分类可以分为严谨型和松弛型。

这两者的区别你可以不必太在意，如果你想知道可以在书上查到。

对于我们运用过程中，主要涉及到我们用的抗生素的浓度不同罢了。

这里还涉及到质粒不相容性的原理，我在这里稍微提一下，以后如果你要做共转染的时候可能要考虑到。

我们知道，质粒是分派系的，就是说往往一类质粒有一个共同的模板，然后在这个模板的基础上进行修饰，从而得到的一个系列。

现代微生物遗传学-第三章质粒课件

质粒在生物能源开发中的应用
要点一
总结词
要点二
详细描述
质粒在生物能源开发中具有重要作用，可以用于构建高效生物燃料生产菌株。
质粒可以携带与生物燃料生产相关的基因，将其转移至微生物中，从而构建出能够高效生产生物燃料的菌株。例如，可以利用质粒将油脂合成酶基因转移至酵母菌中，构建出能够高效生产生物柴油的菌株。此外，质粒还可以用于提高微生物对光能的利用率，从而构建出能够高效生产太阳能的微生物。因此，质粒在生物能源开发中具有重要作用。
详细描述
20世纪60年代，科学家们开始对质粒进行更深入的研究，探索其复制机制和遗传特性。他们发现质粒可以在细菌细胞内独立于染色体复制，并且可以在不同细菌之间转移和遗传。这些发现为后来的基因工程和分子生物学研究奠定了基础。
质粒的遗传学研究
总结词
质粒的遗传学研究涉及到多个方面，包括质粒的复制、转录、表达以及质粒与宿主细胞的相互关系等。
代谢能力
质粒携带的基因可以影响细菌的代谢能力，帮助细菌在特定环境下生存和繁殖。
质粒与细菌的进化
基因水平转移
质粒是细菌间基因水平转移的主要载体，有助于细菌获得新的遗传物质和进化。
协同进化
质粒上的基因与其他细菌基因协同进化，形成复杂的基因网络，影响细菌的进化方向。
适应性进化
质粒携带的基因可以促进细菌的适应性进化，使其更好地适应不断变化的环境。
终止子的作用
终止子是一个特殊的DNA序列，它能够终止复制子的复制，确保质粒的复制不会无限进行下去。
质粒的复制
复制的起始
复制的调控
质粒的复制起始于复制起始位点，该位点通常是一个特定的DNA序列，能够被质粒编码的复制蛋白识别并与之结合。

细菌质粒的结构和功能特点

细菌质粒的结构和功能特点
细菌质粒(细菌 DNA 颗粒)是细菌中一种重要的细胞器,其主要
功能是在细胞内复制和传递遗传信息。

细菌质粒由DNA和蛋白质组成,其中DNA是主要的遗传物质。

以下是细菌质粒的结构和功能特点:
1. 结构:细菌质粒通常由外壳、内质和核仁组成。

外壳是由DNA 和蛋白质组成的复杂分子,包裹在核糖体(细菌细胞分泌的细胞器)中,用于将DNA输送到新细胞中。

内质则是质粒的主要组成部分,由DNA、RNA、蛋白质和脂类等分子组成。

核仁是在细菌核内的一个小圆形区域,包含DNA聚合酶和核糖体,是质粒复制和传递的主要场所。

2. 功能:细菌质粒的主要功能是将细菌的DNA复制到新细胞中,并将DNA传递给新的细胞。

质粒还可以通过调节细菌的生长和死亡来实现复杂的生物学过程。

质粒还可以用于合成新的蛋白质和调节细胞信号转导等生物学功能。

3. 多样性:细菌质粒的结构、功能和种类的多样性是细菌进化和生物多样性的重要组成部分。

不同类型的细菌质粒具有不同的结构、功能和基因表达模式,它们之间可以相互转化和转移。

细菌质粒是细菌细胞实现遗传多样性和适应环境变化的重要细
胞器。

质粒plasmPPT课件

质粒DNA的复制过程
RNAⅠ是复制的负调节物 RNAⅠ可以通过同RNAⅡ结合，以阻止其与模板DNA发生杂交作用。
➢colE1复制子不能影响质粒复制所必需的宿主酶的活性，因此，一旦DNA合成启动后，便不能改变其速度或进程。故而拷贝数的控制必须在DNA复制启动时或启动前进行。
➢质粒DNA的合成依赖于复制起点处稳定的DNA-RNA II 杂交体的形成。正常情况下，复制的起始是由正确折叠与不当折叠的RNA II间相互转化的平衡来控制的，前者可形成稳定的杂交体，后者则不能。
质粒对宿主细胞是非必需的，但在某些条件下，质粒能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长的优势。
如抗药性质粒和降解性质粒就能使宿主细胞在有相应药物或化学毒物的环境中生存。
质粒也像染色体一样携带编码多种遗传性状的基因，并授予宿主细胞一定的遗传特性，许多与医学、农业、工业和环境密切相关的重要细菌的特殊特征便是由质粒编码的，如植物结瘤、固氮、对有机物的代谢等。
1）ColE1质粒的复制调控
ColE1为6.6kb的小质粒，拷贝数10~20。其复制不需任何质粒编码的蛋白质，而是完全依赖于宿主提供的寿命较长的酶和蛋白质，包括分子伴侣、DNA聚合酶I和Ⅲ, DNA依赖的RNA聚合酶、核糖核酸酶H (RNase H), DNA促旋酶和拓扑异构酶I。
ColE1质粒DNA的复制，是从一个特定的复制起点 oriV开始，并单向进行。控制此种质粒DNA复制启动的两种关键因素RNAI和RNAⅡ，以及另一种负调控因子 Rop蛋白，都是由ColE1 DNA转录产生的。
相反，RP4、RK2和RSFl010及从G+细菌中分离的滚环复制的质粒都属于广寄主范围(broad host range)质粒。广寄主范围的质粒一般能编码与复制起始有关的所有蛋白，这样就不依赖于寄主的功能。

微生物学复习笔记重点：细菌质粒简介

微生物学复习笔记重点：细菌质粒简介细菌的质粒介绍：细菌的DNA除大部分集中于核质(染色体)内，尚有少部分(约1～2%)存在于染色体外，称为质粒。

质粒与染色体的相似处为：质粒亦为双链环形DNA，不过其分子量远比染色体为小，仅为细菌染色体DNA的0.5～3%.质粒亦可携带遗传信息，可决定细菌的一些生物学特性。

然而质粒却有一些与染色体DNA不同的特性。

1.质粒：并非细菌生存所必不可少的遗传物质。

细菌如失去染色体，则不能生存;然而细菌失去质粒后仍能生存。

这是由于染色体DNA携带的基因所编码的产物，在细菌新陈代谢中是生存所必须者;而质粒携带的基因所编码的产物并非细菌的生存所必须者。

因此质粒可以在细菌间传递与丢失。

2.质粒的传递(转移)：是细菌遗传物质转移的一个重要方式。

有些质粒本身即具有转移装置，如耐药性质粒(R质粒);而有些质粒本身无转移装置，需要通过媒介(如噬菌体)转移或随有转移装置的质粒一起转移。

获得质粒的细菌可随之而获得一些生物学特性，如耐药性或产生细菌素的能力等。

3.质粒可自行失去或经人工处理而消失。

在细菌培养传代过程中，有些质粒可自行从宿主细菌中失去。

这种丢失不像染色体突变发生率很低，而是较易发生。

用紫外线、吖啶类染料及其他可以作用于DNA的物理、化学因子处理后，可以使一部分质粒消失，称为消除。

目前学者们感兴趣的是如何通过人工处理消除耐药质粒或与致病性有关的质粒。

4.质粒可以独立复制。

质粒为DNA，有复制的能力，质粒的复制可不依赖于染色体，而在细菌胞浆内进行。

这一特性在基因工程中需扩增质粒时很有用处，因可使细菌停止繁殖而质粒仍可继续复制，从而可获得大量的质粒。

5.可有几种质粒同时共存在于一个细菌内。

因质粒可独立复制，又能转移入细菌和自然失去，因此就有机会出现几种质粒的共存。

但是并非任何质粒均可共存，因发现在有些情况下，两种以上的质粒能稳定地共存于一个菌体内，而有些质粒则不能共存。

1。

细菌质粒提取原理及步骤

细菌质粒提取原理及步骤质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。

2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA的纯化。

（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。

现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。

此时，不必造反性地扩增质粒DNA。

然而，较长一代的载体(如pB R322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。

氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。

这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。

多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。

（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。

选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。

尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。

1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。

将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。

这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。

细菌质粒小量抽提及酶切

(７．加入等体积酚/氯仿（１：１），振荡混匀，12000g 4 ℃离心２分钟。取上清移至另１个Eppendorf管中。) ８．加入２倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分钟。９．１２０００g ,4 ℃离心５分钟。１０．弃上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，１２000g 于4 ℃离心２分钟。１１．弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。１２．加入50μl TE（含20μg/ml RNA 酶，不含DNA酶）溶解DNA。
本实验目的
本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法。
分离质粒DNA方法
从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的碱变性法；煮沸法； SDS法；羟基磷灰石层析法等各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切, 连接与转化。

三．实验方法

１．挑取琼脂培养板上的单菌落至5ml LB培养液中（含AmP 50μg/ml），３７℃强烈摇荡过度。２．取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心30秒，弃上清，用１ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀。３．将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀，冰上放置5分钟。４．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒５次以混匀内容物，冰上放置5分钟。５．加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟。６．12000g 4 ℃离心５分钟，取上清移到１个新的 Eppendorf管中。
2.严紧型质粒
严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，

细菌质粒DNA的制备

细菌质粒DNA的制备一、目的要求掌握平板法分离单菌落、细菌质粒DNA的提取方法（碱裂解法）、菌株的保存和复苏，掌握紫外分光光度法测定DNA含量的方法，掌握DNA电泳方法。

二、基本原理质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，为双链闭合环状DNA分子，具有自主复制和转录能力，可表达他携带的遗传信息。

质粒在细胞内的复制一般分为严紧型和松弛型两种。

前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，每个细胞内只含有1或几个拷贝。

后者在整个细胞周期中随时可以复制，在细胞里为多拷贝。

基因工程操作中所用的载体质粒均为松弛型质粒。

所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。

采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁（G-菌多无需此步骤）。

在pH 12.0～12.6 碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA 变性分开，而共价闭环的质粒DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。

将pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA 、大分子量的RNA 和蛋白质在去污剂SDS 的作用下形成沉淀，而质粒DNA 仍然为可溶状态。

通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA 、RNA 及蛋白质，质粒DNA 尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA 。

琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法之一。

琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，将其熔化在所需缓冲液中使成清澈、透明的溶液，然后倒入胶模令其固化。

不同浓度的琼脂糖形成的固体基质具有不同的密度（或孔隙度），因此适宜分离不同大小的DNA片段。

在电场中，DNA分子主要因其分子大小不同而被分离。

在pH 值为8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。

采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。

质粒的基本知识

质粒质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。

现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。

在基因工程中质粒常被用做基因的载体。

目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA 分子(简称cccDNA)。

细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。

根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。

每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。

按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。

一般分子量较大的质粒属严紧型。

分子量较小的质粒属松弛型。

质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。

在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。

人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。

常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。

pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。

如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。

但是如果将DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或Sal I切点，就会使抗四环素基因失活。

这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。

没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。

细菌质粒提取原理及步骤

质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。

2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA的纯化。

现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。

此时，不必造反性地扩增质粒DNA。

氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。

这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。

多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。

选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。

尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。

1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。

将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。

这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。

第三章质粒的分子生物学与质粒载体(精)

12．pBR322可以用于黏性末端连接、平末端连接和同聚物接尾法连接，无论用哪种方法连接，都可以用同一种酶回收外源片段。
13．所谓穿梭质粒载体是能够在两种以上的不同宿主细胞中复制的质粒，所用的复制起点不同。
14．一般情况下，质粒既可以整合到染色体上，也可以独立存在。
15．ColEl是惟一用作基因工程的自然质粒载体，它具有四环素抗性标记，因而很容易选择。
2．列举质粒载体必须具备的4个基本特性。
3．什么叫穿梭载体?
4．说明减少质粒和噬菌体载体上某种酶的识别位点的方法和原理。
5．虽然质粒的带动转移给质粒载体的安全性带来一定的困难，但是通过带动转移将质粒转移到特定的受体菌中也是基因工程中常用的实验技术。请举一例说明之。
6．为什么来自HfrⅹF-的重组体几乎总是F-?
7．解释为什么不同的Hfr菌株具有不同的转移起点和方向?
8．怎样从一个E．coli的Hfr菌株中分离到一个F′gal+的菌株?
9．你已经分离了一个新的F因子，怎样用最简便的方法知道最初的F因子的部分DNA已经被切除，并被一个外源DNA(也就是细菌DNA)所替代?
10．你能用哪一种基因转移的方法确定
(1)Kcoli染色体上一个新发现的基因座在其染色体上的位置；
(c)一般没有选择标记(d)上述(a)、(b)两项正确
7．ColEl是惟一用作基因工程载体的自然质粒，这种质粒：( )
(a)是松弛复制型(b)具有四环素抗性
(c)能被氯霉素扩增(d)能产生肠杆菌素
8．同一种质粒DNA，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是：( )
(a)OC DNA>SC DNP>LDNA (b)SC DNA>L DNA>OC DNA